本發明涉及巨大側耳菌種的檢測,具體來說,涉及一種巨大側耳pg46菌種的ssr標記指紋圖譜及其構建方法與應用。
背景技術:
1、巨大側耳(pleurotus?giganteus(berk.)karun.&k.d.hyde),是國內開發的一種珍稀食用菌,其口感和風味獨特,有豬肚般的滑膩,因而其商品名為“豬肚菇”。巨大側耳營養豐富,富含多糖、蛋白質、粗纖維等營養物質,并且具有抗炎、抗腫瘤、抗真菌、保護肝臟等多種藥用功效,深受消費者喜愛,具有較高的潛在市場價值。巨大側耳的環境適應性強、栽培技術簡單、生物學轉化率高,逐步引起食用菌生產者的重視,目前已在多個省市栽培,栽培規模不斷擴大。研究發現,野生巨大側耳多于夏末秋初的炎熱季節出現,主要分布于中國熱區,以及東南亞和大洋洲等熱帶及亞熱帶地區。生物學特性試驗也表明,巨大側耳不僅菌絲階段耐高溫(35℃),原基階段也不需要嚴格的低溫刺激,子實體也適宜在氣溫較高的夏季出菇(23-32℃)。巨大側耳典型的耐高溫特性,對于解決食用菌生產淡季和調節市場供應很有意義,特別是為熱區的食用菌產業發展提供了新機遇。
2、然而,隨著巨大側耳產業的不斷發展,巨大側耳生產用種“同物異名,同名異物”的問題日益突出。在國內收集20株巨大側耳菌株研究發現僅有7株具有不同的遺傳背景,其他菌株均為同物異名。這一問題不僅損害了巨大側耳育種者的知識產權,更為生產者造成了極大地風險,為巨大側耳產業的進一步發展造成了隱患。為保障育種者的權益和降低生產者的風險,促進我國巨大側耳產業健康、穩定和可持續發展,建立一種簡便、快速、可靠的巨大側耳菌種特異性鑒定技術迫在眉睫。
3、隨著分子生物學的快速發展,dna測序技術的不斷成熟,高通量測序的成本也在降低。dna分子標記技術能夠從基因水平上檢測巨大側耳菌種的遺傳特異性,巨大側耳全基因組測序的完成為ssr標記的開發提供了便利。ssr分子標記是一種基于高通量測序技術的應用,降低了ssr標記開發的成本,適用于巨大側耳全基因組測序分子標記的開發。ssr標記具有數量豐富、準確性高、穩定性好、快捷簡便等優點,不僅用于分子標記輔助育種,而且也可用于巨大側耳菌株鑒定。
技術實現思路
1、針對相關技術中的問題,本發明提出一種巨大側耳pg46菌種的ssr標記指紋圖譜及其構建方法與應用,該指紋圖譜與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比,具有檢測時間短,準確性高,重復性好的優點。
2、為此,本發明采用的具體技術方案如下:
3、根據本發明的一個方面,提供了一種巨大側耳pg46菌種的ssr標記指紋圖譜,該指紋圖譜由10對ssr標記組成,是基于巨大側耳全基因組開發的ssr標記引物,擴增帶型好,重復性高,標記引物詳細信息如表1:
4、表1ssr標記引物詳細信息列表
5、
6、根據本發明的另一個方面,提供了一種巨大側耳pg46菌種的ssr標記指紋圖譜的構建方法,包括:
7、s1、菌絲培養:將巨大側耳菌種轉接到裝有20ml的pda培養基的平板上,28℃恒溫暗培養,7天后收集菌絲;
8、s2、基因組dna的提取:利用植物基因組dna提取試劑盒提取所述菌絲的基因組dna,通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計法檢測基因組dna的濃度和純度,并調整樣品dna的濃度為20-30ng/μl;
9、s3、ssr分子標記的檢測:對提取的基因組dna進行ssr分子標記的pcr擴增;
10、s4、電泳檢測:將擴增得到的pcr產物與上樣緩沖液混勻后,電泳,銀染,顯色,拍照。
11、進一步的,所述利用植物基因組dna提取試劑盒提取所述菌絲的基因組dna,通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計法檢測基因組dna的濃度和純度,并調整樣品dna的濃度為20-30ng/μl包括:
12、s201、取100mg的菌絲體放入1.5ml的離心管中,并加入液氮充分研磨;
13、s202、向研磨的粉末中快速加入400μl?buffer?lp1和6μl?rnase?a(10mg/ml),渦旋振蕩1min,并室溫放置10min使其充分裂解;
14、s203、向裂解液中加入130μl?buffer?lp2,上下顛倒混勻后,渦旋振蕩1min;
15、s204、12000rpm離心5min,并將上清液轉移至新的離心管中;
16、s205、加入1.5倍體積的buffer?lp3,上下顛倒混勻8-10下;
17、s206、將s205所得溶液和沉淀全部轉移到已裝入收集管的吸附柱中,12000rpm離心1min,倒掉收集管中的廢液,并將吸附柱重新放回收集管中;
18、s207、向吸附柱中加入500μl?buffer?gw2,12000離心1min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中;
19、s208、重復步驟s207;
20、s209、12000rpm離心2min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放入新的離心管中,室溫放置數分鐘至徹底晾干;
21、s210、向吸附柱的膜中間懸空滴加50-80μl?buffer?ge,室溫放置2-5min,12000rpm離心1min,收集dna溶液。
22、s211、取2μl?dna溶液,分別在2%的瓊脂糖凝膠和分光光度計上檢測dna濃度和純度。
23、進一步的,ssr分子標記的檢測中pcr擴增體系為:總體積為25μl,包括10×buffer2μl,25mmol/l?mgcl2?2μl,10mmol/l?dntps?0.6μl,5u/μl?taq?dna?polymerase?0.3μl,10μmol/l?ssr標記正向引物和反向引物體積各0.3μl,濃度20-30ng/μl的dna模板dna?0.5μl,ddh2o?19μl;
24、pcr反應條件為:94℃5min,94℃40s,60℃40s,72℃1min,72℃10min,30個循環。
25、進一步的,步驟s4中的電泳包括:取擴增得到的pcr產物1μl與2×變性凝膠緩沖液1μl依次混勻后,在聚丙烯酰胺凝膠的點樣孔中點樣,聚丙烯酰氨凝膠的體積百分比為20%,電泳緩沖液為1×tbe;180v電壓,恒壓跑90min。
26、銀染和顯色的具體工藝為:電泳結束后將玻璃板拆開,取膠板用去離子水水洗10-20s,然后放入銀染液中避光銀染5-8min,銀染后再用去離子水水洗10-20s,放入顯影液中至顯現出清晰條帶后,用去離子水水洗5–8s,在生物大分子分析儀中拍照并記錄條帶特征;銀染液和顯影液可重復用3-4次。
27、采用10對ssr標記引物對巨大側耳菌株進行pcr擴增,通過對照50bp?ladder?dnamarker確定各ssr標記引物擴增的等位片段的數量和相對分子量,找到帶型符合編號組合為:(1+2)(1+3)(4+5)14(1+4)(2+4+5)(2+3)2(2+5+6)的菌種,即可確定該菌種為巨大側耳pg46的菌種。
28、根據本發明的又一個方面,提供了一種巨大側耳pg46菌種的ssr標記指紋圖譜的應用,是利用巨大側耳全基因組開發的10對ssr標記引物,通過對收集的7株遺傳背景不同的巨大側耳菌株進行ssr標記擴增,通過對照50bp?ladder?dna?marker確定了這10對ssr標記引物在各個巨大側耳菌株中擴增出的等位片段的數量和相對分子量并編號(圖2-圖11,表2)。通過不同ssr等位位點的編號組合能夠在所收集的巨大側耳菌株中有效識別“pg46”菌種(表3),其帶型編號組合為:(1+2)(1+3)(4+5)14(1+4)(2+4+5)(2+3)2(2+5+6),符合該帶型組合的菌種,即為巨大側耳pg46菌種。
29、表2ssr引物擴增的所有等位片段信息匯總表
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32、表3菌種pg46擴增的等位片段編號表
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35、本發明的有益效果為:本發明的巨大側耳pg46菌種的ssr標記指紋圖譜可用于pg46菌種的鑒別,本發明與常規的形態學鑒定、拮抗試驗和出菇實驗相比,具有檢測時間短、準確性高、可重復性好的優點。檢測所需時間只需要3-4天,而常規的拮抗試驗所需時間至少需要1周時間,出菇試驗則需要至少2個月的時間;該方法在所收集的7個遺傳背景不同的巨大側耳菌種中具有pg46菌種的專一性,具有良好的應用前景。