本發明提供了用于穩定尿液樣品的方法、組合物和收集容器。本發明的技術允許同時穩定無細胞和基因組dna以及穩定尿液中的細胞。
背景技術:
1、體內大部分dna位于細胞內,但也可以發現少量核酸在人類體液如血液和尿液中自由循環(通常稱為細胞外dna、無細胞dna或也稱為循環dna)。在許多醫學病狀、惡性腫瘤和感染過程中,細胞外dna和其他細胞外核酸水平升高的存在對于篩查、診斷、預后、疾病進展監視、識別潛在治療靶點和監測治療反應是尤其受關注的。
2、體液樣品中細胞外dna的降解是一個問題,并且根據樣品類型,樣品收集后受損或腐爛的細胞的遺傳物質可能會稀釋細胞外dna。
3、為了避免或減少上述問題,例如建議在抽取血液后基本上立即從全血中獲得血漿和/或穩定血液樣品直到可以獲得血漿。同時,從血液樣品中穩定和分離細胞外dna已得到充分確立。對于血液樣品的穩定化,市售有幾種專用的采血管(streck、roche、preanalytix、biomatrica、norgene等)。穩定化方法例如描述于wo?2013/045457、wo?2013/045458、wo?2014/146780、wo?2014/146782、wo?2014/146781、wo?2014/049022和wo?2017/085321。
4、盡管與進行活檢相比,抽血的侵入性要小得多,但仍然是侵入性的,并且尤其是在接受治療的老年人、嬰兒或癌癥患者的情況下可能很困難或不可能。作為治療監測、耐藥性失敗測試甚至診斷的替代來源的真正無創樣品將是對當前液體活檢技術的寶貴補充。從尿液中純化無細胞dna在此提供了一種方便且完全非侵入性的替代方法。
5、許多同行評議的文章表明,尿液可以用作液體活檢。除了對尿路上皮癌的常規細胞組織學分析外,尿液中癌細胞或惡性細胞的gdna和無細胞dna與癌癥特異性序列、表觀遺傳和結構變化相關。已經公開,來自以下癌癥患者的尿液含有腫瘤源性的無細胞dna:膀胱癌(birkenkamp-demtr?der?k等人,?膀胱癌患者液體活檢的基因組改變(genomicalterations?in?liquid?biopsies?from?patients?with?bladder?cancer).?eur?urol.2016年7月;70(1):75-82)、前列腺癌(salvi?s等人,?用于前列腺癌患者早期檢測的尿液無細胞dna完整性分析(urine?cell-free?dna?integrity?analysis?for?early?detectionof?prostate?cancer?patients).?dis?markers.?2015;2015:574120)、肺癌(chen?s,zhao?j,?cui?l,?liu?y.?用于動態追蹤使用?egfr-tki?治療的?nsclc?患者的?egfr?突變的尿循環dna檢測(urinary?circulating?dna?detection?for?dynamic?tracking?ofegfr?mutations?for?nsclc?patients?treated?with?egfr-tkis).?clin?transl?oncol.2017年3月;19(3):332-340)和其他實體瘤癌癥類型?(fujii?t等人,?用于定量檢測晚期癌癥患者尿液無細胞dna中kras突變的突變富集下一代測序(mutation-enrichment?next-generation?sequencing?for?quantitative?detection?of?kras?mutations?in?urinecell-free?dna?from?patients?with?advanced?cancers).?clin?cancer?res.?2017年7月15日;23(14):3657-3666)。此外,還描述了從尿液樣品中分離胎兒dna。因此,除了血液之外,尿液也是一種重要的液體活檢樣品。
6、然而,尿液中的有核細胞和無細胞dna都不穩定,并且在尿液樣品收集后迅速溶解或降解。此外,尿液中脫落的有核細胞(例如正常上皮細胞或癌癥源性細胞)會釋放基因組dna,其導致無細胞dna的稀釋。尿液中的dna降解特別迅速,并且基本上在樣品收集后立即發生。因此,需要有效的穩定化方法以通過減少儲存期間尿液樣品中包含的無細胞dna的降解來保存尿液樣品中的無細胞dna。在這方面,應注意,基于儲存后尿液樣品中包含的無細胞dna的總量,難以確定最初尿液樣品中包含的無細胞dna的有效保存。這是因為在儲存期間降解的最初存在的無細胞dna可以被包含在尿液樣品中的細胞釋放的dna補充。因此,即使在尿液樣品收集時和儲存后無細胞尿液級分中dna的總量相同,但最初存在的無細胞dna仍可能被降解而儲存后無細胞尿液級分中包含的dna可能基本上對應于儲存期間從細胞中釋放的dna。然而,具有特定分析價值的是最初存在于無細胞尿液級分中的無細胞dna,而不是在儲存期間從細胞釋放到無細胞尿液級分中的dna。如果最初存在的無細胞dna在儲存期間降解,則其無法用于后續分析。因此,尿液穩定化的一個重要目的是將樣品收集時尿液中包含的無細胞dna穩定化。此外,希望尿液穩定化技術實現所含細胞的穩定化,從而可以從穩定化的尿液樣品中回收細胞以供進一步使用,例如細胞組織學測試方法和/或從細胞中分離基因組dna。已知的尿液穩定化方法并沒有充分解決這些目標。
7、一種已知的尿液穩定化方法(streck?–無細胞dna尿液保存)是基于使用甲醛釋放劑。無細胞dna尿液防腐劑以5ml小瓶提供。一個小瓶中的試劑必須與25至100ml尿液混合。這種方法有幾個缺點。它要求將未穩定化的尿液帶到實驗室或醫生辦公室。從而延遲了尿液被穩定化的時間點。此外,為了穩定化,必須打開初級收集杯并且必須從小瓶中加入穩定化試劑并與尿液混合。這些手動交互不方便且容易出錯。此外,含有甲醛的試劑具有有毒和化學修飾生物分子如蛋白質和核酸的缺點。這會減少可回收并因此可分析的無細胞dna的量。由于尿液樣品中所關注的無細胞dna的數目可能有限,這是一個巨大的缺點。
8、trovagene有一種試劑(nextcollect),根據制造商,它可以穩定尿液中的無細胞dna。這種試劑被整合到尿液收集容器的杯子中。zymo和norgen提供了可以保存尿液以用于后續的總dna應用的試劑。然而,對基因組和無細胞dna進行單獨分析是不可能的。
9、此外,本領域已知若干其他尿液收集裝置。例如becton?dickenson?(bd)提供了用于將尿液轉移到真空容器的產品線。bd?vacutainer?尿液收集杯是一種收集容器,具有一個帶針頭的杯子,用于將尿液轉移到真空容器中,而無需打開杯子。bd?vacutainer?尿液收集吸管是一種將尿液從任何容器轉移到真空容器的裝置。將所述裝置的一端放入尿液中,另一端包括一根可以連接到真空容器的針頭。bd?vacutainer?尿液分析保存管是具有噴霧干燥的細菌防腐劑的真空容器,抽取體積為8ml,或不含添加劑且抽取體積為8至10ml的管,旨在用于尿液。這些真空容器都不能保存dna。
10、因此需要改進的方法以允許將尿液樣品有效地穩定化為液體活檢樣品。穩定化應該允許隨后分離在尿液樣品中包含的無細胞dna以及細胞。
11、因此,本發明的一個目的是提供用于穩定尿液樣品的手段。特別地,一個目的是克服現有技術尿液穩定化方法的至少一個缺點。此外,一個目的是提供一種穩定化技術,該技術隨后允許回收無細胞dna和/或細胞內dna,例如基因組dna,此外,能夠對穩定化細胞進行細胞學分析。
技術實現思路
1、本發明提供了一種有效的尿液樣品穩定化技術,它可以保存細胞外dna?(本文也稱為無細胞dna)以及尿液樣品所包含的細胞和細胞內核酸如基因組dna。所提供的穩定化技術特別允許抑制尿液樣品中無細胞dna的降解以及細菌生長。因此,本發明的穩定化技術穩定了尿液中的無細胞dna以及尿液中存在的細胞的基因組dna和細胞學。本發明由此提供了一種同時穩定無細胞dna和基因組dna以及穩定尿液中的細胞的解決方案。因此,可以用根據本發明的技術穩定化的尿液樣品進行多模態測試,包括無細胞和基因組dna測試以及常規細胞學染色。
2、此外,本發明提供了一種尿液的樣品收集、穩定化和制備系統。本發明的穩定化化學品可以包含在尿液接收容器,優選真空管中,其可以與公知的尿液收集容器和公知的核酸純化和測定技術組合使用。因此,本發明還提供了用于從尿液樣品進行分子分析的標準化系統,包括從尿液收集到洞察核酸和/或細胞分析的整個工作流程。
3、根據第一方面,本發明提供了一種用于穩定尿液樣品的方法,所述方法包括將用于穩定化的尿液樣品與螯合劑(優選edta)和至少一種聚(氧乙烯)聚合物(優選聚乙二醇)接觸,其中穩定化尿液樣品中的細菌生長得以抑制。優選地,用于穩定化的化合物包含在穩定化組合物,例如根據第三方面的穩定化組合物中。
4、根據第二方面,本發明提供了一種處理尿液樣品的方法,所述方法包括以下步驟:
5、a)根據第一方面的方法穩定尿液樣品;以及
6、b)從穩定化尿液樣品中分離細胞,從而提供(i)細胞樣品和(ii)去除細胞的上清液。
7、根據第三方面,本發明提供了一種用于穩定尿液樣品的穩定化組合物,其中穩定化尿液樣品中的細菌生長得以抑制,所述組合物包含
8、-?螯合劑,優選edta,
9、-?至少一種聚(氧乙烯)聚合物,優選聚乙二醇,以及任選地
10、-?用于抑制細菌生長的防腐劑。
11、相應的穩定化組合物允許穩定化尿液樣品在室溫下儲存和/或處理(例如運輸)數天,而不會顯著影響樣品的質量。穩定化組合物可以是易于操作、安全且無需人工交互的封閉式尿液收集系統的一部分。
12、根據第四方面,本發明涉及根據第三方面的穩定化組合物用于穩定尿液樣品的用途。根據第三方面的穩定化組合物可以例如在根據第一方面的方法中用于穩定化。
13、根據第五方面,本發明提供了一種用于接收尿液樣品的接收裝置,其中所述接收裝置包含
14、-?螯合劑,優選edta,
15、-?至少一種聚(氧乙烯)聚合物,優選聚乙二醇,和
16、-?任選的用于抑制細菌生長的防腐劑。
17、接收裝置適用于穩定尿液樣品。在穩定化尿液樣品中可以抑制細菌生長。優選為真空收集管的相應接收裝置優選包含根據第三方面的穩定化組合物,例如如權利要求18至24中的任一項所限定的穩定化組合物。提供這樣的相應接收裝置具有以下優點:一旦樣品被包含在相應的裝置中,尿液樣品就會立即穩定化。接收裝置可以在根據第一方面的方法中用于穩定化。
18、根據第六方面,本發明提供了一種方法,所述方法包括收集尿液樣品的步驟。根據一個實施方案,尿液樣品被收集到根據本發明第五方面的裝置的腔室中。根據另一個實施方案,用于收集尿液樣品的方法包括
19、a)在容器中,優選在尿杯中收集尿液;以及
20、b)使用根據第一方面的方法穩定尿液樣品。
21、在步驟a)中收集的尿液可以在步驟b)中被轉移到根據第五方面的接收裝置中以進行穩定化,其中所述接收裝置優選包含根據第三方面的穩定化組合物,例如如權利要求18至24中的任一項所限定的穩定化組合物。
22、根據第七方面,本發明提供了一種生產根據本發明的第三方面的組合物的方法,其中將穩定化組合物的組分優選在液體組合物如溶液中組合。如本文所用,術語“溶液”特別是指液體組合物,優選水性組合物。它可以是僅單相的均質混合物,但包含固體組分例如沉淀物的溶液也在本發明的范圍內。
23、根據以下描述和權利要求書,本技術的其他目的、特征、優點和方面對于本領域技術人員會變得顯而易見。然而,應當理解,以下描述、權利要求書和具體實施例雖然指示了本技術的優選實施方案,但僅作為說明給出。