本發明涉及基因編輯領域,特別是基于crispr/cas技術的基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷領域。具體而言,本發明涉及un1cas12f1突變體及包含所述un1cas12f1突變體的融合蛋白。本發明還涉及完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白以及僅具有單鏈切割活性且具有識別和結合活性的nun1cas12f1蛋白,編碼所述un1cas12f1突變體、所述dun1cas12f1蛋白或所述nun1cas12f1蛋白的多核苷酸序列,包含所述un1cas12f1突變體、所述dun1cas12f1蛋白或所述nun1cas12f1蛋白的融合蛋白,crispr/cas核酸酶系統,crispr/cas延伸系統,載體,細胞或試劑盒,以及所述un1cas12f1突變體、所述dun1cas12f1蛋白或所述nun1cas12f1蛋白的應用。
背景技術:
1、crispr/cas系統目前被廣泛應用于基因組編輯等領域,存在廣大臨床應用空間。crispr/cas系統利用向導rna,引導cas蛋白,實現對靶序列的識別和切割。目前被最廣泛應用的來自化膿鏈球菌的spcas9,其編碼基因約4.1kb,而臨床中常用作遞送dna的病毒載體aav的最大裝載能力不超過4.8kb,來自金黃色葡萄球菌的sacas9(約3.4kb),在aav包裝中仍難以為其他必需元件(如啟動子、效應蛋白等)留足空間。cas蛋白龐大的尺寸限制了crispr/cas系統在臨床上進一步應用。因此尋找尺寸更小的cas蛋白具有重要意義。
2、最近,一組來自于未培養古菌的cas14被報道可用于靶向單鏈dna切割,作為一種非常緊湊的rna引導的核酸酶家族,cas14僅有400-700個氨基酸。un1cas12f1(具有529個氨基酸),作為cas14家族中的其中一種核酸酶,在2022年被報道可用于實現細胞內雙鏈dna的切割,這為crispr/cas系統在臨床上進一步應用帶來曙光。但這種un1cas12f1基因編輯效率卻極低,難以實現有效的基因編輯。因此,有必要開發基因編輯效率更高的un1cas12f1,推動基因編輯技術的應用。
技術實現思路
1、本發明的一方面提供一種un1cas12f1突變體,其氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。
2、本發明的另一方面提供一種完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白,其氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列進一步包含d143r、t147r、g297c、d326a、k330r、d510a和e528r取代,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。
3、本發明的另一方面提供一種完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白,其氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。
4、本發明的另一方面提供一種完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白,其氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。
5、本發明的另一方面提供一種僅具有單鏈切割活性且具有識別和結合活性的nun1cas12f1蛋白,其氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。
6、本發明的另一方面提供一種融合蛋白,其包含un1cas12f1突變體和脫氨基酶,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。在一些實施方案中,所述脫氨基酶是胞嘧啶核苷脫氨基酶、腺嘌呤核苷脫氨基酶或雙功能脫氨酶。
7、本發明的另一方面提供一種融合蛋白,其包含un1cas12f1突變體和逆轉錄酶,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。
8、本發明的另一方面提供一種融合蛋白,其包含完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白和效應因子,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列進一步包含d143r、t147r、g297c、d326a、k330r、d510a和e528r取代,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種。在一些實施方案中,所述脫氨基酶是胞嘧啶核苷脫氨基酶、腺嘌呤核苷脫氨基酶或雙功能脫氨酶。
9、本發明的另一方面提供一種融合蛋白,其包含完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白和效應因子,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。在一些實施方案中,所述脫氨基酶是胞嘧啶核苷脫氨基酶、腺嘌呤核苷脫氨基酶或雙功能脫氨酶。
10、本發明的另一方面提供一種融合蛋白,其包含完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白和效應因子,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。在一些實施方案中,所述脫氨基酶是胞嘧啶核苷脫氨基酶、腺嘌呤核苷脫氨基酶或雙功能脫氨酶。
11、本發明的另一方面提供一種融合蛋白,其包含僅具有單鏈切割活性且具有識別和結合活性的nun1cas12f1蛋白和脫氨基酶,其中所述nun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。在一些實施方案中,所述脫氨基酶是胞嘧啶核苷脫氨基酶、腺嘌呤核苷脫氨基酶或雙功能脫氨酶。
12、本發明的另一方面提供一種融合蛋白,其包含僅具有單鏈切割活性且具有識別和結合活性的nun1cas12f1蛋白和逆轉錄酶,所述nun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。
13、本發明的另一方面提供一種包含un1cas12f1突變體和向導rna的crispr/cas核酸酶系統,其中所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。
14、進一步地,本發明提供一種crispr/cas核酸酶系統,其包含融合蛋白和向導rna,其中所述融合蛋白包含un1cas12f1突變體和脫氨基酶,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。在一些實施方案中,所述脫氨基酶是胞嘧啶核苷脫氨基酶、腺嘌呤核苷脫氨基酶或雙功能脫氨酶。
15、進一步地,本發明提供一種crispr/cas核酸酶系統,其包含融合蛋白和先導編輯向導rna,其中所述先導編輯向導rna包含引物結合位點和逆轉錄模板,所述融合蛋白包含un1cas12f1突變體和逆轉錄酶,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。
16、進一步地,本發明提供一種包含完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列進一步包含d143r、t147r、g297c、d326a、k330r、d510a和e528r取代,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。
17、進一步地,本發明提供一種包含完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。
18、進一步地,本發明提供一種包含完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。
19、進一步地,本發明提供一種包含僅具有單鏈切割活性且具有識別和結合活性的nun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統,其中所述nun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。
20、本發明的另一方面還提供一種crispr/cas延伸系統,其包含融合蛋白和向導rna,其中所述融合蛋白包含完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白和效應因子,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列進一步包含d143r、t147r、g297c、d326a、k330r、d510a和e528r取代,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種。
21、本發明的另一方面還提供一種crispr/cas延伸系統,其包含融合蛋白和向導rna,其中所述融合蛋白包含完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白和效應因子,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。
22、本發明的另一方面還提供一種crispr/cas延伸系統,其包含融合蛋白和向導rna,其中所述融合蛋白包含完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白和效應因子,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。
23、本發明的另一方面還提供一種crispr/cas延伸系統,其包含融合蛋白和向導rna,其中所述融合蛋白包含僅具有單鏈切割活性且具有識別和結合活性的nun1cas12f1蛋白和脫氨基酶,所述nun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。
24、本發明的另一方面還提供一種crispr/cas延伸系統,其包含融合蛋白和先導編輯向導rna,其中所述融合蛋白包含僅具有單鏈切割活性且具有識別和結合活性的nun1cas12f1蛋白和逆轉錄酶,所述先導編輯向導rna包含引物結合位點和逆轉錄模板,所述nun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。
25、本發明的另一方面還提供一種編碼un1cas12f1突變體、包含所述un1cas12f1突變體和脫氨基酶的融合蛋白、或者包含所述un1cas12f1突變體和逆轉錄酶的融合蛋白的多核苷酸序列,其中所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。
26、進一步地,本發明還提供一種編碼完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白或包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白的多核苷酸序列,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列進一步包含d143r、t147r、g297c、d326a、k330r、d510a和e528r取代,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種。
27、進一步地,本發明還提供一種編碼完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白或包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白的多核苷酸序列,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。
28、進一步地,本發明還提供一種編碼完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白或包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白的多核苷酸序列,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。
29、進一步地,本發明還提供一種編碼僅具有單鏈切割活性且具有識別和結合活性的nun1cas12f1蛋白、包含所述nun1cas12f1蛋白和脫氨基酶的融合蛋白、或者包含所述nun1cas12f1蛋白和逆轉錄酶的融合蛋白的多核苷酸序列,其中所述nun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。
30、本發明的另一方面還提供一種包含或攜帶編碼un1cas12f1突變體、包含所述un1cas12f1突變體和脫氨基酶的融合蛋白、或者包含所述un1cas12f1突變體和逆轉錄酶的融合蛋白的多核苷酸序列的載體,其中所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,氨基酸殘基按照如seqid?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。
31、進一步地,本發明還提供一種包含或攜帶編碼完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白或包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白的多核苷酸序列的載體,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列進一步包含d143r、t147r、g297c、d326a、k330r、d510a和e528r取代,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種。在一些實施方案中,所述載體是病毒載體或非病毒載體。在一些實施方案中,所述病毒載體是慢病毒載體或腺相關病毒載體。在一些實施方案中,所述非病毒載體是質粒載體或納米脂質體載體。
32、進一步地,本發明還提供一種包含或攜帶編碼完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白或包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白的多核苷酸序列的載體,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。在一些實施方案中,所述載體是病毒載體或非病毒載體。在一些實施方案中,所述病毒載體是慢病毒載體或腺相關病毒載體。在一些實施方案中,所述非病毒載體是質粒載體或納米脂質體載體。
33、進一步地,本發明還提供一種包含或攜帶編碼完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白或包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白的多核苷酸序列的載體,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。在一些實施方案中,所述載體是病毒載體或非病毒載體。在一些實施方案中,所述病毒載體是慢病毒載體或腺相關病毒載體。在一些實施方案中,所述非病毒載體是質粒載體或納米脂質體載體。
34、進一步地,本發明還提供一種包含或攜帶編碼僅具有單鏈切割活性且具有識別和結合活性的nun1cas12f1蛋白、包含所述nun1cas12f1蛋白和脫氨基酶的融合蛋白、或者包含所述nun1cas12f1蛋白和逆轉錄酶的融合蛋白的多核苷酸序列的載體,其中所述nun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。在一些實施方案中,所述載體是病毒載體或非病毒載體。在一些實施方案中,所述病毒載體是慢病毒載體或腺相關病毒載體。在一些實施方案中,所述非病毒載體是質粒載體或納米脂質體載體。
35、本發明的另一方面還提供一種細胞,其包含:un1cas12f1突變體;包含所述un1cas12f1突變體和脫氨基酶的融合蛋白;包含所述un1cas12f1突變體和逆轉錄酶的融合蛋白;包含所述un1cas12f1突變體和向導rna的crispr/cas核酸酶系統;包含融合蛋白和向導rna的crispr/cas核酸酶系統,所述融合蛋白包含所述un1cas12f1蛋白和脫氨基酶;包含融合蛋白和先導編輯向導rna的crispr/cas核酸酶系統,所述融合蛋白包含所述un1cas12f1蛋白和逆轉錄酶,所述先導編輯向導rna包含引物結合位點和逆轉錄模板;編碼所述un1cas12f1突變體或所述融合蛋白的多核苷酸;或者包含或攜帶所述多核苷酸的載體,其中所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。
36、進一步地,本發明還提供一種細胞,其包含:完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白;包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種;包含所述dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含所述融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;編碼所述dun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;或者包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列進一步包含d143r、t147r、g297c、d326a、k330r、d510a和e528r取代,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述細胞是hek293t細胞。
37、進一步地,本發明還提供一種細胞,其包含:完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白;包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白,其中所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種;包含所述dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含所述融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;編碼所述dun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;或者包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。在一些實施方案中,所述細胞是hek293t細胞。
38、進一步地,本發明還提供一種細胞,其包含:完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白;包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白,其中所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種;包含所述dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含所述融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;編碼所述dun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;或者包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。在一些實施方案中,所述細胞是hek293t細胞。
39、進一步地,本發明還提供一種細胞,其包含:僅具有單鏈切割活性且具有識別和結合活性的nun1cas12f1蛋白;包含所述nun1cas12f1蛋白和脫氨基酶的融合蛋白;包含所述nun1cas12f1蛋白和逆轉錄酶的融合蛋白;包含所述nun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統,所述融合蛋白包含所述nun1cas12f1蛋白和脫氨基酶;包含融合蛋白和先導編輯向導rna的crispr/cas延伸系統,所述融合蛋白包含所述nun1cas12f1蛋白和逆轉錄酶,所述先導編輯向導rna包含引物結合位點和逆轉錄模板;編碼所述nun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;或者包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體,其中所述nun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述細胞是hek293t細胞。
40、本發明的另一方面還提供一種用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的試劑盒,其包括含有以下成分中的一種或多種的試劑和使用說明:un1cas12f1突變體;包含所述un1cas12f1突變體和脫氨基酶的融合蛋白;包含所述un1cas12f1突變體和逆轉錄酶的融合蛋白;包含所述un1cas12f1突變體和向導rna的crispr/cas核酸酶系統;包含融合蛋白和向導rna的crispr/cas核酸酶系統,其中所述融合蛋白包含所述un1cas12f1突變體和脫氨基酶;包含融合蛋白和先導編輯向導rna的crispr/cas核酸酶系統,其中所述融合蛋白包含所述un1cas12f1突變體和逆轉錄酶,所述先導編輯向導rna包含引物結合位點和逆轉錄模板;編碼所述un1cas12f1突變體或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述un1cas12f1突變體、所述融合蛋白、所述crispr/cas核酸酶系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代。在一些實施方案中,所述基因選自人的nlrc4、nudt16和col8a1中的一個或多個。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向和/或基因切割。
41、進一步地,本發明提供一種用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的試劑盒,其包括含有以下成分中的一種或多種的試劑和使用說明:完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白;包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種;包含所述dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含所述融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;編碼所述dun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述dun1cas12f1蛋白、所述融合蛋白、所述crispr/cas延伸系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列進一步包含d143r、t147r、g297c、d326a、k330r、d510a和e528r取代,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述基因選自人的nlrc4、nudt16和col8a1中的一個或多個。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向。
42、進一步地,本發明提供一種用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的試劑盒,其包括含有以下成分中的一種或多種的試劑和使用說明:完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白;包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種;包含所述dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含所述融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;編碼所述dun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述dun1cas12f1蛋白、所述融合蛋白、所述crispr/cas延伸系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。在一些實施方案中,所述基因選自teto、ilirn和ttn中的一個或多個。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向。
43、進一步地,本發明提供一種用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的試劑盒,其包括含有以下成分中的一種或多種的試劑和使用說明:完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白;包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白,其中所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種;包含所述dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含所述融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;編碼所述dun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述dun1cas12f1蛋白、所述融合蛋白、所述crispr/cas延伸系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。在一些實施方案中,所述基因選自teto、ilirn和ttn中的一個或多個。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向。
44、進一步地,本發明提供一種用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的試劑盒,其包括含有以下成分中的一種或多種的試劑和使用說明:僅具有單鏈切割活性且具有識別和結合活性的nun1cas12f1蛋白;包含所述nun1cas12f1蛋白和脫氨基酶的融合蛋白;包含所述nun1cas12f1蛋白和逆轉錄酶的融合蛋白;包含所述nun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統,其中所述融合蛋白包含所述nun1cas12f1蛋白和脫氨基酶;包含融合蛋白和先導編輯向導rna的crispr/cas延伸系統,其中所述融合蛋白包含所述nun1cas12f1蛋白和逆轉錄酶,所述先導編輯向導rna包含引物結合位點和逆轉錄模板;編碼所述nun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述nun1cas12f1蛋白、所述融合蛋白、所述crispr/cas延伸系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述nun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向和/或基因切割。
45、本發明的另一方面還提供一種用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的方法,所述方法包含將編碼所述基因的多核苷酸與以下組分中的一種或多種進行接觸:un1cas12f1突變體;包含所述un1cas12f1突變體和脫氨基酶的融合蛋白;包含所述un1cas12f1突變體和逆轉錄酶的融合蛋白;包含所述un1cas12f1突變體和向導rna的crispr/cas核酸酶系統;包含融合蛋白和向導rna的crispr/cas核酸酶系統,其中所述融合蛋白包含所述un1cas12f1突變體和脫氨基酶;包含融合蛋白和先導編輯向導rna的crispr/cas核酸酶系統,其中所述融合蛋白包含所述un1cas12f1突變體和逆轉錄酶,所述先導編輯向導rna包含引物結合位點和逆轉錄模板;編碼所述un1cas12f1突變體或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述un1cas12f1突變體、所述融合蛋白、所述crispr/cas核酸酶系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。在一些實施方案中,所述基因選自人的nlrc4、nudt16和col8a1。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向和/或基因切割。
46、進一步地,本發明提供一種用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的方法,所述方法包含將編碼所述基因的多核苷酸與以下組分中的一種或多種進行接觸:完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白;包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種;包含所述dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含所述融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;編碼所述dun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述dun1cas12f1蛋白、所述融合蛋白、所述crispr/cas延伸系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列進一步包含d143r、t147r、g297c、d326a、k330r、d510a和e528r取代,其中氨基酸殘基按照如seqid?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述基因選自人的nlrc4、nudt16和col8a1。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向。
47、進一步地,本發明提供一種用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的方法,所述方法包含將編碼所述基因的多核苷酸與以下組分中的一種或多種進行接觸:完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白;包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種;包含所述dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含所述融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;編碼所述dun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述dun1cas12f1蛋白、所述融合蛋白、所述crispr/cas延伸系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。在一些實施方案中,所述基因選自teto、ilirn和ttn中的一個或多個。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向。
48、進一步地,本發明提供一種用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的方法,所述方法包含將編碼所述基因的多核苷酸與以下組分中的一種或多種進行接觸:完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白;包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種;包含所述dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含所述融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;編碼所述dun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述dun1cas12f1蛋白、所述融合蛋白、所述crispr/cas延伸系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。在一些實施方案中,所述基因選自teto、ilirn和ttn中的一個或多個。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向。
49、進一步地,本發明提供一種用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的方法,所述方法包含將編碼所述基因的多核苷酸與以下組分中的一種或多種進行接觸:僅具有單鏈切割活性且具有識別和結合活性的nun1cas12f1蛋白;包含所述nun1cas12f1蛋白和脫氨基酶的融合蛋白;包含所述nun1cas12f1蛋白和逆轉錄酶的融合蛋白;包含所述nun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統,其中所述融合蛋白包含所述nun1cas12f1蛋白和脫氨基酶;包含融合蛋白和先導編輯向導rna的crispr/cas延伸系統,其中所述融合蛋白包含所述nun1cas12f1蛋白和逆轉錄酶,所述先導編輯向導rna包含引物結合位點和逆轉錄模板;編碼所述nun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述nun1cas12f1蛋白、所述融合蛋白、所述crispr/cas延伸系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述nun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向和/或基因切割。
50、本發明的另一方面還提供以下各項在制備用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的試劑或試劑盒中的應用:un1cas12f1突變體;包含所述un1cas12f1突變體和脫氨基酶的融合蛋白;包含所述un1cas12f1突變體和逆轉錄酶的融合蛋白;包含所述un1cas12f1突變體和向導rna的crispr/cas核酸酶系統;包含融合蛋白和向導rna的crispr/cas核酸酶系統,其中所述融合蛋白包含所述un1cas12f1突變體和脫氨基酶;包含融合蛋白和先導編輯向導rna的crispr/cas核酸酶系統,其中所述融合蛋白包含所述un1cas12f1突變體和逆轉錄酶,所述先導編輯向導rna包含引物結合位點和逆轉錄模板;編碼所述un1cas12f1突變體或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述un1cas12f1突變體、所述融合蛋白、所述crispr/cas核酸酶系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,氨基酸殘基按照如seqid?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述un1cas12f1突變體的氨基酸序列進一步包含d143r、t147r和e151a取代中的一個或多個。在一些實施方案中,所述基因選自人的nlrc4、nudt16和col8a1。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向和/或基因切割。
51、進一步地,本發明還提供以下各項在制備用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的試劑或試劑盒中的應用:完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白;包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種;包含所述dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含所述融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;編碼所述dun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述dun1cas12f1蛋白、所述融合蛋白、所述crispr/cas延伸系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列進一步包含d143r、t147r、g297c、d326a、k330r、d510a和e528r取代,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述基因選自人的nlrc4、nudt16和col8a1。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向。
52、進一步地,本發明還提供以下各項在制備用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的試劑或試劑盒中的應用:完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白;包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白,所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種;包含所述dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含所述融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;編碼所述dun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述dun1cas12f1蛋白、所述融合蛋白、所述crispr/cas延伸系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,并且其氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述基因選自teto、ilirn和ttn中的一個或多個。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向。
53、進一步地,本發明還提供以下各項在制備用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的試劑或試劑盒中的應用:完全失去切割活性但保有識別和結合活性的dun1cas12f1蛋白;包含所述dun1cas12f1蛋白和效應因子的融合蛋白,其中所述效應因子選自脫氨基酶、轉錄激活因子、表觀遺傳激活因子、轉錄抑制因子、表觀遺傳抑制因子、核酸酶、整合酶、轉座酶、重組酶、環化酶、熒光素酶、熒光蛋白、松弛酶和染色體重塑因子中的一種或多種;包含所述dun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含所述融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;編碼所述dun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述dun1cas12f1蛋白、所述融合蛋白、所述crispr/cas延伸系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列不包含g297位置的突變,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述dun1cas12f1蛋白的氨基酸序列不包含g297c取代。在一些實施方案中,所述基因選自teto、ilirn和ttn中的一個或多個。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向。
54、進一步地,本發明還提供以下各項在制備用于基因編輯、基因靶向調控、基因表觀遺傳調控或基因診斷的試劑或試劑盒中的應用:僅具有單鏈切割活性且具有識別和結合活性的nun1cas12f1蛋白;包含所述nun1cas12f1蛋白和脫氨基酶的融合蛋白;包含所述nun1cas12f1蛋白和逆轉錄酶的融合蛋白;包含所述nun1cas12f1蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統;包含融合蛋白和向導rna的crispr/cas延伸系統,其中所述融合蛋白包含所述nun1cas12f1蛋白和脫氨基酶;包含融合蛋白和先導編輯向導rna的crispr/cas延伸系統,其中所述融合蛋白包含所述nun1cas12f1蛋白和逆轉錄酶,所述先導編輯向導rna包含引物結合位點和逆轉錄模板;編碼所述nun1cas12f1蛋白或所述融合蛋白的多核苷酸序列;包含或攜帶所述多核苷酸序列的載體;含有所述nun1cas12f1蛋白、所述融合蛋白、所述crispr/cas延伸系統、所述多核苷酸序列或所述載體的細胞,其中所述nun1cas12f1蛋白的氨基酸序列相對于野生型un1cas12f1的氨基酸序列包含m427f和f487w取代中的一個或兩個,其中氨基酸殘基按照如seq?id?no:1所示的野生型un1cas12f1的氨基酸序列編號。在一些實施方案中,所述基因編輯為基因靶向和/或基因切割。