本發明涉及基因克隆及分子生物學領域,具體涉及一種糖基轉移酶及其在生產糖苷中的用途。
背景技術:
1、植物體內參與催化化合物糖苷化的酶叫做糖基轉移酶類(glycosyltransferase,gts),它將活性的糖供體轉移到糖受體上,從而形成受體糖苷化產物。udpg-糖基轉移酶類(ugts)是一個依賴于udpg(尿嘧啶核苷二磷酸糖)糖供體的糖基轉移酶類。
2、糖基轉移酶(ec2.4.x.y)是自然界存在的最為多樣性的一大類酶,糖基轉移酶負責將活性供體的單糖部分轉移至糖、蛋白質、脂類、核酸以及另外一些小分子,即完成糖基化反應,形成具有很多生物學功能的糖基化產物。在原核生物和真核生物中存在大量的糖基轉移酶,其用于催化糖基化反應生成寡糖、多糖和糖復合物。這些結構多樣性的糖分子參與和介導從結構、存儲到信號傳遞等生命活動。糖基轉移酶能夠將活化的糖基供體上的糖基團轉移至特定的受體分子形成糖苷鍵,而在糖基團轉移過程中異頭碳原子構型保留或者翻轉而形成不同構型的糖基化產物。
3、ugts屬于gt1多基因家族,gt1家族約占整個gts家族的一半左右。這類基因編碼的蛋白在c端通常有一段44個氨基酸的保守序列,該序列在糖苷化反應中可能參與結合udpg,又被稱為pspg盒。在植物多基因gts家族,普遍參與植物各種生長調控和逆境脅迫等。
4、糖基轉移酶在所有生命體中都扮演著重要的生物學角色,日益引起人們的重視。蛋白質的糖基化修飾和天然糖蛋白的去糖基化是研究糖蛋白糖鏈結構和功能的重要手段之一。其中糖基轉移酶是該反應中的有用工具。
5、糖基轉移酶(glycosyltransferase,gt)作為一種生物體中廣泛存在的轉移酶類,可以將活化的糖基供體上的糖基,轉移到底物受體上。大多數的糖基供體為核苷酸糖,但同時糖磷酸、糖脂和其他糖類也能成為供體。而糖基受體的種類包括蛋白質,糖類、脂類、核酸和多種次級代謝產物如抗生素、生物堿、植物激素、植物多糖等。
6、在過去幾十年,大量研究集中在探索糖基轉移酶在生物體中的重要性。有限的生化數據限制了對特定單酶功能的進一步理解。幾年來對gts基因的鑒定、生化表征以及其在生物體中轉錄水平和代謝水平上的分析,有利于研究糖基化機制。而大規模的植物基因組測序有助于破譯在植物次級代謝過程中,gts在糖綴合物生物合成中的功能。
7、植物gts參與具有不同特性的糖復合物的生物合成,將糖基轉移至苷元或支鏈糖基上,從而形成廣譜次級特異代謝物。植物通過次級代謝過程產生大量在醫藥、食品行業均有巨大應用價值的天然產物。
8、糖基化機制作為生物過程中發生的關鍵修飾步驟,有助于形成復雜多樣的植物次級代謝物。由于大部分高價值的次級代謝物天然含量并不高,從天然植物中直接提取通常產量較低,而耗能較高。此外,天然提取的收益可能高度依賴于地理、季節甚至政治因素。通過體外植物細胞培養或對天然植物進行代謝工程改造,可一定程度解決季節性因素和低產量的問題,但其經濟成本較高。天然糖苷類型種類繁多,且大多具有特定糖苷鍵的立體選擇性,使其受許多反應性基團的影響,因此也難以通過化學合成的方法獲得大量的產物。
9、因此,在對高價值天然產物的高需求和可持續發展需求的推動下,生物合成的方法應運而生。其中gt的催化具有高選擇性及高催化效率,可以實現大分子聚糖及糖共軛物分支延伸糖基化的立體選擇性及區域選擇性,已成功應用在了多種代謝產物中糖苷類分子的合成中。
10、糖苷的合成在制藥、化妝品、食品和保健品等行業具有重要意義,尤其是對復雜底物進行選擇性糖基化更是化學合成中的重大挑戰,需要多步且條件復雜的合成過程。糖基轉移酶因其特殊的區域選擇性和立體選擇性,使得其能夠在不需要化學合成中的基團保護的情況下對復雜化合物的特定位置進行一步糖基化反應。此外糖基轉移酶還具有廣泛的底物譜,使得其具有更高的應用價值。然而核苷二磷酸糖的成本高且可用量少,限制糖基轉移酶在工業上的應用。
11、甜葉菊(stevia?rebaudiana?bertoni)是菊科(tribe?eupatorieae)中的一種多年生根莖灌木,原產于巴拉圭和巴西,數百年來被應用于茶水風味的優化上。在這個種屬中有220-230個相關甜葉菊品種。甜菊糖苷(steviol?glycosides,sgs)是一種提取自甜葉菊葉子中的二萜糖苷成分的總稱,是甜葉菊中的甜味來源。基于近年來大量的有益證據,現在甜菊糖已獲得美國食品藥品監管局(fda)、fao/who食品添加劑聯合專家委員會(jecfa)和歐洲食品安全局批準,是一種可被人類消費的食品。隨著市場上的甜菊糖產品越來越多,歐洲食品安全局對過去幾年歐洲不同國家不同年齡人群的甜菊糖苷攝入量進行分析。根據2015及2018兩年的分析報告,目前日常飲食中使用甜葉菊成分的趨勢在增加。未來幾年,甜葉菊甜味劑的全球市場預計將增長至數百萬噸。
12、除了甜味特性外,甜菊糖在臨床上的研究也受到關注。目前研究發現,甜菊糖苷具有重要的藥理和治療活性,如抗氧化劑、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、利尿及護胃止瀉等功能,并對免疫調節和腎功能、血壓血糖等調節具有積極作用。甜菊糖苷作為甜味劑加入日常飲食中,對患有代謝綜合征、ii型糖尿病、高血壓、心血管疾病、低血糖、齲齒和念珠菌病的患者十分有益。且甜葉菊本身,可作為傷口愈合和皮膚擦傷的敷料進行外用。目前實驗結果表明,甜菊糖苷非致癌,無遺傳毒性且與人類的生殖、發育毒性無關。
13、目前市售的甜菊糖苷產品均存在輕微的苦味和澀味,人類味覺感官上會出現無法掩蓋的金屬余味,使甜菊糖苷在食品和醫藥產品中的應用受到限制。為了最大限度地減少后苦味,采取了多種工業手段,如以麥芽糊精和菊粉為膠囊劑采用噴霧干燥技術,改善其風味。同時,通過復合其他甜味劑,如赤蘚糖醇、麥芽糖醇、菊糖、低聚果糖等也可有效掩蓋余味。
14、不同類型的甜菊糖苷的結構還決定其甜度及后苦味。甜菊糖苷的c-19(r?1)與c-13(r?2)的糖基殘基對甜度形成影響。甜菊苷(stevioside,st)與萊鮑迪苷a(rebaudiosidea,reb?a)作為市面上最常見的兩種甜菊糖苷,reb?a的甜度高于st。與st相比,steviolbioside僅在r1處少一個葡糖基,但其甜度低于st。通過分析c13的r1基團,對比reba和rubusoside,可發現r1基團上的糖基變化可能與甜菊糖苷的后苦味相關。延長c19側鏈上的糖基苷元,可以提高甜菊糖苷的甜度。其中萊鮑迪苷d(rebaudioside?d,reb?d)與其他甜菊糖苷相比,后苦味相對較低。
15、在甜葉菊提取所得的糖苷種類中,甜菊苷(stevioside,st)與萊鮑迪苷a
16、(rebaudioside?a,reb?a)是含量最高的兩種成分。其中reb?a含量較st低,但其后苦味較其減少,同時穩定性也更高,在實際應用中更具有優勢。自2008年以來,reba已通過美國食品和藥物管理局安全認證,允許作為食品添加劑。2011年12月后,在歐盟也允許將st作為食品添加劑進行銷售和使用。目前在我國,已有多種類型的食品和飲料應用了甜菊糖苷產品替代蔗糖。提高甜菊糖苷產品中reb?a的含量有利于擴大甜菊糖產品的適用范圍,符合市場需求。
17、盡管在此前的研究中,預測認為reb?a會是甜味最高的甜菊糖苷。,通過志愿者品嘗的方式,對reb?a、reb?d及reb?m的風味進行了主觀評估。實驗表明,reb?a的甜度顯著低于reb?m,與reb?d在實際品嘗時,甜度略有降低但沒有顯著差異。然而相較來說,reb?a的苦味在樣品中十分突出,而reb?d和reb?m與蔗糖相比沒表現出太強的后苦味。因此reb?d與reb?m作為新一代甜味劑,更受消費者喜愛,具有更廣闊的的應用前景。
18、已純化的糖基轉移酶是目前糖基化工程中的重要酶,為研究糖蛋白糖鏈的結構與功能的關系以及細胞表面糖基化修飾提供了極好的方法。目前對這些酶的研究還處于起步階段,純化的酶種類依然很少。
技術實現思路
1、本發明的目的在于針對現有技術中糖基轉移酶不足的問題,尤其是有特色的糖基轉移酶缺乏,制約著甜菊糖苷多種類型的產品的產業化生產,提供一種新的糖基轉移酶。
2、為解決上述技術問題,本發明采用如下技術方案:
3、本發明公開了一種糖基轉移酶,所述糖基轉移酶的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。
4、本發明公開了編碼所述的糖基轉移酶的核苷酸分子。
5、優選的,所述核苷酸分子的序列如seq?id?no.3所示。
6、優選的,所述糖基轉移酶來自枯草芽孢桿菌。
7、本發明公開了表達載體,所述表達載體包含所述的核苷酸分子。
8、本發明公開了細胞,所述細胞包含所述的表達載體。
9、優選的,所述細胞為真核細胞或原核細胞。
10、優選的,所述細胞為酵母或大腸桿菌。
11、本發明公開了糖基轉移酶,所述糖基轉移酶由所述的細胞在體外表達獲得。
12、本發明公開了所述的糖基轉移酶和/或所述的核苷酸分子和/或所述的表達載體和/或所述的細胞在生產糖苷中的用途。
13、本發明公開了一種生產糖苷的方法,其特征在于,采用所述的糖基轉移酶進行生產。
14、本發明公開了一種生產糖苷的方法,包括將萊鮑迪苷a催化為萊鮑迪苷d的操作,所述操作使用的糖基轉移酶的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。
15、優選的,所述催化反應的溫度為25℃。
16、本發明利用分子克隆技術從一株耐低溫的枯草芽孢桿菌中克隆得到一種糖基轉移酶,將克隆得到的糖基轉移酶分子構建表達載體在體外進行了成功表達。酶活試驗表明,體外表達的糖基轉移酶能夠將萊鮑迪苷a催化為萊鮑迪苷d,且該糖基轉移酶具有耐低溫的特性,在25℃條件下依然可以催化反應的發生,具有廣泛的ph值反應范圍,在ph6-8范圍內均可以實現催化反應的進行。本發明公開的新的糖基轉移酶具有的耐低溫寬ph值反應的優點,適合各種糖苷糖基化產物的生產。