一種新型玉米赤霉烯酮降解酶、編碼基因及其表達和應用

本發明涉及基因工程和酶工程領域，具體涉及一種新型玉米赤霉烯酮降解酶、編碼基因及其表達和應用。

背景技術：

1、玉米赤霉烯酮(zearalenone)又稱f-2毒素，是由多種鐮孢屬真菌產生的非甾體雌激素毒素，在作物生長和長期存儲過程中產生。因此，玉米赤霉烯酮在玉米、大麥、小麥等許多作物和谷類副產品中被發現，尤其是在適合真菌生長的環境中。玉米赤霉烯酮及其衍生物通過污染的作物進入食物鏈并積累在人體和動物體內，對機體造成損害。主要是因為玉米赤霉烯酮及其衍生物的化學結構類似于天然雌激素，因此它們能夠競爭性地結合雌激素受體，引起外部和內部生殖器改變和繁殖障礙問題，導致高雌性激素癥和不孕癥；另外此類毒素還會刺激乳腺癌細胞系的生長并在小鼠中致癌。

2、鑒于玉米赤霉烯酮的危害性，其在谷物、食品和飼料中的含量必須低于一定標準。傳統采用物理和化學方法去除玉米赤霉烯酮，但是由于其比較穩定，去除率比較低效。酶降解玉米赤霉烯酮不僅可以高效地將其轉化為無毒性產物，而且酶催化反應專一性強、降解效率高，不會破壞谷物的營養物質。因此，通過酶解法降解玉米赤霉烯酮是一種具有良好應用前景的新型技術。

3、目前已有文獻報道了一些玉米赤霉烯酮降解酶，并在食品、飼料、糧油等工業生產中進行了應用。但已經報道出來的玉米赤霉烯酮降解酶存在催化活性較低、熱穩定性差的問題，使得其作為催化劑在工業中的應用受到了限制。鑒于此，本發明提供一種新型玉米赤霉烯酮降解酶、編碼基因及其表達和應用。

技術實現思路

1、本發明所要解決的技術問題是提供一種新型玉米赤霉烯酮降解酶、編碼基因及其表達和應用。目的是提供一種具有高酶活、耐溫與耐ph等優點，可用于玉米赤酶烯酮的生物降解，具有良好的工業應用前景的新型玉米赤霉烯酮降解酶及其編碼基因。

2、本發明為了解決上述技術問題，第一個目的是提供一種新型玉米赤霉烯酮降解酶，其包括降解酶zhd11d或改造型降解酶s1-zhd11d，所述降解酶zhd11d的氨基酸序列如seq?id?no:1所示，或者含有相對于氨基酸序列seq?id?no:1進行缺失、取代或增加一個或多個氨基酸的zhd11d衍生氨基酸序列，且與氨基酸序列seq?id?no:1具有等價的功能，所述改造型降解酶s1-zhd11d的氨基酸序列如seq?id?no:3所示，或者含有相對于氨基酸序列seq?id?no:3進行缺失、取代或增加一個或多個氨基酸的改造型s1-zhd11d衍生氨基酸序列，且與氨基酸序列seq?id?no:3具有等價的功能。

3、本發明的有益效果是：本發明新的降解酶zhd11d比酶活為304.7u/mg，是目前已知野生型中比酶活最高的玉米赤霉烯酮降解酶。改造型降解酶s1-zhd11d的比酶活提升至472.0u/mg，是野生型降解酶zhd11d的1.5倍，在40℃的半衰期提高了2倍，同時在ph?6.5-9.5范圍內展現了良好的穩定性。在37℃下，含有玉米赤霉烯酮的食用油(含量為10.8g/kg)經過5h酶解，降解酶zhd11d的降解率約20.7％；s1-zhd11d的降解率為44.6％，玉米赤霉烯酮殘留量為5.3g/kg，降解能力是野生型zhd11d的兩倍。

4、本發明是通過基因比對在基因數據庫篩選到一種新的玉米赤霉烯酮降解酶，通過活力及序列驗證，確認為玉米赤霉烯酮降解酶，命名為降解酶zhd11d，該降解酶的氨基酸序列如seq?id?no：1所示。為了進一步地提高降解酶zhd11d的比酶活和穩定性，在降解酶zhd11d的n端融合雙親短肽(氨基酸序列如seq?id?no：5所示)，命名為s1-zhd11d，氨基酸序列如seq?id?no：3所示。

5、其中，本發明中的新的降解酶zhd11d與已報道的zhd101的氨基酸同源性為51.33％，與zhd518的氨基酸同源性為58.7％，確定是一種新型的玉米赤霉烯酮降解酶。本發明分子改造型s1-zhd11d相較于野生型zhd11d穩定性得到了顯著改善，40℃的孵育1h后殘余活力提高3倍，在ph?6.5-9.5孵育16h后依然能保持90％以上殘余活性；此外，s1-zhd11d的活性也明顯提高，改造后比酶活提升為472.0u/mg，是野生型的1.5倍。因此，本發明人工改造型玉米赤霉烯酮降解酶s1-zhd11d具有良好的工業應用價值。

6、在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

7、進一步，所述zhd11d衍生氨基酸序列包括在氨基酸序列seq?id?no:1的第88位t變成m，或/和第96位a變成p，或/和第155位i變成w，或/和第209位s變成w，或/和第223位s變成w。

8、進一步，所述改造型降解酶s1-zhd11d是在所述降解酶zhd11d的n端融合雙親短肽序列得到，所述雙親短肽的氨基酸序列如seq?id?no:5所示。

9、本發明采用的自組裝雙親短肽(saps)是一段疏水親水氨基酸交替分布的短肽，與目的蛋白融合表達后，蛋白會自發聚集形成寡聚體，在分子材料學、細胞培養、納米生物技術和生物醫藥等方面具有巨大的應用潛力。

10、第二個目的是提供一種新型玉米赤霉烯酮降解酶基因，所述新型玉米赤霉烯酮降解酶基因編碼上述所述的降解酶zhd11d或所述的改造型降解酶s1-zhd11d。

11、進一步，編碼降解酶zhd11d基因的核苷酸序列如seq?id?no:2所示，或者含有相對于核苷酸序列seq?id?no:2進行缺失、取代或增加一個或多個核苷酸的zhd11d衍生核苷酸序列，且與核苷酸序列seq?id?no:2具有等價的功能，編碼改造型降解酶s1-zhd11d基因的核苷酸序列如seq?id?no:4所示，或者含有相對于核苷酸序列seq?id?no:4進行缺失、取代或增加一個或多個核苷酸的改造型s1-zhd11d衍生核苷酸序列，且與核苷酸序列seq?idno:4具有等價的功能。

12、第三個目的是提供一種新型玉米赤霉烯酮降解酶基因的重組質粒，所述重組質粒包含如上述所述的新型玉米赤霉烯酮降解酶基因。

13、進一步，所述重組質粒中的質粒為pet28a，但不限于該質粒，也可以是其他表達載體。

14、第四個目的是提供一種新型玉米赤霉烯酮降解酶基因的重組菌株，所述重組菌株包含如上述所述的新型玉米赤霉烯酮降解酶基因的重組質粒。

15、進一步，所述重組菌株中的菌株為大腸桿菌。也可以是其他宿主。

16、第五個目的是提供一種表達新型玉米赤霉烯酮降解酶的方法，包括如下步驟：

17、步驟1：將如上述所述的新型玉米赤霉烯酮降解酶基因插入到質粒pet28a上的ncoi和xho?i雙酶切位點之間，得到重組質粒；

18、步驟2：將步驟1得到的重組質粒轉入大腸桿菌，得到重組菌株；

19、步驟3：培養步驟2得到的重組菌株，誘導新型玉米赤霉烯酮降解酶的表達，后經過破碎、回收并純化，得到新型玉米赤霉烯酮降解酶。

20、第六個目的是提供一種新型玉米赤霉烯酮降解酶的應用，將所述新型玉米赤霉烯酮降解酶用于降解玉米赤霉烯酮。

21、本發明的新挖掘的zhd11d及改造型s1-zhd11d在食品、飼料和糧油等行業具有良好的應用前景。