污水中病原細菌檢測用磁性納米酶顆粒及其制備方法和應用

本發明屬于水環境檢測，具體涉及一種污水中病原細菌檢測用磁性納米酶顆粒及其制備方法和應用。

背景技術：

1、國標中對污水處理廠排出水中的細菌濃度具有嚴格的標準，常規的污水樣本中病原體檢測方法主要是核酸分子檢測定量法。但是該方法需要操作復雜的儀器，潔凈的實驗環境，具有專業知識基礎的操作人員，因此無法進行現場檢測，對出水口的水質進行快速判斷。

2、現階段利用有機金屬框架材料制作的生物傳感器對細菌濃度檢測的專利數量較少。有一篇專利cn111150876a：耐藥性可視化的創可貼及其制備方法，針對的是人體組織表面細菌檢測場景，且只能進行非特異性地定性檢測。

3、對大體積環境樣本中的細菌濃度進行核酸檢測需要操作復雜的儀器，潔凈的實驗環境，具有專業知識基礎的操作人員，使核酸檢測難于進行現場及時檢測。

技術實現思路

1、本發明的目的在于提供一種對環境水體病原中細菌進行現場高效富集及檢測的磁性納米酶顆粒及其制備方法和應用。

2、本發明提供的環境水體病原中細菌檢測用磁性納米酶顆粒，包括具有磁性的zif-8金屬有機框架多孔納米材料、辣根過氧化物酶；其中：

3、所述磁性zif-8金屬有機框架多孔納米材料，是以硫酸亞鐵、乙酸鋅、二甲基咪唑作為前體物合成、粒徑為25–100nm的球形磁性納米顆粒；該磁性納米顆粒具有介孔結構，孔徑為2–30nm；磁性納米顆粒表面整體帶正電；

4、所述辣根過氧化物酶，是將其添加到合成zif-8的前體溶液中；因為靜電吸引作用，在酶表面附近的前體物質濃度較高，金屬有機框架多孔納米材料聚集在辣根過氧化物酶表面，形成辣根過氧化物酶為核的磁性多孔納米酶。

5、本發明提供的磁性納米酶顆粒的制備方法，具體步驟如下：

6、準備二甲基咪唑和辣根過氧化物酶混合水溶液，稱為a液；準備乙酸鋅和硫酸鐵水溶液，稱為b液；將b液注入a液中，室溫攪拌，之后室溫靜置反應；其中，硫酸亞鐵、乙酸鋅、二甲基咪唑反應，得到zif-8磁性金屬有機框架多孔納米材料，其粒徑為25–100nm，介孔孔徑為2–30nm，顆粒表面整體帶正電；由于靜電吸引作用，在辣根過氧化物酶表面附近的前體物質濃度較高，金屬有機框架多孔納米材料聚集在辣根過氧化物酶表面，形成辣根過氧化物酶為核的磁性多孔納米酶；經過去離子水清洗后，得到球狀、表面粗糙的磁性納米酶顆粒材料。

7、其中：

8、所述二甲基咪唑溶液摩爾濃度為30–3000mm；

9、所述乙酸鋅溶液摩爾濃度為10–1000mm；

10、所述硫酸亞鐵溶液摩爾濃度為10–1000mm；

11、所述辣根過氧化物酶溶液質量濃度為2.5ng/ml–2.5g/ml；

12、所述攪拌時間為5–120min；

13、所述靜置時間為1–48h。

14、本發明還提供適配體封裝的熒光磁性納米酶顆粒在特異性免疫檢測細菌濃度中的應用。具體地，包括：(一)利用顆粒多孔性的特性，具有特異性的病原菌免疫熒光檢測法；(二)利用顆粒過氧化物酶催化特性，結合葡萄糖氧化酶搭建酶聯反應系統，提出檢測總細菌濃度的便攜性比色法，用于廣譜性的測試水體中病原菌菌群濃度。具體地：

15、(一)所述利用顆粒多孔特性，進行特異性的病原菌免疫熒光檢測，具體步驟如下：

16、選擇能特異性識別目標細菌的核酸適配體、小分子有機熒光染料；熒光染料通過自由擴散的方式進入磁性納米酶的內部孔道；引入具有“門”作用的適配體將孔道封住，防止熒光染料從多孔磁性納米酶中擴散出來；當適配體與目標細菌結合之后，適配體的空間結構產生卷曲，孔道打開，熒光染料擴散入上清液中；通過檢測上清液中熒光的發射強度，即可以表征樣品中目標細菌的濃度。具體步驟如下：

17、(1)取適量磁性納米酶顆粒與熒光染料水溶液靜置反應；去離子水清洗1次；將熒光磁性納米顆粒加入核酸適配體溶液中，靜置反應；去離子水清洗1次；

18、(2)取適量上述適配體封裝熒光磁性納米酶顆粒與含有目標細菌的樣本反應，測量上清液中熒光染料的發射強度。

19、其中：

20、所述磁性納米酶顆粒的質量濃度為1μg/ml–1g/ml；

21、所述熒光染料的摩爾濃度為1nm–1m；

22、所述兩次靜置反應時間為5min–48h；

23、所述核酸適配體濃度為1pm–1mm；

24、所述適配體封裝熒光磁性納米酶顆粒使用量為1ng–1mg；

25、所述與目標細菌的反應時間為1min–12h。

26、(二)利用顆粒過氧化物酶催化特性，結合葡萄糖氧化酶搭建酶聯反應系統，進行總細菌濃度的便攜性比色檢測，具體采用peg-gox修飾磁性納米酶顆粒；peg-gox修飾的磁性納米酶顆粒與目標細菌混合反應后，因為細菌表面帶有的負電荷比peg-gox更多，所以磁性納米酶與細菌的親和能力更強，peg-gox從磁性納米酶顆粒表面解吸；使用葡萄糖和tmb作為反應前體物可以通過比色法表征樣品中細菌的總濃度。具體步驟如下：

27、(1)首先制備peg修飾的gox；

28、磁性納米酶顆粒再與peg-gox孵育反應，peg-gox通過靜電吸附附著在磁性納米酶顆粒表面，用去離子水清洗1次；

29、(2)使用peg-gox修飾的磁性納米酶顆粒，檢測水體中病原細菌濃度的：

30、取適量peg-gox修飾磁性納米酶顆粒與含有細菌的樣本室溫反應，去除上清液，向沉淀中加入用乙酸鈉緩沖液溶解的tmb和葡萄糖混合溶液，比色反應一段時間后，測量上清液中特定波段紫外吸收峰值。

31、其中：

32、所述修飾gox的peg分子量為100–7×106；

33、所述gox濃度為1ng/ml–10g/ml；

34、所述孵育反應時間為5min–48h。

35、所述peg-gox修飾磁性納米酶顆粒與細菌溶液反應時間為1min–12h；

36、所述乙酸鈉緩沖液濃度為1mm–1m；ph值為2–7；

37、所述tmb濃度為10μm–100mm；

38、所述葡萄糖濃度為10μm–100mm；

39、所述比色反應時間為5min–30min。

40、綜上，本發明首次合成了一種制備工藝簡單、可重復性高、成本低廉的磁性(有機金屬框架材料—辣根過氧化物)納米顆粒。這種磁性納米酶顆粒可以從大體積污水樣本中快速富集病原菌至顆粒表面，相比于行業標準中規定的peg沉淀法或者膜過濾法，具有成本低廉、快速高效的特點。基于磁性納米酶顆粒廣譜性富集細菌的特性，本發明進一步利用顆粒多孔性的特性，提供了具有特異性的病原菌免疫熒光檢測法；同時本發明利用顆粒過氧化物酶催化特性，結合葡萄糖氧化酶搭建酶聯反應系統，提出了檢測總細菌濃度的便攜性比色法，用于廣譜性的測試水體中病原菌菌群濃度。

41、與以往技術相比的有益效果

42、環境水體樣本病原菌濃度低于核酸擴增法的檢測限，因此耗時、成本高的病菌富集和核酸提取過程是利用核酸擴增檢測大體積污水中病原菌不能缺少的過程，并且核酸檢測法需要干凈的實驗室環境，無法在現場實時監測。本發明中磁性納米酶顆粒具有順磁性、廣譜性富集細菌能力、多孔性、過氧化物酶活性的特點。本發明填補了大體積污水樣本中病原菌濃度現場檢測這一場景的產品空缺。