一種重組藍藻及其生物催化生產槲皮素的方法與流程

本發明涉及生物領域，特別是涉及一種重組藍藻及其生物催化生產槲皮素的方法。

背景技術：

1、槲皮素是自然界中一種重要的黃酮類化合物，因其具有多種生物學活性例如抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等，被廣泛應用于食品，醫藥以及工業領域。目前槲皮素的工業化生產仍需依賴于植物提取，然而原料稀缺、提取難度大、產率較低等因素阻礙了其大規模生產。化學合成法不僅成本高，且合成過程會產生污染。生物合成法成為有發展潛力的解決方案，槲皮素的生物合成依賴于多種酶的共同催化作用。酪氨酸氨解酶可將酪氨酸轉化為對香豆酸，隨后，在4-香豆酰輔酶?a?連接酶（4cl）的催化作用下，形成4-香豆酰基輔酶a分子。接著，查爾酮合酶（chs）將4-香豆酰基輔酶a和丙二酰輔酶a?縮合成柚皮素查爾酮，它是多種黃酮類衍生物的基本骨架（appl.?microbiol.?biotechnol.,?2011,?91,?949-956）。然后，在查爾酮異構酶（chi）的催化下生成柚皮素，作為黃酮醇類的通用前體。柚皮素在黃酮3-羥化酶（f3h）的作用下可以生成二氫山柰酚，接著在黃酮3′-羥化酶(f3′?h)?(植物細胞色素p450?單加氧酶家族)的催化下繼續生成二氫槲皮素，最后通過黃酮醇合成酶?1（fls1）的作用合成槲皮素（nat.?prod.?rep.,2009,?26,1001-1043）（圖1）。

2、隨著合成生物學的快速發展，近些年來利用微生物工程菌株催化合成槲皮素取得了一些進展。對香豆酸是木質素的主要水解物，可以由農林廢棄生物質分解得到。利用全細胞催化劑將可再生資源木質素解聚單體對香豆酸轉化為槲皮素提供了一條經濟可持續的合成路徑。例如：leonard等人以生產對香豆酸的大腸桿菌為底盤細胞，引入6種植物來源的生物合成酶（即?f3'5h，4cl,chs,?chi,?fht,?fls）實現了槲皮素在原核微生物中的生物合成（metab.?eng.,?2006,?8,?172-181）。trantas等人以釀酒酵母作為底盤細胞，過表達來自楊樹（poplar）的苯丙氨酸氨裂合酶（pal），來自大豆?(glycine?max)?的肉桂酸?4-羥化酶（c4h）、4cl、chs、chi、f3h、f3′h和來自馬鈴薯(solanum?tuberosum)的fls，同時外源添加對香豆酸作為底物，成功實現了槲皮素在真核微生物中的生物合成，產量為0.26?mg/l（metab.?eng.,?2009,?11，?355-366）。但受限于植物源氧化還原酶難以在大腸桿菌等大多數原核微生物中異源表達，同時還原力和能量不足以支撐天然產物的合成，因此異源生物催化對香豆酸為槲皮素的效率和產量處在較低水平（<20?mg/l）。例如槲皮素合成關鍵酶f3’h?屬于植物細胞色素?p450?單加氧酶家族。在大腸桿菌中表達該類酶時，缺少輔助因子p450?還原酶，并且需要大量還原力和能量的驅動（nadph和atp）。另一方面，利用大腸桿菌和釀酒酵母等傳統工業微生物為底盤制備全細胞生物催化劑通常需要依賴有機碳源和氮源，如葡萄糖和酵母粉，較高原料成本限制了其應用。因此，尋求低成本、綠色、經濟可持續的槲皮素生產方法是亟待解決的問題。

3、隨著我國可持續發展戰略的加速推進及二氧化碳減排的迫切需求，綠色生物制造產業正在全面拓展與提升。將光能自養微生物藍藻作為微生物細胞工廠在生產高附加值化學品的同時可以減緩溫室氣體排放，成為近年來的研究熱點（curr.?opin.?biotechnol.2022,?73,?314-322）。目前，藍藻已經被用于生產大宗化學品，生物燃料，高附加值產品（j.biol.?chem.,?2018,293,?5044-5052），例如乳酸，乙醇，同時也被用來直接將co2轉化為天然產物（green?chem.,2016,?18,3537）。藍藻生產天然產物具有獨到的優勢，其可以利用太陽能產生大量的?atp?和?nadph，從而利用這些化學能和還原力推動天然產物的合成。另一方面，藍藻細胞內擁有類囊體膜系統，使得植物源酶可以功能性的表達。但是，藍藻有限的碳固定效率使得天然產物的產量相對較低。將藍藻作為全細胞生物催化劑將可再生資源衍生物（對香豆酸等）轉化為天然產物有望獲得更高的產量，然而，以藍藻為全細胞生物催化劑的研究卻很少（nat.?synth.?2023,?https://doi.org/10.1038/s44160-023-00331-5）。因此，以光合微生物為底盤制備全細胞生物催化劑將為天然產物生產帶來了新契機。目前，以藍藻為新型全細胞催化劑，用于將對香豆酸高效轉化為天然產物槲皮素還未有研究。

技術實現思路

1、為解決上述技術問題，本發明提出了一種實現輻致暗化漂白的方法及系統。

2、本發明的目的通過以下技術方案實現：

3、一種重組藍藻，所述重組藍藻中含有4-香豆酰輔酶?a?連接酶編碼基因at4cl、查爾酮合酶編碼基因cschs、查爾酮異構酶編碼基因mschi、黃酮3-羥化酶編碼基因gmf3h，黃酮3′-羥化酶編碼基因gmf3'h、和黃酮醇合成酶編碼基因stfls。

4、進一步的改進，所述所述4-香豆酰輔酶?a?連接酶編碼基因（at4cl）的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

5、進一步的改進，所述查爾酮合酶編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

6、進一步的改進，所述查爾酮異構酶編碼基因mschi的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

7、進一步的改進，所述黃酮3-羥化酶編碼基因的核苷酸如seq?id?no.4所示。

8、進一步的改進，所述黃酮3′-羥化酶編碼基因gmf3'h的核苷酸如seq?id?no.5所示。

9、進一步的改進，所述黃酮醇合成酶編碼基因stfls的核苷酸如seq?id?no.6所示。

10、進一步的改進，所述重組藍藻為細長聚球藻pcc7942；所述4-香豆酰輔酶?a?連接酶編碼基因at4cl、查爾酮合酶編碼基因cschs、查爾酮異構酶編碼基因mschi、黃酮3-羥化酶編碼基因gmf3h，黃酮3′-羥化酶編碼基因gmf3'h、和黃酮醇合成酶編碼基因stfls均連接在psyn_6質粒上，且通過通過rbs序列連接，并置于psba2啟動子控制下。

11、一種重組藍藻生物催化生產槲皮素的方法，所述重組藍藻以香豆酸為底物生產得到槲皮素；所述重組藍藻如上所示。

12、進一步的改進，步驟一、將重組藍藻接種到含有20?mg/ml壯觀霉素的bg11固體培養基上，32℃、150?μe/s/m2的光強度下連續光照培養10?15天，得到菌株；

13、步驟二、種子培養：菌株接種到含有20?mg/ml壯觀霉素的5?ml?bg液體培養基中進行菌株活化，30℃、150?μe/s/m2的光強度下連續光照培養7?10天，制得種子；

14、步驟三、將種子按照體積比1%的接種量接種到含有20?mg/ml壯觀霉素的50?ml?bg液體培養基中進行菌株培養，32℃、150?μe/s/m2的光強度下連續光照培養至對數生長后期的得到培養液；

15、步驟四、收集培養液，6000轉/分鐘離心15分鐘后收集細胞沉淀，按照od730?=?20重懸浮到離心管中，5?ml?pbs緩沖液洗兩次得到重組藍藻懸液，然后向重組藍藻懸液添加終濃度為20?mm的香豆酸進行反應得到槲皮素。反應溫度：37?℃；反應時間：50?h；轉速：150rpm。

16、本發明的有益效果在于：

17、1、本發明首次提出以藍藻為新型全細胞催化劑，高效將對香豆酸高效轉化為天然產物槲皮素。該細菌生物催化劑從co2合成，擺脫了傳統的碳源依賴的問題。

18、2、以藍藻為全細胞催化劑生產植物天然產物方面有獨到優勢。在植物天然產物的合成過程中，涉及到許多植物酶對天然產物的合成至關重要，然而，許多植物酶例如細胞色素?p450?單加氧酶是膜結合蛋白，難以在大腸桿菌等大多數原核微生物中異源表達，因為這類微生物缺少內生的膜系統。藍藻與大多數原核微生物不同，其細胞內擁有類囊體膜系統，使得植物源酶可以功能性的表達。

19、綜上，本發明提供生產方法提高了槲皮素的生產效率和產量，還可以吸收溫室氣體co2，具有重要的現實意義和工業應用價值。