產生胞外多糖的微生物及其用途的制作方法

背景技術：

1、微生物胞外多糖對生產細胞(producing?cell)具有多種保護功能，例如抵御干旱、毒素和非生物脅迫，截留營養物和胞外酶，作為細胞對表面的粘附物，以及通過創建如生物膜中所見的繁殖傳導微環境來維持結構目的。

2、因此，胞外多糖是改善有益微生物在表面的存活和定植的有用工具，例如在植物處理中。胞外多糖的產生防止或減少例如葉上的植物有益微生物被雨水或風沖走，并改善葉、枝條和根表面的定植。例如，這在植物有益類芽孢桿菌屬的應用中是有利的，類芽孢桿菌屬的植物表面定植使得植物顯著地抵御真菌病原體，同時改善根的營養物攝取。例如，多粘類芽孢桿菌a26的生物膜多糖能夠拮抗禾谷鐮孢(timmusk?s,copolovici?d,copolovicil,teder?t,nevo?e,behers?l.paenibacillus?polymyxa?biofilm?polysaccharidesantagonise?fusarium?graminearum.[多粘類芽孢桿菌生物膜多糖拮抗禾谷鐮孢]scirep.[科學報告]2019年1月24日；9(1):662.doi:10.1038/s41598-018-37718-w)。一些類芽孢桿菌屬物種的生物膜形成可以有效地幫助它們定植在植物根部，并幫助宿主植物在惡劣條件下適應和存活。

3、此外，胞外多糖和產生胞外多糖的微生物可以例如通過吸水和通過向植物提供氨來增強土壤肥力并提高產量一致性。在這種情況下，胞外多糖可以幫助在細菌周圍建立微親氣環境，因此可以使微生物固定大氣氮所需的氧敏感酶固氮酶具有活性。

4、胞外多糖的其他應用依賴于它們改變液體流變特性的能力，特別是它們通過同時具有生物可降解性來增加粘度的能力。例如，這可用于地下石油和天然氣提取、化妝品、食物、飼料和藥物制劑。例如，胞外多糖在組織工程、藥物遞送和傷口敷料中用作支架或基質(nwodo?uu,green?e,okoh?ai.bacterial?exopolysaccharides:functionality?andprospects.[細菌胞外多糖：功能和前景]int?j?mol?sci.[國際分子科學雜志]2012；13(11):14002-14015.公開于2012年10月30日.doi:10.3390/ijms131114002)。此外，來自類芽孢桿菌屬物種的胞外多糖用作抗腫瘤劑、抗氧化劑或絮凝劑(he?x,li?q,wang?n,chens.effects?of?an?eps?biosynthesis?gene?cluster?of?paenibacillus?polymyxa?wly78on?biofilm?formation?and?nitrogen?fixation?under?aerobic?conditions.[需氧條件下多粘類芽孢桿菌wly78的eps生物合成基因簇對生物膜形成和固氮的影響]microorganisms.[微生物]2021年1月30日；9(2):289.doi:10.3390/microorganisms9020289)，這表明微生物胞外多糖具有廣泛的生物技術和工業應用領域。胞外多糖由糖單元構成，可以僅由一種單體(例如，多糖果聚糖(levan)中的果糖)組成，也可以由不同的單體組成。多糖的實例特別是但不限于葡聚糖、果聚糖(fructan)、凝結多糖、結冷膠(gellan)、黃原膠、生物乳化劑(emulsan)、葡萄聚糖、纖維素、褐藻膠(aliginate)、可拉酸(colonic?acid)、凝結多糖、葡萄聚糖、迪特膠(diutan)、果聚糖(levan)、琥珀酰聚糖、威藍膠(welan)及其組合。相應地，以下文獻已經描述了胞外多糖產生的制造材料和方法：出版物wo?2015118516和wo?2016044768描述了使用胞外多糖的土壤接種，特別是用于改善土壤肥力；出版物wo?2020163251描述了胞外多糖用于改善產量一致性的應用；出版物wo?2014176061描述了胞外多糖用于處理地下地層(subterraneous?formation)的應用，特別是在石油和天然氣提取中；并且出版物wo?2014160350描述了使用胞外多糖處理廢水。wo2017151742中描述了用于胞外多糖沉淀和將植物有益微生物截留在其中的材料和方法。參與多粘類芽孢桿菌胞外多糖產生的基因和代謝已在rütering等人,tailor-madeexopolysaccharides-crispr-cas9?mediated?genome?editing?in?paenibacilluspolymyxa[定制胞外多糖-crispr-cas9介導的多粘類芽孢桿菌基因組編輯],syntheticbiology[合成生物學]2017,doi:10.1093/synbio/ysx007中進行了詳細研究，該文獻以其全文并入本文，特別是作為多粘類芽孢桿菌的胞外多糖糖單體組成和參與胞外多糖合成的基因的參考。

5、除了這些好處外，胞外多糖是工業液相發酵中引起關注的主要原因。由于胞外多糖引起的發酵培養基粘度的增加，氧氣和營養物轉移速率會降低，從而降低發酵產率并需要更高的能量來攪拌發酵培養基。因此，通常嘗試減少或消除微生物中的胞外多糖產生。

6、許多微生物在發酵過程中主要在對數期生長中產生胞外多糖。在后期發酵階段，特別是在對數期生長結束時，胞外多糖被降解并作為營養物消耗，從而回收消耗在胞外多糖產生上的一些代謝能。因此，發酵液的最大胞外多糖含量經常先于目標發酵產物的最大含量出現。例如，在類芽孢桿菌屬發酵中，最大粘度且因此最大胞外多糖含量在達到殺鐮孢菌素(fusaricidin)a、b或d的最大含量之前達到，因此需要用胞外多糖含量交換殺鐮孢菌素含量。這顯然是不期望的，特別是在植物保護應用中。此外，在收獲后發酵液的儲存過程中，胞外多糖通常在幾小時或幾天內從細胞或剩余的酶中降解。因此，為了獲得高水平的胞外多糖，下游加工通常對時間要求嚴格。

7、因此，本發明的目的是減輕或彌補現有技術的上述缺點。特別地，本發明的目的是提供包含等位基因的改變的核酸，相比于相應的野生型，這些核酸使得相應的微生物在發酵液中產生更高的胞外多糖含量。此外，本發明的目的是提供這樣的核酸、等位基因和微生物，與相應的野生型相比，它們允許在發酵后期增加發酵罐內容物中胞外多糖的含量，優選地當除了微生物產生的胞外多糖之外的至少一種目標發酵產物(優選地抗微生物物質)的最大含量可獲得時。

技術實現思路

1、本發明提供了包含突變體degu基因和/或突變體degs基因，以及任選地進一步包含突變體spo0a基因的微生物，其中該微生物表現出增加的和/或穩定的胞外多糖產生和/或減少的胞外多糖降解。

2、本發明還提供了增加或穩定微生物胞外多糖產生或減少或防止微生物胞外多糖降解的方法，該方法包括在該微生物中提供以下中的一種或多種的步驟：

3、a)突變體degu基因，其中

4、-該degu基因編碼具有降低的dna結合活性和/或缺乏功能性dna結合結構域的degu蛋白，和/或

5、-該degu基因編碼degu蛋白，其中突變按對每個替代方案aa)和ab)的優選性的遞減順序包含以下中的一種或多種或由其組成：

6、aa)q218*、q218k、q218n、q218d、q218r，和/或

7、ab)d223*、d223*+m220n、d223*+m220n+e221g、d223*+m220n+v222g、d223*+m220n+e221g+v222g、d223*+m220d、d223*+m220e、d223*+m220h、d223*+m220f、d223*+m220w、d223*+m220s、d223*+m220a；

8、b)突變體degs基因，其中

9、-該degs基因編碼缺乏功能性單結合結構域、功能性磷酸受體結構域和/或功能性atp酶結構域的degs蛋白，和/或

10、-該degs基因編碼degs蛋白，其中該突變包含l99f、l99c、l99d、l99e、l99g、l99h、l99k、l99n、l99p、l99q、l99r、l99s、l99w或l99y或由其組成；

11、c)突變體spo0a基因，其中

12、ca)該突變位于dna結合結構域或接收結構域，并導致spo0a蛋白磷酸化的減少或消除和/或二聚化的減少或消除，和/或

13、cb)該突變由以下中的任一種組成或包含以下中的任一種：

14、-a257v、更優選地a257s，

15、-i161r、更優選地i161l，

16、-按優選性的遞減順序：a257s+i161i、a257a+i161l、a257v+i161i、a257s+i161f或a257a+i161r。

17、本發明還提供了表達載體，其包含用于表達以下中的一種或多種的表達盒：

18、a)突變體degu基因，其中

19、-該degu基因編碼具有降低的dna結合活性和/或缺乏功能性dna結合結構域的degu蛋白，和/或

20、-該degu基因編碼degu蛋白，其中突變按對每個替代方案aa)和ab)的優選性的遞減順序包含以下中的一種或多種或由其組成：

21、aa)q218*、q218k、q218n、q218d、q218r，和/或

22、ab)d223*、d223*+m220n、d223*+m220n+e221g、d223*+m220n+v222g、d223*+m220n+e221g+v222g、d223*+m220d、d223*+m220e、d223*+m220h、d223*+m220f、d223*+m220w、d223*+m220s、d223*+m220a；

23、b)突變體degs基因，其中

24、-該degs基因編碼缺乏功能性單結合結構域、功能性磷酸受體結構域和/或功能性atp酶結構域的degs蛋白，和/或

25、-該degs基因編碼degs蛋白，其中該突變包含l99f、l99c、l99d、l99e、l99g、l99h、l99k、l99n、l99p、l99q、l99r、l99s、l99w或l99y或由其組成；

26、c)突變體spo0a基因，其中

27、ca)該突變位于dna結合結構域或接收結構域，并導致spo0a蛋白磷酸化的減少或消除和/或二聚化的減少或消除，和/或

28、cb)該突變由以下中的任一種組成或包含以下中的任一種：

29、-a257v、更優選地a257s，

30、-i161r、更優選地i161l，

31、-按優選性的遞減順序：a257s+i161i、a257a+i161l、a257v+i161i、a257s+i161f或a257a+i161r。

32、此外，本發明提供了改善植物健康的方法，該方法包括將包含突變體degu基因和/或突變體degs基因，以及任選地進一步包含突變體spo0a基因的微生物(其中該微生物表現出增加的和/或穩定的胞外多糖產生和/或減少的胞外多糖降解)施用于

33、a)植物材料和/或

34、b)植物培養基質。

35、本發明還提供了產生胞外多糖的方法，該方法包括：

36、i)培養包含突變體degu基因和/或突變體degs基因，以及任選地進一步包含突變體spo0a基因的微生物，其中該微生物表現出增加的和/或穩定的胞外多糖產生和/或減少的胞外多糖降解，以及

37、ii)任選地將該微生物與該胞外多糖分離。

38、本發明還提供了

39、以下物質的用途：包含突變體degu基因和/或突變體degs基因，以及任選地進一步包含突變體spo0a基因的微生物，其中該微生物表現出增加的和/或穩定的胞外多糖產生和/或減少的胞外多糖降解，

40、或degu基因或蛋白，其中

41、-該degu基因編碼具有降低的dna結合活性和/或缺乏功能性dna結合結構域的degu蛋白，和/或

42、-該degu基因編碼degu蛋白，其中突變按對每個替代方案aa)和ab)的優選性的遞減順序包含以下中的一種或多種或由其組成：

43、aa)q218*、q218k、q218n、q218d、q218r，和/或

44、ab)d223*、d223*+m220n、d223*+m220n+e221g、d223*+m220n+v222g、d223*+m220n+e221g+v222g、d223*+m220d、d223*+m220e、d223*+m220h、d223*+m220f、d223*+m220w、d223*+m220s、d223*+m220a，

45、和/或degs基因或degs蛋白，其中

46、-該degs基因編碼缺乏功能性單結合結構域、功能性磷酸受體結構域和/或功能性atp酶結構域的degs蛋白，和/或

47、-該degs基因編碼degs蛋白，其中該突變包含l99f、l99c、l99d、l99e、l99g、l99h、l99k、l99n、l99p、l99q、l99r、l99s、l99w或l99y或由其組成，

48、和/或spo0a基因或spo0a蛋白，其中

49、ca)該突變位于dna結合結構域或接收結構域，并導致spo0a蛋白磷酸化的減少或消除和/或二聚化的減少或消除，和/或

50、cb)該突變由以下中的任一種組成或包含以下中的任一種：

51、-a257v、更優選地a257s，

52、-i161r、更優選地i161l，

53、-按優選性的遞減順序：a257s+i161i、a257a+i161l、a257v+i161i、a257s+i161f或a257a+i161r，

54、用于以下中任一項：

55、-胞外多糖組合物的產生，

56、-植物、植物葉、植物根和/或植物種子的處理，

57、-土壤接種，優選地用于增強土壤肥力，

58、-產量一致性的改善，

59、-地下地層的處理，

60、-廢水的處理，

61、-藥物或化妝品載劑的制備，

62、-藥物或化妝品組合物的制備，

63、-皮膚水合組合物的制備，

64、-食物或飼料添加劑的制備，

65、-抗腫瘤劑的制備，

66、-抗氧化劑的制備，

67、-絮凝劑的制備。

68、本發明還提供了以下中的一種或多種：

69、a)突變體degu基因，其中

70、-該degu基因編碼具有降低的dna結合活性和/或缺乏功能性dna結合結構域的degu蛋白，和/或

71、-該degu基因編碼degu蛋白，其中突變按對每個替代方案aa)和ab)的優選性的遞減順序包含以下中的一種或多種或由其組成：

72、aa)q218*、q218k、q218n、q218d、q218r，和/或

73、ab)d223*、d223*+m220n、d223*+m220n+e221g、d223*+m220n+v222g、d223*+m220n+e221g+v222g、d223*+m220d、d223*+m220e、d223*+m220h、d223*+m220f、d223*+m220w、d223*+m220s、d223*+m220a；

74、b)突變體degs基因，其中

75、-該degs基因編碼缺乏功能性單結合結構域、功能性磷酸受體結構域和/或功能性atp酶結構域的degs蛋白，和/或

76、-該degs基因編碼degs蛋白，其中該突變包含l99f、l99c、l99d、l99e、l99g、l99h、l99k、l99n、l99p、l99q、l99r、l99s、l99w或l99y或由其組成；

77、c)突變體spo0a基因，其中

78、ca)該突變位于dna結合結構域或接收結構域，并導致spo0a蛋白磷酸化的減少或消除和/或二聚化的減少或消除，和/或

79、cb)該突變由以下中的任一種組成或包含以下中的任一種：

80、-a257v、更優選地a257s，

81、-i161r、更優選地i161l，

82、-按優選性的遞減順序：a257s+i161i、a257a+i161l、a257v+i161i、a257s+i161f或a257a+i161r，

83、用于增加或穩定微生物胞外多糖產生或防止該微生物胞外多糖降解的用途，該微生物選自厚壁菌門(phylum?firmicutes)，芽孢桿菌綱、梭菌綱或厚壁菌綱(negativicutes)的分類等級中的任一種。