與煙草危害性主流煙氣釋放量基因qH緊密連鎖的共顯性SSR標記及應用的制作方法

本發明屬于生物，具體涉及一種與煙草危害性主流煙氣釋放量基因qh緊密連鎖的共顯性ssr標記及應用。

背景技術：

1、煙草是一種葉用型經濟作物，因其含有煙民吸食時可獲得極大滿足感和愉悅感的煙堿而被廣泛種植。然而，吸煙有害健康又使煙草成為一種備受爭議的經濟作物。故此，培育低危害的煙草品種就成為煙草新品種選育的一個重要方向(王元英，周健.中美主要煙草品種親源分析與煙草育種.中國煙草學報，1995，3(2)：11-22)。煙草主流煙氣中的有害成分釋放量是評判低危害煙草品種選育成敗的核心依據(謝劍平，劉惠民，朱茂祥，等.卷煙煙氣危害性指數研究.煙草科技，2009，2：5-15)。研究表明，煙草尤其是成品卷煙煙氣是一種極其復雜的混合物，是在卷煙抽吸過程中由煙草燃燒、裂解和蒸餾而產生的(王珂清，秦艷華，吳洋，等.加熱卷煙煙氣中氨釋放特性研究.中國煙草科學，2021，42(6)：74-78；趙云川，廖曉祥，陳冉，等.微波膨脹梗絲對卷煙7種煙氣有害成分釋放量及危害性指數的影響.煙草科技，2015，48(11)：53-58；閆寧，劉加紅，杜詠梅，等.我國不同產區烤煙煙葉主流煙氣主要有害成分分析.中國煙草科學，2017，38(1)：85-90；夏國聰，馬麗娜，黃紅儀，等.國內外不同品牌卷煙樣品危害性指數比較[j].煙草科技，2012，3：37-40)。謝劍平等(謝劍平，劉惠民，朱茂祥，等.卷煙煙氣危害性指數研究.煙草科技，2009，2：5-15)的研究確定了對煙草主流煙氣危害性影響最大的7項有害成分指標為氨(nh3)、一氧化碳(co)、氫氰酸(hcn)、4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(nnk)、苯并芘(bap)、苯酚(phe)、巴豆醛(cro)。此外，鑒于煙草主流煙氣中煙堿(cic)和焦油(tar)對人體健康的極大危害性，國內外煙草行業將上述9種有害成分統籌考慮，進而構建了一套科學評價煙草主流煙氣中的危害性方法。

2、迄今，針對煙草主流煙氣中9種代表性有害成分的研究主要集中在有害成分的檢測方法及評價卷煙產品品質等方面，而針對煙草主流煙氣中代表性有害成分的遺傳分析研究，國內外僅有1例報道。即，童治軍等(童治軍，唐石云，徐永明，方敦煌，陳學軍，馮穎杰，楊宗燦，劉文召，張婷婷，楊金初，肖炳光.卷煙主流煙氣有害成分遺傳分析.中國煙草科學，2023，44(3)：16-22)采用主基因+多基因sea-dh聯合分析方法并結合煙草重組自交系群體(rils)對煙草主流煙氣中9種代表性有害成分進行遺傳分析，結果表明，9種煙草主流煙氣有害成分(nh3、co、hcn、nnk、bap、phe、cro、cic和tar)性狀的遺傳變異主要由遺傳因素決定，環境因素對其影響較小；上述具有極高遺傳率的主基因/qtl存在將有助于進一步開展煙草低危害成分性狀的分子標記輔助選擇和基因/qtl定位研究。目前，除上述9種代表性煙草主流煙氣中有害成分外，危害性主流煙氣(h)、總粒相物(tpm)和煙氣水分(moi)等也屬于成品卷煙抽吸時釋放的重要有害成分，但針對危害性主流煙氣釋放量基因/qtl定位分析研究，國內外迄今尚未報道。故此，煙草危害性主流煙氣釋放量基因/qtl定位分析的空白，嚴重地制約了低危害煙草品種的分子標記輔助選育，尤其是嚴重制約了利用與危害性主流煙氣釋放量基因qh緊密連鎖標記開展煙草低危害新品種的選育進程。

3、鑒于此，本發明首先以烤煙資源y3(具有高危害性主流煙氣釋放量，含基因qh)和主栽低危害烤煙品種k326(低/無危害性主流煙氣釋放量，含基因qh)為親本，通過雜交、連續套袋自交，構建一個含有269份株系的煙草重組自交系(rils_f8:9)為作圖群體；其次，利用本實驗室基于烤煙種質資源y3基因組信息開發的大規模ssr分子標記對269個rils_f8:9株系進行基因型分析，構建獲得1張高質量煙草ssr分子遺傳連鎖圖譜，該圖譜含有2059個ssr標記且較均勻分布于煙草24條連鎖群上，覆蓋全基因組長度為1759.74cm；再次，待煙草成熟采烤后，切絲并手工卷制成單料煙支，按照gb/t?19609—2004規定，將卷制煙支置于sm450型直線型吸煙機上抽吸，采用氣相色譜-質譜聯用(gc-ms)方法、高效液相色譜(hplc)法和近紅外光譜分析法對危害性主流煙氣(h)釋放量進行檢測；最后，利用數量性狀連鎖分析(qtl)法并結合rils_f8:9的基因型數據(遺傳連鎖圖譜)和表型數據(危害性主流煙氣釋放量)，在煙草全基因組范圍內篩選獲得與危害性主流煙氣釋放量基因qh緊密連鎖的共顯性ssr標記，既有效填補了國內外關于煙草危害性主流煙氣釋放量性狀基因/qtl定位分析的空白，又獲得與危害性主流煙氣釋放量基因qh緊密連鎖的共顯性ssr標記，是精準、高效利用分子標記輔助選擇(mas)培育低危害烤煙新品種的重要途徑。

技術實現思路

1、本發明正是為了解決煙草危害性主流煙氣釋放量性狀基因/qtl定位分析的空白，提供一種與煙草危害性主流煙氣釋放量基因qh緊密連鎖的共顯性ssr標記及應用。

2、本發明的第一目的在于提供一種與煙草危害性主流煙氣釋放量基因qh緊密連鎖的共顯性ssr標記；第二目的在于將上述共顯性ssr標記應用于檢測煙草基因組dna中是否存在危害性主流煙氣釋放量基因qh及待測植株中危害性主流煙氣釋放量性狀的基因型狀態。

3、本發明的創新點：本發明首次針對煙草危害性主流煙氣釋放量基因qh進行遺傳定位分析。本發明人的研究表明，煙草危害性主流煙氣釋放量屬于典型的數量性狀，且受烤煙種質y3基因組內第13條染色體的qtl控制，該基因/qtl被暫命名為qh。

4、本發明采用如下技術方案實現。

5、一種與煙草危害性主流煙氣釋放量基因qh緊密連鎖的共顯性ssr標記，本發明所述的與煙草危害性主流煙氣釋放量基因qh緊密連鎖的共顯性ssr標記的編號為pt51644和pt61401，其pcr擴增產物核苷酸序列分別為seq?id?no.1和seq?id?no.2、seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。

6、seq?id?no.1：

7、gaaacagagatcaatcccgcttgagttaatgttccaaacatattcaggaactgttctctctctctctctctctctctctctctctctctcatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatattgcaatttttatctgagtcgttgagtgtaagagatggcg。

8、seq?id?no.2：

9、gaaacagagatcaatcccgcttgagttaatgttccaaacatattcaggaactgttctctctctctctctctctctctctcatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatattgcaatttttatctgagtcgttgagtgtaagagatggcg。

10、seq?id?no.3：

11、gctctcgtttccatccttcatttgtaggtcagataaagaaattgtttctaaatcttcttctactcttcgtttttcagctttgatatccataatcaagaagctttcaagttaaatacgatgtaaaaacaatttttggtacaatagaacgtaaaatatatatatatacttatatactgtactatgttgtgaagatgtgaagatttatggga。

12、seq?id?no.4：

13、tcccataaatcttcacatcttcacaacatagtacagtatataagtatatatatatatatatatatatatattttacgttctattgtaccaaaaattgtttttacatcgtatttaacttgaaagcttcttgattatggatatcaaagctgaaaaacgaagagtagaagaagatttagaaacaatttctttatctgacctacaaatgaaggatggaaacgagagc。

14、本發明所述共顯性標記pt51644和pt61401位于目的基因qh兩側。

15、本發明所述的分子標記所對應的2個位點的引物序列分別為：

16、擴增pt51644的引物序列為：

17、pt51644f：5’-cgccatctcttacactcaacg-3’(seq?id?no.5)，

18、pt51644r：5’-gaaacagagatcaatcccgc-3’(seq?id?no.6)；

19、擴增pt61401的引物序列為：

20、pt61401f：5’-tcccataaatcttcacatcttcac-3’(seq?id?no.7)，pt61401r：5’-gctctcgtttccatccttca-3’(seq?id?no.8)。

21、上述的與煙草危害性主流煙氣釋放量基因qh緊密連鎖的共顯性ssr標記的應用在于檢測煙草基因組dna中是否存在危害性主流煙氣釋放量基因qh及待測植株中危害性主流煙氣釋放量性狀的基因型狀態。

22、本發明上述的應用，該應用的方法為，以pt51644和pt61401序列的引物分別擴增待檢測煙草基因組dna，檢測pcr擴增產物。

23、本發明pcr擴增產物中同時含有如seq?id?no.1和seq?id?no.3所示序列則表明該待測煙草植株存在高危害性主流煙氣釋放量的純合等位基因，基因型為hh。

24、本發明pcr擴增產物中同時含有如seq?id?no.2和seq?id?no.4所示序列則為待測煙草植株無危害性主流煙氣釋放量的純合等位基因，基因型為hh。

25、本發明pcr擴增產物中同時含有如seq?id?no.1和seq?id?no.4所示序列，或同時含有如seq?id?no.2和seq?id?no.3所示序列則為待測煙草植株存在中等危害性主流煙氣釋放量的雜合等位基因，基因型為hh。

26、為了快捷、高效選擇低危害煙草品種，本發明有針對性地選擇無危害性主流煙氣釋放量基因qh的煙草后代材料，可用于無危害性主流煙氣釋放量基因qh的輔助選擇，以提高分子標記輔助選擇的效率及低危害煙草品種選育效率。利用本發明提供的2個與煙草危害性主流煙氣釋放量基因qh緊密連鎖的共顯性ssr標記，不僅可用于定性檢測任何生育期的煙草基因組dna中是否存在危害性主流煙氣釋放量基因qh，還可以清晰、精準鑒別待測植株中的危害性主流煙氣釋放量性狀的基因型狀態(即，具有最高危害性主流煙氣釋放量值且穩定遺傳的純合基因型hh、具有中等危害性主流煙氣釋放量值且不能穩定遺傳的雜合基因型hh、無危害性主流煙氣釋放量且穩定遺傳的純合基因型hh)，進而既提高了低危害烤煙新品種選育的科學性、可預測性，又加速了育種進程。

27、本發明與現有技術相比，其有益效果為：

28、1、填補了國內外關于煙草危害性主流煙氣釋放量基因qh遺傳定位研究的空白。

29、2、清晰、精準檢測煙草危害性主流煙氣釋放量性狀的基因型狀態

30、提供了用于檢測煙草危害性主流煙氣釋放量基因qh的分子標記，既可精準確定待測煙草中是否有危害性主流煙氣釋放量，又可清晰的鑒別出待測煙草植株中的危害性主流煙氣釋放量性狀的基因型狀態。

31、3、檢測方法高效、穩定、可靠，且操作簡捷和低成本

32、與現有的采用低通量、高成本、耗時費力的gc-ms法、hplc法和近紅外光譜分析法檢測煙草主流煙氣中危害性成分(h)釋放量相比，本發明所述的共顯性ssr標記具有高效、穩定、可靠、簡捷和低成本的特點。

33、4、不限檢測時機

34、本方法可在煙草生長的任何時期進行檢測，尤其是在煙草幼苗期的檢測，徹底且完美避開了漫長的煙草生長周期及采收、烘烤、葉片切絲、煙支卷制、吸煙機抽吸和耗時費力的檢測等過程，極顯著的縮短了檢測周期，進而加速了低危害烤煙新品種選育進程。

35、下面結合附圖和具體實施方式本發明做進一步解釋。