本發明涉及生物,具體地,涉及一種微生物單細胞crispr篩選多組學測序的建庫方法。
背景技術:
1、crispr是一種強大的工具,可以在功能上表征非編碼調節元件并將其映射到基因,可以幫助科學家們理解非編碼調節元件在基因調控網絡中的作用,識別關鍵的調控元件,并進一步揭示基因表達調控的機制。近年來,crispr篩選與單細胞rna測序(scrna-seq)的結合使得大規模遺傳擾動的深度表型分析成為可能,為解開轉錄組調控提供了前所未有的機會,在這里我們稱之為單細胞crispr篩選。其基礎是sgrna及其誘導的細胞反應在單細胞內的劃分。因此檢測每個細胞的sgrna及其單細胞轉錄組將為復雜細胞庫中的單個基因敲除提供基因表達特征。為了實現這一概念,主要有三個關鍵點:第一個是可以在單細胞rna-seq實驗中檢測到代表特定基因擾動的sgrna序列;第二個是將捕獲到的單細胞轉錄組分配給sgrna序列的計算管道;第三是用于分析和解釋sgrna(特定基因擾動)誘導的轉錄譜的生物信息學方法。然而,目前的實現面臨著技術和實踐上的限制,諸如基因編輯效率低、細胞損傷和毒性、篩選標準化、高成本、可擴展性差以及sgrna設計和優化等。
2、目前單細胞crispr篩選主要應用于哺乳動物的基因功能研究、疾病機制探索、藥物靶點發現等領域,而并未應用于微生物細胞領域的研究。其原因除了因為單細胞crispr篩選技術自身面臨的技術限制以及微生物單細胞測序技術的不成熟外,還可能因為微生物細胞的特殊性:傳代速度快、易受環境因素影響等原因。微生物群落的行為和生物效應不僅取決于其組成,還取決于每個微生物內部發生的生化過程以及它們之間的相互作用;這些過程強烈地受到生活在該群落中的每個單獨微生物的基因組的影響。菌株之間的這些基因組差異可能導致重要特征的差異,如抗生素耐藥性、代謝能力以及與宿主免疫系統的相互作用,這可能對人類健康造成嚴重后果。完善我們對這些行為的基本理解主要依賴于特定微生物特有基因和途徑的詳細知識;然而除了應用于研究微生物細胞菌株水平差異的微生物單細胞轉錄組測序技術外,還需要具有研究基因調控網絡機制的微生物單細胞crispr篩選技術,兩者的結合能更好地擴展研究微生物細胞復雜遺傳調控的能力。
技術實現思路
1、本發明的目的在于解決現有的微生物單細胞測序技術無法在單細胞層次研究微生物細胞復雜遺傳調控機制的問題,提供了一種能夠從單個細胞的水平探究非編碼調節元件在基因調控網絡中的作用,識別關鍵的調控元件并進一步揭示基因表達調控機制的方法。
2、為達到以上目的,本發明提供了一種微生物單細胞crispr篩選多組學測序的建庫方法,包括以下步驟:
3、采用一種基于crispr/cas9系統的基因批量敲除方法制備微生物細胞sgrna池;
4、對制備好的微生物細胞sgrna池進行細胞固定,對固定后的細胞進行tris-hcl-ri重懸以獲得細胞懸液,然后對細胞懸液濃度進行計數;
5、根據細胞濃度,使用tween-20和溶菌酶混合液對一定量固定后的細胞懸液進行透化處理及rrna的去除,獲得去除rrna后的細胞懸液并進行濃度計數;
6、根據待測細胞樣品濃度進行樣品稀釋,獲得具有一定濃度的細胞懸液以及配套優化的反轉錄試劑進行微流控上機,以獲得油包水溶液進行反轉錄;
7、對反轉錄后的油包水溶液進行破油,純化回收處理,然后對回收產物進行適當的pcr富集,以獲得用于后續建庫的中間產物cdna;
8、對中間產物cdna進行兩種方式的建庫,一種是基于10x平臺的微生物單細胞測序的建庫方法,主要為了捕獲單細胞轉錄組;另一種是二步法建庫,主要為了捕獲帶有barcode和umi信息的代表特定基因擾動的sgrna序列,以便將捕獲到的單細胞轉錄組分配給sgrna序列的計算管道。
9、基于10x平臺的微生物單細胞測序的建庫方法以碧云天的tn5轉座酶(d7102s)結合me序列、primer1和primer2進行adapter1轉座子和adapter2轉座子的制備,以此對10x中間產物進行片段化和加接頭;采用new?england?biolabs的q5酶(m0491l)及10x中間產物相適配的n5xx和n7xx序列進行文庫擴增。
10、二步擴增的建庫方法采用new?england?biolabs的q5酶(m0491l)及10x?crispr中間產物相適配的one?step?forward?primer和one?step?reward?primer進行第一步擴增,采用uni-adapter通用接頭序列和帶有index的dxxx引物序列進行最終文庫擴增。
11、本發明所提供的一種微生物單細胞crispr篩選多組學測序的建庫方法能夠在經過基因批量敲除的微生物細胞sgrna池中進行單個細胞的捕獲,對獲得的中間產物cdna進行文庫構建,從單個細胞的水平探究微生物細胞復雜遺傳調控機制。
12、本發明所可選的待測生物為微生物細胞,進一步優選的,為原核微生物細胞,最優選的,模式原核微生物細胞。
13、其中,進行固定時所使用的甲醛濃度為4%,溫度為4℃。可選的,甲醛處理的時間為6-16h,樣品的震蕩頻率為30-40rpm/min(可以根據樣品的細胞壁、細胞膜的復雜程度進行調整),樣品的離心轉速為5500-7000xg,離心時間為5-10min(可以根據樣品細胞的形態和體積大小進行調整)。
14、其中,進行透化處理時使用的tween-20的濃度和冰浴時間根據樣品細胞的細胞壁和細胞膜復雜程度,尤其是革蘭氏陽性菌,tween-20的濃度可以適當提高,處理時間延長。
15、其中,進行透化處理時使用的混合液中溶菌酶的終濃度在2.5—6.25mg/ml,處理時間在10—15min(根據樣品細胞的細胞壁細胞膜復雜程度)。
16、其中,采用帶有non-poly(dt)固定序列的隨機六堿基反轉錄引物psn-n6-primer進行反轉錄,以適配微生物細胞中mrna有無polya尾巴的特點。
17、其中,使用碧云天的tn5轉座酶(d7102s)結合me序列、primer1和primer2進行adapter1轉座子和adapter2轉座子的制備,以此對10x中間產物進行片段化和加接頭;采用new?england?biolabs的q5酶(m0491l)及10x中間產物相適配的n5xx和n7xx序列進行文庫擴增。
18、其中,采用new?england?biolabs的q5酶(m0491l)及10x?crispr中間產物相適配的one?step?forward?primer和one?step?reward?primer進行第一步擴增,采用uni-adapter通用接頭序列和帶有index的dxxx引物序列進行最終文庫擴增。
19、本發明所提供的微生物單細胞crispr篩選多組學測序方法適用于基因批量敲除的微生物細胞sgrna池的單細胞測序,具有以下優點及有益效果:
20、(1)本發明是基于10x?genomics公司的chromium?controller控制器進行單細胞捕獲和油包水結構形成的,而應用于單細胞領域的10x微流控平臺具有市場分布廣泛,文獻體量大,數據穩定等特點,而本發明是基于10x微流控平臺的,因此無需購買或更換新的微流控儀器,節省科研經費,除此之外,已經購買10x微流控平臺儀器的實驗室,可以直接進行相關實驗操作;
21、(2)本發明的實驗流程相較于目前市場上出現的微生物單細胞測序技術更加簡單,實驗所需時間更短,減小了在實驗過程中引入污染的概率;
22、(3)本發明在反轉錄體系中設計了帶有non-poly(dt)固定序列的隨機六堿基反轉錄引物(psn-n6-primer)對原始反轉錄引物進行了替換,以適配微生物細胞中原核與真核細胞的mrna有無polya尾巴的特點,適用性更加廣泛;
23、(4)本發明以基于10x平臺的微生物單細胞測序的單細胞轉錄組捕獲和二步擴增的帶有barcode和umi信息的代表特定基因擾動的sgrna序列捕獲的兩種建庫方式相結合進行微生物單細胞crispr篩選多組學測序的文庫構建。實驗流程更加簡單,實驗時間進一步縮短,同時也減少了投入核酸的損失。