抗MSLN納米抗體及其制備方法與用途與流程

本發明涉及生物醫學或生物制藥，更具體地，本發明涉及一種抗msln納米抗體；還涉及所述納米抗體的制備方法及其在治療疾病中的用途。

背景技術：

1、間皮素(mesothelin，msln)是一種糖基磷脂酰肌醇(gpi)錨定的細胞表面糖蛋白，成熟過程中被蛋白酶水解成通過gpi錨定到細胞膜的c端部分，即為成熟的間皮素，和以溶解的形式釋放出來n末端部分。成熟的間皮素可被多種蛋白酶(金屬蛋白酶adams、基質金屬蛋白酶mmps、膽汁酸輔酶a合成酶bacss)水解，脫落的msln游離于血清中。

2、正常生理狀態下，msln表達局限于腹膜、心包膜和胸腔膜的間皮細胞，且表達量低；但在間皮瘤、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中具有高表達。msln的異常表達在腫瘤細胞增殖、粘附和耐藥性中起重要作用。msln在正常組織中不表達或者表達低，但在腫瘤組織中高表達，使得其成為治療腫瘤的特異性靶點。

3、納米抗體(nanobody)又稱為單域抗體(sdab)，僅由重鏈構成，相較于傳統的igg抗體，具有分子質量小、穩定性好、穿透性強等特點。

4、開發新的有效針對msln的特異性抗體為msln陽性腫瘤的治療帶來希望。

技術實現思路

1、納米抗體

2、在第一方面，本發明提供了一種特異性結合msln的納米抗體或其抗原結合片段，其包含seq?id?nos:66～70任一項所示的重鏈可變區(vhh)中含有的cdr1、cdr2以及cdr3；

3、優選地，所述cdrs根據imgt、kabat、abm、chothia、contact或它們的組合的編號系統定義。在某些實施方案中，所述的納米抗體或其抗原結合片段，其包含如下cdr1、cdr2以及cdr3：

4、(1)按imgt編號系統定義：

5、(1a)cdr1包含seq?id?no：1所示的序列，cdr2包含seq?id?no：6所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：11所示的序列；

6、(1b)cdr1包含seq?id?no：2所示的序列，cdr2包含seq?id?no：7所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：12所示的序列；

7、(1c)cdr1包含seq?id?no：3所示的序列，cdr2包含seq?id?no：8所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：13所示的序列；

8、(1d)cdr1包含seq?id?no：4所示的序列，cdr2包含seq?id?no：9所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：14所示的序列；

9、或；

10、(1e)cdr1包含seq?id?no：5所示的序列，cdr2包含seq?id?no：10所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：15所示的序列；

11、(2)按kabat編號系統定義：

12、(2a)cdr1包含seq?id?no：16所示的序列，cdr2包含seq?id?no：21所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：26所示的序列；

13、(2b)cdr1包含seq?id?no：17所示的序列，cdr2包含seq?id?no：22所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：27所示的序列；

14、(2c)cdr1包含seq?id?no：18所示的序列，cdr2包含seq?id?no：23所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：28所示的序列；

15、(2d)cdr1包含seq?id?no：19所示的序列，cdr2包含seq?id?no：24所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：29所示的序列；

16、或；

17、(2e)cdr1包含seq?id?no：20所示的序列，cdr2包含seq?id?no：25所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：30所示的序列；

18、(3)按abm編號系統定義：

19、(3a)cdr1包含seq?id?no：31所示的序列，cdr2包含seq?id?no：36所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：26所示的序列；

20、(3b)cdr1包含seq?id?no：32所示的序列，cdr2包含seq?id?no：37所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：27所示的序列；

21、(3c)cdr1包含seq?id?no：33所示的序列，cdr2包含seq?id?no：38所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：28所示的序列；

22、(3d)cdr1包含seq?id?no：34所示的序列，cdr2包含seq?id?no：39所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：29所示的序列；

23、或；

24、(3e)cdr1包含seq?id?no：35所示的序列，cdr2包含seq?id?no：40所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：30所示的序列；

25、(4)按chothia編號系統定義：

26、(4a)cdr1包含seq?id?no：41所示的序列，cdr2包含seq?id?no：46所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：26所示的序列；

27、(4b)cdr1包含seq?id?no：42所示的序列，cdr2包含seq?id?no：47所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：27所示的序列；

28、(4c)cdr1包含seq?id?no：43所示的序列，cdr2包含seq?id?no：48所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：28所示的序列；

29、(4d)cdr1包含seq?id?no：44所示的序列，cdr2包含seq?id?no：49所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：29所示的序列；

30、或；

31、(4e)cdr1包含seq?id?no：45所示的序列，cdr2包含seq?id?no：50所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：30所示的序列；

32、(5)按contact編號系統定義：

33、(5a)cdr1包含seq?id?no：51所示的序列，cdr2包含seq?id?no：56所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：61所示的序列；

34、(5b)cdr1包含seq?id?no：52所示的序列，cdr2包含seq?id?no：57所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：62所示的序列；

35、(5c)cdr1包含seq?id?no：53所示的序列，cdr2包含seq?id?no：58所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：63所示的序列；

36、(5d)cdr1包含seq?id?no：54所示的序列，cdr2包含seq?id?no：59所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：64所示的序列；

37、或；

38、(5e)cdr1包含seq?id?no：55所示的序列，cdr2包含seq?id?no：60所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：65所示的序列。

39、在某些實施方案中，所述的納米抗體或其抗原結合片段，其包含seq?id?nos：66～70中任一項所示的重鏈可變區(vhh)；或包含與seq?id?nos：66～70中任一項所示的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列。

40、在某些實施方案中，所述的納米抗體或其抗原結合片段，其包含與seq?id?nos：66～70中任一項所示的序列相比具有一個或幾個氨基酸的置換、缺失或添加的序列；優選地，所述的置換是保守置換。

41、在某些實施方案中，所述的納米抗體或其抗原結合片段，其中，所述納米抗體或其抗原結合片段是駝源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。

42、多特異性抗體

43、在第二方面，本發明提供了一種多特異性抗體，該多特異性抗體包含第一方面所述的納米抗體或其抗原結合片段，以及其他的抗體或其抗原結合片段或抗體類似物。

44、在某些優選的實施方案中，所述多特異性抗體為雙特異性抗體或三特異性抗體或四特異性抗體。

45、抗體的制備

46、本發明的第一方面所述的納米抗體或第二方面所述的多特異性抗體可以用本領域已知的各種方法來制備，例如通過基因工程重組技術來獲得。例如，通過化學合成或pcr擴增獲得編碼本發明納米抗體的重鏈可變區基因的dna分子。將所得dna分子插入表達載體內，然后轉染宿主細胞。然后，在特定條件下培養轉染后的宿主細胞，并表達本發明的納米抗體或多特異性抗體。本發明的抗原結合片段可以通過水解完整的納米抗體分子獲得。

47、在第三方面，本發明提供了一種分離的核酸分子，其編碼第一方面所述的納米抗體或其抗原結合片段或第二方面所述的多特異性抗體。

48、在第四方面，本發明提供了一種載體(例如克隆載體或表達載體)，其包含編碼第三方面所述的分離的核酸分子。在某些實施方案中，本發明的載體是例如質粒，粘粒，噬菌體等。

49、在第五方面，本發明提供了一種宿主細胞，其包含第三方面所述的分離的核酸分子或第四方面所述的載體。此類宿主細胞包括但不限于，原核細胞例如大腸桿菌細胞，以及真核細胞例如酵母細胞，昆蟲細胞，植物細胞和動物細胞(如哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、人細胞等)。

50、綴合物

51、在第六方面，本發明提供了綴合物，其包含了第一方面所述的納米抗體或其抗原結合片段、或第二方面所述的多特異性抗體、或第三方面所述的核酸分子、或第四方面所述的載體以及偶聯部分。

52、在某些實施方案中，所述偶聯部分選自蛋白標簽(protein?tag)。這類蛋白標簽是本領域熟知的，其實例包括但不限于his、flag、gst、mbp、ha、myc、gfp或生物素，并且本領域技術人員已知如何根據期望目的(例如，純化、檢測或示蹤)選自合適的蛋白標簽。

53、在某些實施方案中，所述偶聯部分選自可檢測的標記，例如酶、放射性同位素、熒光染料、發光物質或生物素。本發明所述的可檢測的標記可以是通過熒光、光譜、光化學、生物化學、免疫學、電學、光學或化學手段檢測的任何物質。這類標記是本領域熟知的，其實例包括但不限于，酶(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性同位素(例如，3h、125i、35s、14c或32p)、熒光染料(例如，異硫氰酸熒光素(fitc)、熒光素、異硫氰酸四甲基羅丹明(tritc)、藻紅蛋白(pe)、德克薩斯紅、羅丹明、量子點或花菁染料衍生物(例如cy7、alexa?750)、發光物質(例如化學發光物質，如吖啶酯類化合物)、磁珠、測熱標記物例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠，等)珠、以及用于結合上述標記物修飾的親和素(例如，鏈霉親和素)的生物素。在某些實施方案中，此類標記能夠適用于免疫學檢測(例如，酶聯免疫測定法、放射免疫測定法、熒光免疫測定法、化學發光免疫測定法等)。在某些實施方案中，可通過不同長度的接頭(linker)將如上所述的可檢測的標記連接至本發明的納米抗體或其抗原結合片段，以降低潛在的位阻。

54、在某些實施方案中，所述偶聯部分選自核素、核酸、細胞因子(例如，il-6、il-15、il-12、il-1b、il-23，等)、免疫激動劑(例如，tlr激動劑)、小分子毒素、具有結合活性多肽、蛋白、受體、配體，以及其他抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡或壞死的活性物質。

55、藥物組合物

56、在第七方面，本發明提供了一種藥物組合物，其含有本發明所述的第一方面所述的納米抗體或其抗原結合片段或其前體藥物(例如probody)、第二方面所述的多特異性抗體、第三方面所述的分離的核酸分子、第四方面所述的載體、第五方面所述的宿主細胞或第六方面所述的綴合物，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑；

57、在某些實施方案中，在所述藥物組合物中還包含另外的藥學活性劑；在某些優選的實施方案中，所述另外的藥學活性劑是具有抗腫瘤活性的藥物，例如鉑類藥物、小分子抑制劑等；某些優選的實施方案中，所述另外的藥學活性劑是增強免疫力的藥物，例如干擾素、白細胞介素；某些優選的實施方案中，所述另外的藥學活性劑是免疫治療相關藥物，例如免疫檢測點抑制劑(例如pd-1、ctla-4或pd-1/ctla-4抑制劑)或免疫系統激活劑(例如tlr、onds、cpg、lps、seb、sea或sec激活劑)；某些優選的實施方案中，所述另外的藥學活性劑是放射性物質或顯色劑。

58、用途

59、在第八方面，本發明提供了第一方面所述的納米抗體或其抗原結合片段或其前體藥物(例如probody)、第二方面所述的多特異性抗體、第三方面所述的分離的核酸分子、第四方面所述的載體、第五方面所述的宿主細胞、第六方面所述的綴合物或第七方面所述的藥物組合物在制備預防和/或治療和/或輔助治療和/或新輔助治療與msln相關的疾病的藥物中的用途。

60、在某些實施方案中，所述與msln相關的疾病為腫瘤；在某些優選的實施方案中，所述腫瘤選自實體腫瘤或血液腫瘤。

61、在某些實施方案中，所述實體腫瘤選自間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、膽管癌、大腸癌、胃癌、輸卵管癌、肺癌或結直腸癌；所述血液腫瘤包括急性髓性白血病；在某些優選的實施方案中，所述肺癌為非小細胞肺癌。

62、在某些實施方案中，所述納米抗體或其抗原結合片段、所述多特異性抗體、所述分離的核酸分子、所述載體、所述宿主細胞、所述綴合物或所述藥物組合物與另外的藥學活性劑分開、聯合、同時或相繼施用。

63、在某些實施方案中，所述另外的藥學活性劑為具有抗腫瘤活性的藥物、免疫治療相關藥物、增強免疫力的藥物或免疫系統激活劑、放射性物質或顯色劑。

64、在第九方面，本發明提供了一種用于在受試者中預防和/或治療與msln相關的疾病、和/或延遲與msln相關的疾病進展、和/或降低或抑制與msln相關的疾病復發的方法，所述方法包括向有此需要的受試者施用有效量的第七方面所述的藥物組合物。

65、在某些實施方案中，所述與msln相關的疾病為腫瘤；在某些優選的實施方案中，所述腫瘤選自實體腫瘤或血液腫瘤。

66、在某些實施方案中，所述實體腫瘤選自間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、膽管癌、大腸癌、胃癌、輸卵管癌、肺癌或結直腸癌；所述血液腫瘤包括急性髓性白血病；在某些優選的實施方案中，所述肺癌為非小細胞肺癌。

67、在某些實施方案中，其還包括向所述受試者施用第二療法，所述第二療法選自手術、化療、放療、免疫療法、基因療法、dna療法、rna療法、納米療法、病毒療法、輔助療法、細胞治療及其任意組合。

68、檢測應用

69、在第十方面，本發明提供了一種檢測樣品中msln存在或其水平的方法，其包括使用本發明所述的第一方面所述的納米抗體或其抗原結合片段、第二方面所述的多特異性抗體、第三方面所述的分離的核酸分子或第六方面所述的綴合物；

70、在某些實施方案中，所述方法是免疫學檢測，例如免疫印跡法、酶免疫測定法(例如，elisa)、化學發光免疫分析法、熒光免疫分析法或放射免疫測定法；

71、在某些實施方案中，用于所述方法的綴合物包含本發明的納米抗體或其抗原結合片段以及可檢測的標記；

72、在某些實施方案中，用于所述方法的納米抗體或其抗原結合片段帶有可檢測的標記；

73、在某些實施方案中，用于所述方法的納米抗體或其抗原結合片段不帶有可檢測的標記；因此，所述方法還可以包含使用帶有可檢測的標記的其他試劑(例如，第二抗體)來檢測本發明的納米抗體或其抗原結合片段。

74、在第十一方面，本發明提供了一種試劑盒，其包含本發明第一方面所述的納米抗體或其抗原結合片段、第二方面所述的多特異性抗體、第六方面所述的綴合物或第七方面所述的藥物組合物的診斷性或治療性試劑盒。在某些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段帶有可檢測的標記。在某些實施方案中，所述試劑盒還包括第二抗體，其特異性識別本發明的抗體或其抗原結合片段。優選地，所述第二抗體還包含可檢測的標記。

75、在第十二方面，本發明提供了第一方面所述的納米抗體或抗原結合片段、第二方面所述的多特異抗體、第三方面所述的核酸分子、第六方面所述的綴合物在制備用于腫瘤診斷或鑒別的試劑盒中的用途。

76、在某些實施方案中，所述腫瘤選自實體腫瘤或血液腫瘤；優選地，所述實體腫瘤選自間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、膽管癌、大腸癌、胃癌、輸卵管癌、肺癌或結直腸癌；所述血液腫瘤包含急性髓性白血病；在某些優選的實施例中，所述肺癌為非小細胞肺癌。

77、術語定義

78、在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的病毒學、生物化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。

79、當本文使用術語“例如”、“如”、“諸如”、“包括”、“包含”時，這些術語將不被認為是限制性術語，而將被解釋為表示“但不限于”或“不限于”。

80、除非本文另外指明或根據上下文明顯矛盾，否則術語“一個”和“一種”以及“該”和類似指稱物在描述本發明的上下文中(尤其在以下權利要求的上下文中)應被解釋成覆蓋單數和復數。

81、如本文中所使用的，術語“駝源抗體”是指，經免疫接種或抗原入侵的駱駝科動物(包括駱駝(camel)、羊駝(alpaca)和大羊駝(l.glama))所產生的針對該抗原的抗體。本領域技術人員已知，在駱駝科動物所產生的抗體中存在缺失輕鏈的“重鏈抗體(hcab)”，這種抗體只包含一個重鏈可變區(vhh)和兩個常規的ch2與ch3區，并且單獨克隆并表達出來的vhh區具有很好的結構穩定性與抗原結合活性，vhh是目前己知的可結合目標抗原的最小單位。

82、如本文中所使用的，術語“納米抗體”具有本領域技術人員通常理解的含義，其是指由單個單體可變抗體結構域(例如單個重鏈可變區)所組成的抗體片段，通常來源于重鏈抗體(例如駱駝科動物抗體或鯊魚抗體)的可變區。典型地，納米抗體由4個框架區和3個互補性決定區組成，具有fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的結構。納米抗體可在n端或c端處截短以使其僅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架區中的一個或兩個，只要其實質上保持抗原結合和特異性即可。納米抗體也稱為單域抗體(sdab)，兩者可互換使用。

83、如本文中所使用的，術語納米抗體的“抗原結合片段”是指包含納米抗體的片段的多肽，其保持特異性結合納米抗體所結合的相同抗原的能力，和/或與納米抗體競爭對抗原的特異性結合，其也被稱為“抗原結合部分”。通常參見，fundamental?immunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版,raven?press,n.y.(1989)，其以其全文通過引用合并入本文，用于所有目的。可通過重組dna技術或者通過本發明納米抗體的酶促或化學斷裂產生本發明的納米抗體的抗原結合片段。在一些實施方案中，所述納米抗體的“抗原結合片段”與全長納米抗體相比可在n端或c端截短以使其僅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架區中的一個或兩個，只要其實質上保持抗原結合和特異性即可。

84、可使用本領域技術人員已知的常規技術(例如，重組dna技術或酶促或化學斷裂法)從給定的納米抗體(例如本發明提供的納米抗體)獲得納米抗體的抗原結合片段，并且以與用于完整納米抗體的方式相同的方式就特異性篩選納米抗體的抗原結合片段。

85、在本文中，除非上下文明確指出，否則當提及術語“納米抗體”時，其不僅包括完整的納米抗體，而且包括納米抗體的抗原結合片段。

86、如本文中所使用的，術語“互補決定區”或“cdr”是指抗體可變區中負責抗原結合的氨基酸殘基。在納米抗體中含有三個cdr，命名為cdr1、cdr2和cdr3。這些cdr的精確邊界可根據本領域已知的各種編號系統進行定義，例如可按照kabat編號系統(kabat?et?al.,sequences?of?proteins?of?immunological?interest,5th?ed.public?health?service,national?institutes?of?health,bethesda,md.,1991)、chothia編號系統(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature?342:878-883)、imgt編號系統(lefranc?et?al.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)、abm編號系統(martin?acr，cheetham?jc，rees?ar(1989)modelling?antibody?hypervariable?loops:a?combinedalgorithm.proc?natl?acad?sci?usa?86:9268–9272)或contact編號系統(maccallum?etal.,(1996).antibody-antigen?interactions:contact?analysis?and?binding?sitetopography.journal?of?molecular?biology，262(5)，732–745)中的定義。對于給定的納米抗體，本領域技術人員將容易地鑒別各編號系統所定義的cdr。并且，不同編號系統之間的對應關系是本領域技術人員熟知的(例如，可參見lefranc?et?al.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)。

87、如本文中所使用的，術語“框架區”或“fr”殘基是指，抗體可變區中除了如上定義的cdr殘基以外的那些氨基酸殘基。

88、如本文中所使用的，術語“人源化抗體”是指，經基因工程改造的非人源抗體，其氨基酸序列經修飾以提高與人源抗體的序列的同源性。通常而言，人源化抗體的全部或部分cdr區來自于非人源抗體(供體抗體)，全部或部分的非cdr區(例如，可變區fr和或恒定區)來自于人源免疫球蛋白(受體抗體)。人源化抗體通常保留了供體抗體的預期性質，包括但不限于，抗原特異性、親和性、反應性、提高免疫細胞活性的能力、增強免疫應答的能力等。供體抗體可以是有預期性質(例如，抗原特異性、親和性、反應性、提高免疫細胞活性的能力和/或增強免疫應答的能力)的小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物(例如，食蟹猴)抗體。

89、如本文中所使用的，術語“特異性結合”是指，兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。特異性結合相互作用的強度或親和力可以該相互作用的平衡解離常數(kd)或半最大效應濃度(ec50)表示。

90、兩分子間的特異性結合性質可使用本領域公知的方法進行測定。一種方法涉及測量抗原結合位點或抗原復合物形成和解離的速度。“結合速率常數”(ka或kon)和“解離速率常數”(kdis或koff)兩者都可通過濃度及締合和解離的實際速率而計算得出(參見malmqvist?m,nature,1993,361:186-187)。kdis或kon的比率等于解離常數kd(參見davies等人,annual?rev?biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法測量kd、kon和kdis值。

91、如本文中所使用的，術語“載體”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運載工具。當載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達時，載體稱為表達載體。載體可以通過轉化、轉導或者轉染導入宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中獲得表達。載體是本領域技術人員公知的，包括但不限于：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體，例如酵母人工染色體(yac)、細菌人工染色體(bac)或p1來源的人工染色體(pac)；噬菌體如λ噬菌體或m13噬菌體及動物病毒等。可用作載體的動物病毒包括但不限于，逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如sv40)。一種載體可以含有多種控制表達的元件，包括但不限于，啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有復制起始位點。

92、如本文中所使用的，術語“宿主細胞”是指，可用于導入載體的細胞，其包括但不限于，如大腸桿菌或枯草菌等的原核細胞，如酵母細胞或曲霉菌等的真菌細胞，如s2果蠅細胞或sf9等的昆蟲細胞，或者如纖維原細胞，cho細胞，cos細胞，nso細胞，hela細胞，bhk細胞，hek?293細胞或人細胞等的動物細胞。

93、如本文中所使用的，術語“同一性”用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。為了測定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的百分比同一性，為了最佳比較目的將序列進行比對(例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以與第二氨基酸或核酸序列最佳比對)。然后比較對應氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置被與第二序列中的對應位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據時，則分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的百分比同一性是由序列所共享的同一性位置的數目的函數(即，百分比同一性＝同一重疊位置的數目/位置的總數×100％)。在某些實施方案中，兩個序列長度相同。

94、兩個序列之間的百分比同一性的測定還可使用數學算法來實現。用于兩個序列的比較的數學算法的一個非限制性實例是karlin和altschul的算法，1990,proc.natl.acad.sci.u.s.a.87:2264-2268，如同karlin和altschul,1993,proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:5873-5877中改進的。將這樣的算法整合至altschul等人,1990,j.mol.biol.215:403的nblast和xblast程序中。

95、如本文中所使用的，術語“保守置換”意指不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白或多肽的預期性質的氨基酸置換。例如，可通過本領域內已知的標準技術例如定點誘變和pcr介導的誘變引入保守置換。保守氨基酸置換包括用具有相似側鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換，例如用在物理學上或功能上與相應的氨基酸殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學性質，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進行的置換。已在本領域內定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，優選用來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基替代相應的氨基酸殘基。鑒定氨基酸保守置換的方法在本領域內是熟知的(參見，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人protein?eng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.set?usa?94:412-417(1997)，其通過引用并入本文)。

96、本文涉及的二十個常規氨基酸的編寫遵循常規用法。參見例如，immunology-asynthesis(2nd?edition,e.s.golub?and?d.r.gren,eds.,sinauer?associates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本發明中，術語“多肽”和“蛋白質”具有相同的含義且可互換使用。并且在本發明中，氨基酸通常用本領域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。

97、如本文中所使用的，術語“藥學上可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領域公知的(參見例如remington's?pharmaceutical?sciences.edited?by?gennaro?ar,19thed.pennsylvania:mack?publishing?company,1995)，并且包括但不限于：ph調節劑、表面活性劑、佐劑、離子強度增強劑、稀釋劑、維持滲透壓的試劑、延遲吸收的試劑、防腐劑。

98、如本文中所使用的，術語“預防”是指，為了阻止或延遲疾病或病癥或癥狀在受試者體內的發生而實施的方法。如本文中所使用的，術語“治療”是指，為了獲得有益或所需臨床結果而實施的方法。為了本發明的目的，有益或所需的臨床結果包括(但不限于)減輕癥狀、縮小疾病的范圍、穩定(即，不再惡化)疾病的狀態，延遲或減緩疾病的發展、改善或減輕疾病的狀態、和緩解癥狀(無論部分或全部)，無論是可檢測或是不可檢測的。此外，“治療”還可以指，與期望的存活期相比(如果未接受治療)，延長存活期。

99、如本文中使用的，術語“受試者”是指哺乳動物，例如靈長類哺乳動物，例如人。在某些實施方案中，所述受試者(例如人)患有腫瘤(例如表達msln的腫瘤)，或者，具有患有上述疾病的風險。

100、術語“癌癥”、“腫瘤”可互換使用，其是指以體內異常細胞的不受控生長為特征的一大類疾病。不受管制的細胞分裂可能導致惡性腫瘤或侵入鄰近組織的細胞的形成，并可能通過淋巴系統或血流轉移到身體的遠端部位。癌癥包括良性和惡性癌癥以及休眠腫瘤或微轉移。癌癥也包括血液學惡性腫瘤。

101、在本文中，“組合”包括可以分開施用的療法，例如針對單獨投藥分開調配(例如，可以在試劑盒中提供)，及可以按單一調配物(亦即“共調配物”)一起施用的療法。在某些實施方案中，本發明的抗msln納米抗體或其抗原結合片段可依次序施用。在其他實施方案中，抗msln納米抗體或其抗原結合片段可同時施用。本發明的抗msln納米抗體或其抗原結合片段可以與至少一種其他(活性)藥劑以任何方式組合使用。

102、發明的有益效果

103、本發明的特異性結合msln的納米抗體或抗原結合片段與msln具有良好的結合親和力。因此，本發明的特異性結合msln的納米抗體或抗原結合片段或多特異性抗體適用于預防和/或治療與msln相關的疾病或病癥，具有重大的臨床價值。