生產1,4-丁二醇的微生物及利用其的1,4-丁二醇的生產方法與流程

本發明涉及生產1,4-丁二醇的微生物及利用其的1,4-丁二醇的生產方法。

背景技術：

1、1,4-丁二醇(1,4-butanediol)作為溶劑、聚合物中間體、精細化學中間物質等用于整個化學產業。1,4-丁二醇主要通過使乙炔和甲醛反應后加氫的工序來生產，除此以外，也可以由馬來酸酐、環氧丙烷生產，但由于隨著化石原料的使用而產生的溫室氣體和廢棄物，加之不穩定的國際油價，具有原料供應存在差池、生產費用增加等問題。

2、為了完善這樣的化學生產工序，近年來，開發了一種以生物質為原料且用生物學方法生產1,4-丁二醇的低費用及環保的工序。通常情況下，在微生物的代謝過程中，通過α-酮戊二酸或琥珀酰-coa生產1,4-丁二醇。但是，在利用微生物的1,4-丁二醇的生產工序中，微生物的代謝過程中不僅產生1,4-丁二醇，還產生不需要的副產物，并且存在諸如表現出相對較低的生產收率等限制。因此，為了克服這樣的限制，不斷嘗試致力于開發利用基因工學技術而可以高收率生產1,4-丁二醇的微生物。

3、現有技術文獻

4、專利文獻

5、(專利文獻1)歐洲授權專利第3050970號

6、(專利文獻2)歐洲授權專利第2782893號

技術實現思路

1、本發明的目的在于提供生產1,4-丁二醇的微生物。

2、另外，本發明的目的在于提供利用上述微生物的1,4-丁二醇的生產方法。

3、現有已知的微生物中的1,4-丁二醇生產途徑是，在相應過程中從葡萄糖(glucose)生產的丙酮酸(pyruvate)氧化為乙酰-coa(acetyl-coa)，在tca循環中合成為α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)和琥珀酰-coa(succinyl-coa)，在這里，經過α-酮戊二酸的脫羧反應或琥珀酰-coa的還原反應制造4-羥基丁酸(4-hydroxybutyric?acid)，由此最終生產1,4-丁二醇。

4、但是，本發明的發明人構建了使用鳥氨酸(ornithine)代替α-酮戊二酸、琥珀酰-coa作為起始物質的新的1,4-丁二醇生產途徑，通過確認具有這樣的生產途徑的微生物可以通過高的酶活性有效地生產1,4-丁二醇，從而完成了本發明。

5、本發明的一個方式提供基于鳥氨酸生產1,4-丁二醇的微生物。

6、本發明中使用的“微生物”是指原核細胞或真核生物，包括細菌、酵母、真菌等。

7、本發明中使用的“生產1,4-丁二醇的微生物”是指參與1,4-丁二醇生產途徑的酶或包含編碼其的基因的微生物。本發明中的基于鳥氨酸生產1,4-丁二醇的途徑是從未在目前已知的微生物中確認過的生產途徑，因此本發明中的生產1,4-丁二醇的微生物(以下稱為“1,4-丁二醇生產微生物”)是指對編碼參與鳥氨酸-1,4-丁二醇生產途徑的酶的基因通過內在基因序列的修飾(核酸缺失、添加、置換等)、外源基因的基因組內插入和/或導入包含外源基因的質粒(載體)而修飾的微生物。在本發明中，“修飾的微生物”可與“變異微生物”、“變異菌株”、“重組微生物”、“重組菌株”、“遺傳性修飾的微生物”或“遺傳性修飾的菌株”同義混用。作為與之相反的概念，“修飾前的微生物”、“修飾前的菌株”、“非變異微生物”、“非變異菌株”或“親本菌株”是指由于自然或人為因素經遺傳性變異轉化前的微生物，例如，是指沒有作用于鳥氨酸-1,4-丁二醇生產途徑的酶而不/無法生產1,4-丁二醇的微生物。

8、根據本發明的一具體例，上述1,4-丁二醇生產微生物可以具有：將鳥氨酸轉化為4-氨基丁酰胺(4-butaneamide)的酶反應、將4-氨基丁酰胺轉化為4-氨基丁酸(4-aminobutyric?acid)的酶反應、將4-氨基丁酸轉化為琥珀酸半醛(succinatesemialdehyde)的酶反應、將琥珀酸半醛轉化為4-羥基丁酸(4-hydroxybutyric?acid)的酶反應、以及將4-羥基丁酸轉化為1,4-丁二醇(1,4-butanediol)的酶反應。

9、根據本發明的一具體例，對上述將鳥氨酸轉化為4-氨基丁酰胺的酶反應進行催化的酶可以為由davb基因編碼的賴氨酸2-單加氧酶(lysine2-monooxygenase)。

10、根據本發明的一具體例，對上述將4-氨基丁酰胺轉化為4-氨基丁酸(4-aminobutyric?acid)的酶反應進行催化的酶可以為由dava基因編碼的5-氨基戊酰胺酶(5-aminovaleramidase)。

11、根據本發明的一具體例，對上述將4-氨基丁酸轉化為琥珀酸半醛(succinatesemialdehyde)的酶反應進行催化的酶可以為由gabt基因編碼的γ-氨基丁酸轉氨酶(gamma-aminobutyrate?aminotransferase)。

12、根據本發明的一具體例，對上述將琥珀酸半醛轉化為4-羥基丁酸(4-hydroxybutyric?acid)的酶反應進行催化的酶可以為由yahk基因編碼的醇脫氫酶(alcohol?dehydrogenase)。

13、根據本發明的一具體例，對上述將4-羥基丁酸轉化為1,4-丁二醇(1,4-butanediol)的酶反應進行催化的酶可以為由yahk基因編碼的醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase)或由car基因編碼的羧酸還原酶(carboxylic?acid?reductase)。

14、上述羧酸還原酶可以通過由sfp基因編碼的4'-磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(4'-phosphopantetheinyl?transferase)激活。

15、這樣的1,4-丁二醇生產微生物包含的賴氨酸2-單加氧酶、5-氨基戊酰胺酶、γ-氨基丁酸轉氨酶、醇脫氫酶和羧酸還原酶是在修飾前的微生物中不存在的酶。此外，上述4'-磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶可以存在或不存在于修飾前的微生物。

16、根據本發明的一具體例，上述酶可以利用外源基因的導入。

17、更具體而言，上述酶通過將選自存在于通常的微生物中的davb、dava、gabt、yahk、car和sfp中的基因或與其具有實質同一性的序列人為地導入1,4-丁二醇生產微生物，從而可以催化用于由鳥氨酸生產1,4-丁二醇的酶的表達和酶反應。

18、本發明中使用的“實質同一性”是指在將各個基因序列，即堿基序列或核苷酸序列和任意的其它核苷酸序列以最大程度對應的方式對齊而進行分析時，上述任意的其它核苷酸序列和各個核苷酸序列具有70％以上、80％以上、90％以上或98％以上的序列同源性。

19、根據本發明的一具體例，編碼上述酶的基因davb、dava、gabt、yahk、car和sfp可以來源于本技術領域中公知的微生物，微生物的種類沒有特別限定。

20、更具體而言，上述酶的基因可以來源于選自大腸桿菌(escherichia?coli)、惡臭假單胞菌(pseudomonas?putida)、谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)、膿腫分枝桿菌(mycobacterium?abscessus)、枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、鮑曼不動桿菌(acinetobacter?baumannii)、棕色固氮菌(azotobacter?vinelandii)、需鹽色鹽桿菌(chromohalobacter?salexigens)、克氏檸檬酸桿菌(citrobacter?koseri)、楊氏檸檬酸桿菌(citrobacter?youngae)、陰溝腸桿菌(enterobacter?cloacae)、水油海桿菌(marinobacter?aquaeolei)、海洋單胞菌(marinomonas?mediterranea)、菠蘿泛菌(pantoea?ananatis)、游海假交替單胞菌(pseudoalteromonas?haloplanktis)、羅氏真養菌(ralstonia?eutropha)、腐敗希瓦氏菌(shewanella?putrefaciens)和脫氮硫桿菌(thiobacillus?denitrificans)中的1種以上的微生物。

21、例如，上述davb基因可以由seq?id?no:1的堿基序列表示或者可以由seq?id?no:2的氨基酸序列編碼，但并不限定于此。

22、上述dava基因可以由seq?id?no:3的堿基序列表示或者可以由seq?id?no:4的氨基酸序列編碼，但并不限定于此。

23、上述gabt基因可以由seq?id?no:5的堿基序列表示或者可以由seq?id?no:6的氨基酸序列編碼，但并不限定于此。

24、上述yahk基因可以由seq?id?no:7的堿基序列表示或者可以由seq?id?no:8的氨基酸序列編碼，但并不限定于此。

25、上述car基因可以由seq?id?no:9的堿基序列表示或者可以由seq?id?no:10的氨基酸序列編碼，但并不限定于此。

26、上述sfp基因可以由seq?id?no:11的堿基序列表示或者可以由seq?id?no:12的氨基酸序列編碼，但并不限定于此。

27、根據本發明的1,4-丁二醇生產微生物可以通過將davb、dava、gabt、yahk、car和sfp基因全部包含或個別包含的一個以上的載體導入或轉化到宿主細胞中而制造。

28、本發明中所使用的“載體(vector)”是指作為用于向宿主細胞傳遞、表達目標基因的手段所使用的所有類型的核酸序列轉運結構體。除非另有說明，否則上述載體可以是指使擔載的核酸序列插入宿主細胞基因組內進行表達和/或獨立進行表達。這樣的載體為了表達基因插入物而包括可操作地連接的必需的調控元件，“可操作地連接的(operablylinked)”是指目標基因與其調控序列彼此功能性地結合并以能夠進行基因表達的方式連接，“調控元件”包括用于實施轉錄的啟動子、用于調控轉錄的任意的操縱子序列、編碼合適的mrna核糖體結合位點的序列、以及調控轉錄和翻譯的終止的序列。

29、本發明中所使用的載體只要能夠在宿主細胞中進行復制就沒有特別限定，可以利用本技術領域中已知的任意的載體。作為上述載體的一個例子，可以舉出天然狀態或重組狀態的質粒、粘粒、病毒和噬菌體。例如，作為噬菌體載體或粘粒載體，有pwe15、m13、λmbl3、λmbl4、λixii、λashii、λapii、λt10、λt11、charon4a、charon21a等，作為質粒載體，有pbr系、puc系、pbluescriptii系、pgem系、ptz系、pcl系和pet系等，但并不限定于此。

30、上述載體可以代表性地構建為用于克隆的載體或用于表達的載體。用于表達的載體可以使用本技術領域中用于在植物、動物或微生物中表達外源基因或蛋白質的常規載體，并且可以通過本技術領域中公知的各種方法而構建。

31、重組載體可以以原核細胞或真核細胞為宿主而構建。例如，在所使用的載體為表達載體且以原核細胞為宿主時，通常包含可以使轉錄進行的強啟動子(例如，plλ啟動子、cmv啟動子、trp啟動子、lac啟動子、tac啟動子、t7啟動子)、用于翻譯起始的核糖體結合位點和轉錄/翻譯終止序列。在以真核細胞為宿主時，在載體所包含的真核細胞中啟動的復制起點包括f1復制起點、sv40復制起點、pmb1復制起點、腺病毒復制起點、aav復制起點和bbv復制起點等，但并不限定于此。此外，可以利用源于哺乳動物細胞的基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或者源于哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子、疫苗病毒7.5k啟動子、sv40啟動子、巨細胞病毒啟動子、hsv的tk啟動子)，并且通常具有多聚腺苷酸化序列作為轉錄終止序列。

32、上述重組載體可以包括選擇標記(selection?marker)，上述選擇標記用于篩選利用載體轉化的轉化體(宿主細胞)，在經上述選擇標記處理的培養基中只有表達選擇標記的細胞可以生存，因此能夠篩選轉化的細胞。作為代表性的例子，上述選擇標記有卡那霉素、鏈霉素、氯霉素等，但并不限定于此。

33、通過將重組載體插入宿主細胞，從而可以制作轉化體，上述轉化體可以通過將重組載體導入合適的宿主細胞而得到。宿主細胞是可以穩定且連續地克隆或表達上述表達載體的細胞，也可以利用本技術領域中公知的任何宿主細胞。

34、在為了制作重組微生物而對原核細胞進行轉化時，作為宿主細胞，可以利用e.coli?jm109、e.coli?bl21、e.coli?rr1、e.coli?le392、e.coli?b、e.coli?x?1776、e.coli?w3110、e.coli?xl1-blue之類的大腸桿菌屬菌株；枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌之類的芽孢桿菌屬菌株；棒狀桿菌屬菌株；鼠傷寒沙門氏菌、粘質沙雷氏菌和假單胞菌種之類的各種腸道細菌和菌株等，但并不限定于此。

35、在為了制作重組微生物而對真核細胞進行轉化時，作為宿主細胞，可以利用酵母(例如，釀酒酵母)、昆蟲細胞、植物細胞和動物細胞，例如，sp2/0、cho?k1、cho?dg44、per.c6、w138、bhk、cos7、293、hepg2、huh7、3t3、rin、mdck細胞株等，但并不限定于此。

36、本發明中所使用的“轉化(transformation)”是指將外源dna導入宿主細胞內而人為引起基因改變的現象，“轉化體(transformat)”是指導入有外源dna并穩定維持目標基因的表達的宿主細胞。

37、在上述轉化中，根據宿主細胞而選擇合適的載體導入技術，從而可以在宿主細胞內表達目標基因或包含其的重組載體。例如，載體導入可以通過電穿孔法(electroporation)、熱沖擊(heat-shock)、磷酸鈣(capo4)沉淀、氯化鈣(cacl2)沉淀、顯微注射法(microinjection)、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、陽離子脂質體法、乙酸鋰-dmso法、或者它們的組合而實施，但并不限定于此。轉化的基因只要可以在宿主細胞內表達，就可以被包括在內，而不限制于將其插入宿主細胞的染色體內或者位于染色體外。

38、上述轉化體包括在生物體內或試管內利用根據本發明的重組載體進行了轉染、轉化或感染的細胞，并且可以與重組宿主細胞、重組細胞或重組微生物作為相同的用語被使用。

39、根據本發明的一具體例，上述轉化體作為1,4-丁二醇生產微生物，只要是本技術領域中公知的微生物，就沒有特別限定。

40、更具體而言，上述1,4-丁二醇生產微生物可以為埃希菌(escherichia)屬或棒狀桿菌(corynebacterium)屬菌株。

41、作為上述埃希菌屬菌株，有大腸桿菌(escherichia?coli)、艾伯特埃希菌(escherichia?albertii)、蟑螂埃希菌(escherichia?blattae)、弗格森埃希菌(escherichia?fergusonii)、赫氏埃希菌(escherichia?hermannii)、傷口埃希菌(escherichia?vulneris)等，但并不限定于此。

42、作為上述棒狀桿菌屬菌株，棒狀桿菌屬菌株可以為谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)、生乳棒狀桿菌(corynebacterium?crudilactis)、沙漠棒狀桿菌(corynebacterium?deserti)、帚石南棒狀桿菌(corynebacterium?callunae)、蘇那棒狀桿菌(corynebacterium?suranareeae)、油橄欖棒狀桿菌(corynebacteriumlubricantis)、道桑棒狀桿菌(corynebacterium?doosanense)、高效棒狀桿菌(corynebacterium?efficiens)、烏氏棒狀桿菌(corynebacterium?uterequi)、停滯棒狀桿菌(corynebacterium?stationis)、帕氏棒狀桿菌(corynebacterium?pacaense)、奇棒狀桿菌(corynebacterium?singulare)、腐殖質還原棒狀桿菌(corynebacteriumhumireducens)、海洋棒狀桿菌(corynebacterium?marinum)、耐鹽棒狀桿菌(corynebacterium?halotolerans)、蝶科棒狀桿菌(corynebacterium?spheniscorum)、弗氏棒狀桿菌(corynebacterium?freiburgense)、紋帶棒狀桿菌(corynebacteriumstriatum)、犬棒狀桿菌(corynebacterium?canis)、產氨棒狀桿菌(corynebacteriumammoniagenes)、腎棒狀桿菌(corynebacterium?renale)、污染棒狀桿菌(corynebacteriumpollutisoli)、漢氏棒狀桿菌(corynebacterium?imitans)、里海棒狀桿菌(corynebacterium?caspium)、睪丸棒狀桿菌(corynebacterium?testudinoris)、假性棒狀桿菌(corynebacaterium?pseudopelargi)、微黃棒狀桿菌(corynebacterium?flavescens)等，但并不限定于此。

43、本發明的另一方式提供1,4-丁二醇的生產方法，其包括以下步驟：在培養基中培養上述微生物的步驟；以及從上述微生物或培養微生物的培養基中回收1,4-丁二醇的步驟。

44、上述培養可以根據本技術領域中已知的合適的培養基和培養條件而進行，只要是本領域技術人員就可以容易地調整培養基和培養條件來使用。具體而言，上述培養基可以是液體培養基，但并不限定于此。培養方法可以包括例如分批式培養(batch?culture)、連續式培養(continuous?culture)、補料分批式培養(fed-batch?culture)或者它們的組合培養，但并不限定于此。

45、根據本發明的一具體例，上述培養基必須以合適的方式滿足特定菌株的要求，可以由本領域技術人員適當地進行修飾。關于埃希菌屬菌株和棒狀桿菌屬菌株的培養基，可以參考公知的文獻(manual?of?methods?for?general?bacteriology.american?societyfor?bacteriology.washington?d.c.,usa,1981)，但并不限定于此。

46、根據本發明的一具體例，培養基中可以包含各種碳源、氮源和微量元素成分。作為可以使用的碳源，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉、纖維素之類的糖及碳水化合物；大豆油、葵花籽油、蓖麻籽油、椰子油等油及脂肪；棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸之類的脂肪酸；甘油、乙醇之類的醇；乙酸之類的有機酸。這些物質可以單獨使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作為可以使用的氮源，可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉湯、麥芽提取物、玉米漿、豆粕和尿素或者無機化合物，例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。氮源同樣可以單獨使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作為可以使用的磷的供應源，可以包括磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應的含鈉的鹽，但并不限定于此。此外，培養基可以含有生長所需要的硫酸鎂或硫酸鐵之類的金屬鹽，但并不限定于此。除此以外，可以包含氨基酸和維生素之類的必要生長物質。此外，可以使用適合培養基的前體。上述培養基或單個成分可以在培養過程中通過適當的方式分批或連續添加到培養液中，但并不限定于此。

47、根據本發明的一具體例，在培養過程中，可以將氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸之類的化合物以適當的方式添加到微生物培養液中來調整培養液的ph。此外，在培養過程中，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯之類的消泡劑來抑制氣泡產生。進一步，為了維持培養液的有氧狀態，可以向培養液內注入氧氣或者含氧氣的氣體(例如空氣)。培養液的溫度通常可以為20℃至45℃，例如，可以為25℃至40℃。培養時間可以持續到有用物質獲得期望的生產量為止，例如，可以為10至160小時。

48、根據本發明的一具體例，在上述從培養的變異株和培養變異株的培養基中回收1,4-丁二醇的步驟中，可以根據培養方法并利用本技術領域中公知的合適的方法，從培養基中收集或回收所生產的1,4-丁二醇。例如，可以使用離心分離、過濾、提取、噴霧、干燥、蒸發、沉淀、結晶化、電泳、分級溶解(例如，硫酸銨沉淀)、色譜法(例如，離子交換、親和性、疏水性和尺寸排阻)等方法，但并不限定于此。

49、根據本發明的一具體例，在回收1,4-丁二醇的步驟中，可以將培養基低速離心分離而去除生物質，可以將得到的上清液通過離子交換色譜法而分離。

50、根據本發明的一具體例，在上述回收1,4-丁二醇的步驟中，可以包括純化1,4-丁二醇的工序。

51、根據本發明的微生物與自然中存在的微生物不同，使用鳥氨酸作為碳源，從而可以有效地生產1,4-丁二醇。