背景技術:
0、現有技術
1、全世界最常用的從包含核酸的樣品中提取核酸的方式是本領域技術人員充分已知的并且是基于在存在不同離液鹽的溶液的情況下將核酸結合到礦物質載體上,其中作為載體材料使用細磨的玻璃粉末(bio?101,la?jolla,ca)、硅藻土(sigma公司)或二氧化硅凝膠或二氧化硅懸浮液或玻璃纖維過濾器或礦物質土(de?41?39?664?a1;us?5,234,809;wo-a95/34569de?4321904;de?20207793)。所有這些技術解決方案都基于在存在離液鹽溶液的情況下將核酸結合到以玻璃或硅為基礎的礦物質載體材料上。另外,還可以借助于作為細胞溶解緩沖液/結合緩沖液體系的組成部分的所謂的反離液鹽來非常高效地將核酸結合到礦物質固相上(ep?1135479)。并且還可能的是,用包含離液鹽與非離液鹽的組合的緩沖液來分離核酸,因為這種緩沖液還介導了核酸對礦物質載體的結合。即,總而言之,可以如下地描述現有技術:在存在包含離液鹽或反離液鹽的緩沖液的情況下或者在存在包含離液鹽和反離液鹽的混合物的緩沖液的情況下將核酸結合到礦物質材料上,然后還可以以此途徑來分離核酸。在此,還存在優選變體,其中附加地使用脂肪醇來介導結合。本領域技術人員還已知,用于分離和提純核酸的所有常見的商業產品都以此為基礎。所使用的礦物質載體在此以松散的散裝料的形式、過濾器膜的形式或懸浮液的形式存在。為了進行自動提取過程,通常使用順磁性或磁性顆粒。這例如涉及具有磁性或順磁性核的硅酸鹽類材料,還涉及氧化鐵顆粒,其表面被改性為使其實現為了結合核酸所需的功能。用于分離核酸的提取過程在此還基于理論上相同的模式:溶解初始樣品以釋放核酸,將核酸結合到對應的礦物質載體材料上,清洗所結合的核酸,干燥載體材料,并且最終從載體材料上洗脫經結合的核酸。即使在這些方法中也已經證實,仍然存在一系列缺點。于是,尤其在使用旋轉過濾器膜的情況下,所使用的材料的結合能力受到限制。當初始樣品包含過多的核酸時,通常還會堵塞膜。在使用磁性顆粒的情況下的自動化處理過程是高耗費的并且依據應用不同還需要相對較高的時間耗費。在現場條件下無法簡單地進行核酸分離。還重要的是,尤其在實驗室中基于旋轉過濾器來手動進行核酸提取時,每次制備都產生大量的塑料垃圾。專利申請wo2016/169677?a1公開了一種用于提取核酸的完全不同的方法。在此,省去了礦物質載體材料。在使用粗糙表面的情況下分離核酸。在此使用具有粗糙的或經結構化的表面的材料來結合核酸。這種材料在wo?2016/169677?a1中總是被加入到進行核酸結合的反應容器中或已經位于其中。
2、現有技術還包括文件wo?2016/169679?a1和wo?2016/169678?a1。其中還公開了將核酸結合到粗糙的或“經結構化的”材料上。但是用液體在周圍沖洗負責結合的材料或者該材料位于滴管尖端的外側。de?10?2019?118?332?a1中描述了將dna結合到粗糙固相上、例如塑料上,其中同時還包含有溝槽。
3、迄今沒有描述為了結合核酸而在反應容器的內側處具有溝槽或螺紋的材料。
4、發明目的
5、本發明的基本目的在于,在塑料垃圾問題方面改進文件wo?2016/169677?al、wo2016/169679?a1和wo?2016/169678?a1的技術解決方案。
技術實現思路
1、已經根據本專利權利要求所述的特征實現了這個目的。根據本發明提供了一種方法和一種測試套件,可以在其內側處具有溝槽或螺紋的反應容器中實現反應過程。
2、本發明基于以下目的:提供一種用于提取核酸的裝置,該裝置允許從含核酸的樣品中快速且簡單地分離高品質的核酸并且同時大幅度降低迄今為止在實驗室中出現的塑料垃圾。這種新型裝置基于專利申請wo?2016/169677a1公開的知識并且以理想的方式實現了這個目的。優選使用常規的塑料容器(1.5ml,2.0ml),其中還可以使用更大體積的容器(15ml或50ml)。借助于螺紋切割器向容器中切割出螺紋。這個螺紋位于反應容器的下半部。螺紋優選不完全達到容器底部,而是略微高于容器底部。在此,少量的螺紋匝數就足夠。在1.5ml商業反應容器的情況下,優選以m7尺寸用螺紋切割器切割螺紋,而在2.0ml的可商購的反應容器的情況下,優選使用m19尺寸的螺紋切割器。借助于所引入的螺紋而被改變的容器現在突出地適合于提取核酸。在此,在一個特殊的實施方式中,從細胞溶解直到最終的核酸脫附的整個提取過程可以僅在一個容器中進行。這降低了塑料的消耗并且明顯降低了常見提取方法產生的塑料垃圾。核酸提取按照本領域技術人員充分已知的過程來進行,并且由此按照細胞溶解-結合-清洗-洗脫的步驟來進行。對于存在游離核酸并且可以省去細胞溶解步驟的情況,根據權利要求1,步驟為結合-清洗-洗脫。在有細胞溶解步驟的情況下,使用本發明裝置從細胞提取核酸的方式變為如下:將細胞引入到帶有螺紋的反應容器中,并且借助于細胞溶解緩沖液以及在加入來自可商購套件(smart?dna?mini?kit;istinnuscreen?gmbh公司)的蛋白酶k的情況下溶解細胞。在細胞溶解之后,向盛有細胞溶解液的容器中加入異丙醇以及結合優化劑(binding?optimizer,同樣來自該套件)。將容器在搖床上在1500rpm下培養5分鐘。在這個步驟之后倒出樣品。核酸現在處于螺紋處。接下來用醇類緩沖液多次清洗容器。在去除乙醇之后,借助于加入水或在加入低鹽緩沖液的情況下使所結合的核酸從螺紋脫離并且可供進一步應用。該方法尤其對于dna提取而言是非常溫和的。這可以實現分離高分子dna。在結合容量方面不存在任何限制,如在基于旋轉過濾器或基于磁體顆粒的提取時就是這種情況。不需要進行離心也不需要磁體顆粒分離,由此也不需要用于離心和磁體顆粒分離的設備。此外,對于示例性描述的提取,僅使用一個容器。但是,替代地還可能的是,在附加的容器中進行細胞溶解步驟并且只有在細胞溶解完成后才更換到根據本發明的容器中。當涉及細胞沒有完全被溶解并且因此需要離心步驟以從細胞溶解液分離不可溶組分的樣品時,這是值得推薦的。
3、根據本發明的在內側處帶有溝槽或螺紋的反應容器優選由塑料制成。但是還可以使用設有溝槽或螺紋的其他材料。
4、在本發明的意義上“節約資源”是指避免塑料廢料。
5、下面將借助于實施例說明本發明,其中實施例并不意味著對應用的限制。
6、實施例
7、實施例1:借助于1.5ml反應容器、利用在反應容器中切割的螺紋從含核的血液細胞中提取dna與兩種基于旋轉過濾器柱的可商購參比提取套件的對比(qiagen;dneasyblood&tissue?kit和ist?innuscreen?gmbh公司的innuprep?dna?mini?kit?2.0)
8、使用3ml的全血樣品,以從中分離含核的細胞。然后使用這些細胞以進行提取。根據用戶手冊用兩種可商購的產品進行提取。借助于根據本發明的裝置如下進行提取。在此使用同樣來自可商購套件(ist?innuscreen?gmbh公司;smart?blood?dna?midi?kit(m))的所有必需的試劑。將細胞重新懸浮在120μl?1x?pbs緩沖液中并且轉移到根據本發明的反應容器中。在加入200μl的細胞溶解緩沖液和30μl的蛋白酶k之后,將反應容器在恒溫搖床中在55℃下培養30分鐘。在細胞溶解之后向反應容器中加入350μl異丙醇和40μl結合優化劑。然后將容器在搖床上在1500rpm下培養5分鐘。隨后將樣品倒出。用醇類清洗緩沖液清洗結合在螺紋處的dna三次。在上一個清洗步驟之后,在40℃下將容器開蓋培養10分鐘。接著,向容器加入300μl的洗脫緩沖液(10mm?tris-hcl)并且在50℃下溶解dna約30分鐘。接著用分光光度法測量dna并且在瓊脂糖凝膠上可視化。還用由兩個參比套件提取的dna樣品來進行這個過程。
9、表1示出dna的分光光度法測量結果。
10、 樣品 樣品類型 產量(μg) <![cdata[a<sub>260</sub>:a<sub>280</sub>]]> <![cdata[a<sub>260</sub>:a<sub>230</sub>]]> 1 參比套件qiagen;樣品1 32 1.9 2.1 2 參比套件qiagen;樣品2 31 1.9 2.1 3 參比套件ist?innuscreen;樣品1 34 1.9 2.0 4 參比套件ist?innuscreen;樣品2 33 19 2.2 5 根據本發明的裝置樣品1 82 1.9 2.1 6 根據本發明的裝置樣品2 79 1.9 2.1
11、表1
12、實施例2:借助于1.5ml反應容器、利用在反應容器中切割的螺紋從含核的血液細胞中提取dna與可商購參比提取套件在所產生的塑料垃圾量方面的對比(qiagen;dneasyblood&tissue?kit)。
13、以100個反應為基礎。在此,參比套件需要100個用于樣品細胞溶解的反應容器、100個旋轉過濾器柱、300個用于旋轉過濾器柱的收集容器和100個用于盛放洗脫的dna的反應容器。借助于根據本發明的裝置的方法需要100個帶有螺紋的反應容器。
14、參比套件的塑料垃圾量(100個反應):0.6kg
15、本發明裝置的塑料垃圾量(100個反應):0.1kg
16、由此,借助于本發明裝置的提取明顯更加節約資源并且實現了顯著減少實驗室垃圾。
17、圖一示出關于實施例1的dna的凝膠電泳分析(0.8%瓊脂糖凝膠)。數據顯示出,用本發明裝置提取的dna產量明顯高于用兩個基于過濾器柱的參比套件獲得的產量。