靶向CD26的抗原結合蛋白及其藥物應用的制作方法

本發明涉及與人cd26結合的抗體或抗原結合蛋白，及其在制備治療高表達cd26腫瘤的藥物中的應用。

背景技術：

1、cd26是一種多功能ⅱ型跨膜糖蛋白，也可以以溶解形式存在于血漿中。cd26常以同源二聚體形式存在，其單體含766個氨基酸，相對分子質量約110kda。cd26氨基酸殘基從內向外分為5個部分：胞內區(1～6)、跨膜區(7～28)、高度糖基化區(29～323)、富含半胱氨酸區(324～551)和c端催化結構域(552～766)，其分子三維結構與功能密切相關。cd26(dpp4)抑制劑在臨床上用于ⅱ型糖尿病的治療已有數十年的歷史。cd26在多種腫瘤細胞表面的表達量明顯升高，例如，如惡性間皮瘤，腎癌，前列腺癌，肺癌等，對于這類型cd26表達量較高的腫瘤，cd26是一種具有重要價值的作用靶點(cd26/dpp4-a?potential?biomarkerand?target?for?cancer?therapy,pharmacology&therapeutics(2019),198:135-159)。

2、目前以人cd26為靶點的靶向性抗癌藥物研究進展最快的是y’s?therapeutics公司的單克隆抗體ys110，已完成了i/ⅱ期臨床試驗。但根據已有文獻資料分析可知，ys110的臨床前研究已存在體內外活性均較低的問題，如在文獻“ahumanized?anti-cd26monoclonal?antibody?inhibits?cell?growth?of?malignant?mesothelioma?viaretarded?g2/m?cell?cycle?transition,cancer?cell?int(2016)16:35”中，在ys110的濃度為250ug/ml，作用48h以后，對腫瘤細胞株生長的抑制率為18.3％，則ic50值遠遠高于250ug/ml，足見其體外的活性較低；又如在專利“抗cd26抗體及其使用方法(申請號：cn200680034937.4)”中，展示了ys110對多種cd26高表達細胞株的小鼠腫瘤模型的治療，ys110僅能一定程度縮小腫瘤體積，緩解腫瘤生長，并不能完全抑制腫瘤生長實現腫瘤的治愈，可見其在動物模型中的活性仍然不理想。ys110已經完成的臨床二期研究結果顯示，ys110具有較好的耐受性，但疾病控制率未達到預期，這與ys110在臨床前研究中所表現出來的低活性相對應。

3、盡管在文獻資料中有報道cd26的廣泛分布，但ys110的使用仍然具有較好的安全性，足見其在臨床使用中的安全性有較好的保障。在ys110臨床試驗的31例患者中，未出現患者死亡，所表現出來的副作用主要為，16.1％的患者有輸液不良反應，9.7％的患者出現呃逆，6.5％的患者出現腹瀉等。(phase?2study?of?ys110,a?recombinant?humanizedanti-cd26?monoclonal?antibody,in?japanese?patients?with?advanced?malignantpleural?mesothelioma,jto?clinincal?and?research?reports(2021),2(6))

4、綜上所述，盡管cd26靶點的安全性已在臨床試驗中得到驗證，但現有的以cd26為治療靶點的抗體對腫瘤治療難以取得較好的治療效果。

5、在機體免疫應答過程中，抗原起著激發和始動的重要作用。抗原是指能刺激機體產生特異性免疫應答，并與免疫應答產物抗體或致敏淋巴細胞結合，發生免疫效應的物質，通常包括免疫原性和反應原性兩個固有屬性。實際上，抗原并非通過其完整分子來發揮作用，其功能和特異性通常通過其表位來實現，免疫細胞通過結合和識別抗原分子上的表位來啟動免疫反應。

6、表位又稱抗原決定簇，是指存在于抗原分子中能夠誘導免疫反應,由數個氨基酸殘基組成的特殊序列及其空間結構。一個抗原分子含有多種表位，其中既包括能激發機體產生保護性免疫反應的表位，也含有一些對保護性免疫反應不利的表位，如抑制性和毒性表位等。人們還認識到同一分子的眾多表位中,各表位對抗原性的貢獻不同,有優勢表位和非優勢表位之分。此外,表位間的相對位置、構象特征、表位側翼順序等也與表位功能的表達密切相關。

技術實現思路

1、為解決上述問題，本發明的第一個目的在于提供一種更有效、更安全的cd26抗體或抗原結合片段。

2、本發明的結合cd26的抗原結合蛋白，其結合seq?id?no：59所示的氨基酸序列內的氨基酸殘基。

3、本發明的結合cd26的抗原結合蛋白，與包含seq?id?no:1所示hcdr1、seq?id?no:2所示hcdr2、seq?id?no:3所示hcdr3以及包含seq?id?no:4所示lcdr1、由arg?met?ser組成的lcdr2和seq?id?no:5所示的lcdr3的抗原結合蛋白競爭結合cd26。

4、本發明的抗原結合蛋白與cd26結合的表位與包含seq?id?no:1所示hcdr1、seq?idno:2所示hcdr2、seq?id?no:3所示hcdr3以及包含seq?id?no:4所示lcdr1、由arg?met?ser組成的lcdr2和seq?id?no:5所示的lcdr3的抗原結合蛋白與cd26結合的表位相同。

5、本發明的結合cd26的抗原結合蛋白，與a)或b)任一項的抗原結合蛋白競爭結合cd26：a)包含seq?id?no:6所示的重鏈可變區和seq?id?no:7所示的輕鏈可變區的抗原結合蛋白；b)包含seq?id?no:8所示的重鏈可變區和seq?id?no:9所示的輕鏈可變區的抗原結合蛋白。

6、本發明的抗原結合蛋白與cd26結合的表位，與a)或b)任一項的抗原結合蛋白與cd26結合的表位相同：a)包含seq?id?no:6所示的重鏈可變區和seq?id?no:7所示的輕鏈可變區的抗原結合蛋白；b)包含seq?id?no:8所示的重鏈可變區和seq?id?no:9所示的輕鏈可變區的抗原結合蛋白。

7、本發明的抗原結合蛋白為單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。

8、本發明的抗原結合蛋白為fab片段、fab′片段、f(ab′)2片段、fv片段、scfv、雙抗體或單鏈抗體分子。

9、本發明的抗原結合蛋白為igg1型、igg2型、igg3型或igg4型抗體。

10、一種分離的核酸，選自a)、b)或c)任一項：

11、a)編碼上述結合cd26的抗原結合蛋白的dna；

12、b)與a)所述核酸完全互補的dna；

13、c)(a)或(b)的rna，其中u替代了t。

14、一種載體，包含上述核酸的載體。

15、一種細胞，包含上述載體的細胞。

16、編碼目標抗原結合蛋白的核酸分子可以作為病毒或非病毒載體的部分施用，利用載體向受試者遞送編碼目標抗原結合蛋白的核酸。已經成功地用于將核酸導入宿主的各種病毒載體包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(aav)、皰疹病毒和痘病毒等等。

17、一種組合物，包含上述任意一種抗原結合蛋白、核酸或細胞。

18、一種方法，用于治療高cd26水平有關疾病的方法，給予受試者有效量的上述任意一種抗原結合蛋白、核酸或細胞。所述高cd26水平有關疾病包括但不限于腫瘤，所述高cd26水平的腫瘤包括但不限于腎癌、間皮瘤、肺癌、肝癌、前列腺癌等。所述抗體或抗原結合片段單獨給予，或者與其它抗癌劑聯合給予。

19、本技術相比現有技術具有如下優勢：

20、本專利首次揭示，與cd26的如seq?id?no：59所示的氨基酸序列內的氨基酸殘基結合的cd26抗體具有更好的抗腫瘤效果及安全性。具體而言：

21、第一個方面，本技術篩選的鼠源抗體優勢明顯。

22、實施例1數據表明本技術篩選的62號鼠源抗體對人源腫瘤細胞的裂解強度遠遠高于其他鼠源抗體。并且本技術篩選的鼠抗對人源腫瘤細胞的殺傷已經與完成臨床二期的人源化抗體ys110相當，更充分證明了本技術鼠抗的優勢。

23、此外，實施例5、8、10數據表明以62號鼠抗的可變區為基礎改造獲得的嵌合抗體或人源化抗體相比其他鼠抗來源的相應抗體點雜交活性更好、與抗原的親和力更佳。

24、相比其他鼠抗來源的bite，以本技術62號鼠抗的可變區為基礎改造獲得的bite顯示出更好的有效性。實施例11在體外比較bite介導的pbmc對不同靶細胞的細胞毒性作用時，本技術62號來源的bite對多種腫瘤細胞的殺傷均優于cd26抗體序列來源于ys110的bite。實施例17-22結果顯示本技術bite在多種動物腫瘤模型中均能顯著抑制腫瘤生長，部分模型能完全抑制腫瘤生長，顯著優于cd26抗體序列來源于ys110的bite。

25、更進一步地，相比其他鼠抗來源bite，以本技術62號鼠抗的可變區為基礎改造獲得的bite顯示出更好的安全性(實施例13)，引起細胞因子風暴的風險更低。

26、第二個方面，本技術靶向cd26的雙特異性t細胞接合器相比現有cd26單克隆全長抗體更有效、更安全。

27、有效性方面，實施例11數據表明本技術bite結構的雙特異性抗體對多種cd26陽性腫瘤細胞的殺傷效果均優于igg全長抗體ys110。實施例23、24數據表明本技術bite結構的雙特異性抗體在多種動物腫瘤模型中均顯示出顯著優于igg全長抗體ys110的抑制腫瘤生長的作用。

28、安全性方面，實施例12數據表明抗cd26?igg全長抗體不能有效誘導t細胞的激活，本技術bite結構的cd26-cd3雙特異性抗體在未到達腫瘤部位時，不會引起明顯的t細胞活化，抗體與腫瘤細胞結合后，才會引起腫瘤組織周圍的t細胞活化，進而殺傷腫瘤細胞，提高了作用的安全性。實施例23、24數據表明本技術bite結構的雙特異性抗體在多種動物腫瘤模型中均顯示出顯著優于igg全長抗體ys110的安全性。

29、第三個方面，相比相關腫瘤現有一線治療方案(如bavencio治療腎癌)，本技術靶向cd26的雙特異性t細胞接合器顯示出更突出的有效性、安全性(實施例15、22、23)。