本發明涉及有機污染土壤微生物修復技術領域，尤其涉及一種苯系污染物btex降解菌的篩選方法。
背景技術：
苯系污染物（btex）是一類毒性、致癌性較大的有機污染物，在化工行業中常作為原輔材料或有機溶劑大量使用。由于其疏水性強，易在土壤中吸附富集，同時，由于其比重小、揮發性強，對人體健康和生態環境危害性較大。
針對由苯系污染物（btex）造成的污染土壤，現有技術中，常規的修復手段包括氣相抽提、熱脫附、水泥窯協同處置、化學氧化等物流化學措施，但上述處理方式均不同程度存在能耗大、易形成二次污染等不足；與之相比，生物修復技術，特別是微生物降解技術，則具有環境友好、無二次污染等特點。因此，生物修復技術成為了btex污染土壤修復技術的主要研究發展方向。
微生物降解技術的核心在于降解菌的篩選。傳統篩菌方式多為以污染物作為唯一碳源進行培養篩選，雖針對性強，但工作量大、時間長、篩選效率不高。通過查閱文獻可知，漆酶為一種對苯系物、多環芳烴具有良好降解轉化效果的多酚氧化酶，具有漆酶分泌能力的微生物對土壤中btex能起到一定修復效果。基于上述陳述，本發明提出了一種苯系污染物btex降解菌的篩選方法。
技術實現要素：
本發明的目的是為了解決現有技術中存在的缺點，而提出的一種苯系污染物btex降解菌的篩選方法。
一種苯系污染物btex降解菌的篩選方法，包括以下步驟：
包括初篩和復篩兩個階段，并對培養因子進行優化后獲取具有高效降解特性的菌株；
包括以下步驟：
s1、菌源的采集：選取長期受苯系物污染的區域土壤作為降解菌篩選的菌源；
s2、取步驟s1中選取的降解菌篩選的菌源土壤加入盛有無菌水的錐形瓶中，以170～250rpm的振蕩頻率，振蕩1～3h后靜置；
s3、取步驟s2中錐形瓶內靜置后的上清液，涂布至初篩培養基平板上，在25～30℃的條件下，培養44～52h，得鐵紅色氧化圈菌落；
s4、利用接種環挑取初篩培養基平板上的鐵紅色氧化圈菌落至液體培養基中進行富集培養，在25～30℃的條件下，以110～180rpm的振蕩頻率，振蕩44～52h，得培養液；
s5、取步驟s4中所得的培養液，涂布至復篩培養基平板上，在25～30℃的條件下，培養20～28h，得透明暈圈菌落；
s6、利用接種環挑取復篩培養基平板上的透明暈圈菌落進行劃線純化，直至得到形態單一的純化菌落；
s7、將步驟s6中純化后的菌落接種至菌種保藏培養基斜面上，在25～30℃的條件下，培養20～28h后，保存于2～6℃的冰箱中，備用。
優選地，所述步驟s3中的初篩培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸20～30min，過濾取濾液，濾渣棄用；
濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，2-甲氧基酚0.1ml，瓊脂20g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min。
優選地，所述步驟s4中的液體培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸20～30min，過濾取濾液，濾渣棄用；
濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，2-甲氧基酚0.1ml，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min。
優選地，所述步驟s5中的復篩培養基為：苯0.2g，nacl10g，kh2po41g，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，cacl20.2g，(nh4)2so41g，微量元素溶液1ml，蒸餾水1000ml，瓊脂20g，ph7.2；
在參數為0.1mpa、121℃狀態下，高壓滅菌20min；
其中，所述微量元素溶液為由以下成分組成：na2moo41g，znso4·5h2o28g，cuso4·5h2o2g，mnso4·5h2o4g，h3bo44g，coso4·7h2o4.7g，feso410g，ph7.2；將上述成分定容至1l。
優選地，所述步驟s7中的菌種保藏培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸20～30min，過濾取濾液，濾渣棄用；
濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，瓊脂20g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min。
本發明提出的一種苯系污染物btex降解菌的篩選方法，以長期污染土壤為菌源，利用漆酶可將2-甲氧基酚氧化為鐵紅色物質的特性，在培養基中加入一定量的2-甲氧基酚作為篩選培養基進行快速篩選，從而獲取具有產漆酶活性的微生物菌株；再將獲得的菌株接種至以btex為單一碳源的無機培養基進行復篩，獲得能以btex為唯一碳源生長，且具有修復能力的高效降解菌，其篩選效率高，工作量小，所得降解菌針對性強，對土壤中苯系污染物具有良好的降解去除效果，用于由苯系污染物btex造成的污染土壤的修復，具有修復時間短，修復效率高，修復成本低，環境友好、無污染等優點，值得推廣。
具體實施方式
本發明提供一種苯系污染物btex降解菌的篩選方法，包括以下步驟：
s1、菌源的采集：選取長期受苯系物污染的區域土壤作為降解菌篩選的菌源；
s2、取步驟s1中選取的降解菌篩選的菌源土壤加入盛有無菌水的錐形瓶中，以170～250rpm的振蕩頻率，振蕩1～3h后靜置；
s3、取步驟s2中錐形瓶內靜置后的上清液，涂布至初篩培養基平板上，在25～30℃的條件下，培養44～52h，得鐵紅色氧化圈菌落；
s4、利用接種環挑取初篩培養基平板上的鐵紅色氧化圈菌落至液體培養基中進行富集培養，在25～30℃的條件下，以110～180rpm的振蕩頻率，振蕩44～52h，得培養液；
s5、取步驟s4中所得的培養液，涂布至復篩培養基平板上，在25～30℃的條件下，培養20～28h，得透明暈圈菌落；
s6、利用接種環挑取復篩培養基平板上的透明暈圈菌落進行劃線純化，直至得到形態單一的純化菌落；
s7、將步驟s6中純化后的菌落接種至菌種保藏培養基斜面上，在25～30℃的條件下，培養20～28h后，保存于2～6℃的冰箱中，備用。
優選地，所述步驟s3中的初篩培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸20～30min，過濾取濾液，濾渣棄用；
濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，2-甲氧基酚0.1ml，瓊脂20g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min。
優選地，所述步驟s4中的液體培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸20～30min，過濾取濾液，濾渣棄用；
濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，2-甲氧基酚0.1ml，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min。
優選地，所述步驟s5中的復篩培養基為：苯0.2g，nacl10g，kh2po41g，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，cacl20.2g，(nh4)2so41g，微量元素溶液1ml，蒸餾水1000ml，瓊脂20g，ph7.2；
在參數為0.1mpa、121℃狀態下，高壓滅菌20min；
其中，所述微量元素溶液為由以下成分組成：na2moo41g，znso4·5h2o28g，cuso4·5h2o2g，mnso4·5h2o4g，h3bo44g，coso4·7h2o4.7g，feso410g，ph7.2；將上述成分定容至1l。
優選地，所述菌種保藏培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸20～30min，過濾取濾液，濾渣棄用；
濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，瓊脂20g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min。
可見，本發明提出的一種苯系污染物btex降解菌的篩選方法，以長期污染土壤為菌源，利用漆酶可將2-甲氧基酚氧化為鐵紅色物質的特性，在培養基中加入一定量的2-甲氧基酚作為篩選培養基進行快速篩選，從而獲取具有產漆酶活性的微生物菌株；再將獲得的菌株接種至以btex為單一碳源的無機培養基進行復篩，獲得能以btex為唯一碳源生長，且具有修復能力的高效降解菌，其篩選效率高，工作量小，所得降解菌針對性強，對土壤中苯系污染物具有良好的降解去除效果，用于由苯系污染物btex造成的污染土壤的修復，具有修復時間短，修復效率高，修復成本低，環境友好、無污染等優點，值得推廣。
本發明通過具體實施方式對進行詳細說明：
本發明一種苯系污染物btex降解菌的篩選方法，包括以下步驟：
s1、菌源的采集：選取長期受苯系物污染的區域土壤作為降解菌篩選的菌源；
s2、取步驟s1中選取的降解菌篩選的菌源土壤加入盛有無菌水的錐形瓶中，以170～250rpm的振蕩頻率，振蕩1～3h后靜置；
s3、取步驟s2中錐形瓶內靜置后的上清液，涂布至初篩培養基平板上，在25～30℃的條件下，培養44～52h，得鐵紅色氧化圈菌落；
其中，初篩培養基是200g馬鈴薯加水煮沸20～30min，過濾取濾液，濾渣棄用；
濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，2-甲氧基酚0.1ml，瓊脂20g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min；
s4、利用接種環挑取初篩培養基平板上的鐵紅色氧化圈菌落至液體培養基中進行富集培養，在25～30℃的條件下，以110～180rpm的振蕩頻率，振蕩44～52h，得培養液；
初篩培養基是200g馬鈴薯加水煮沸20～30min，過濾取濾液，濾渣棄用；
濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，2-甲氧基酚0.1ml，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min。
s5、取步驟s4中所得的培養液，涂布至復篩培養基平板上，在25～30℃的條件下，培養20～28h，得透明暈圈菌落；
復篩培養基為：苯0.2g，nacl10g，kh2po41g，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，cacl20.2g，(nh4)2so41g，微量元素溶液1ml，蒸餾水1000ml，瓊脂20g，ph7.2；
在參數為0.1mpa、121℃狀態下，高壓滅菌20min；
其中，所述微量元素溶液為由以下成分組成：na2moo41g，znso4·5h2o28g，cuso4·5h2o2g，mnso4·5h2o4g，h3bo44g，coso4·7h2o4.7g，feso410g，ph7.2；將上述成分定容至1l；
s6、利用接種環挑取復篩培養基平板上的透明暈圈菌落進行劃線純化，直至得到形態單一的純化菌落；
s7、將步驟s6中純化后的菌落接種至菌種保藏培養基斜面上，在25～30℃的條件下，培養20～28h后，保存于2～6℃的冰箱中，備用；
本步驟s7所述菌種保藏培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸20～30min，過濾取濾液，濾渣棄用；
濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，瓊脂20g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min。
本發明提出的一種苯系污染物btex降解菌的篩選方法，包括初篩和復篩兩個階段，并對培養因子進行優化后獲取具有高效降解特性的菌株；其中，初篩是指步驟s1-s4，復篩是只步驟s5-s7。
下面結合具體實施例對本發明作進一步解說：
實施例一
本發明提出的一種苯系污染物btex降解菌的篩選方法，包括初篩和復篩兩個階段，并對培養因子進行優化后獲取具有高效降解特性的菌株；
具體操作，包括以下步驟：
s1、菌源的采集：取自某農化廠搬遷后長期閑置用地內，經前期調查發現該場地內部分區域土壤中存在較嚴重的苯系物（苯、甲苯、二甲苯）污染，該區域具有30多年生產歷史，廠區搬遷后空置近10年，選擇本區域內0.2m深度土壤作為苯系污染物降解菌篩選菌源，進行多點采樣采集若干供篩用土，單一點位取土樣1.5kg左右；
s2、將步驟s1中取得的土壤樣品風干、破碎、除雜、混勻、研磨后過5目篩，取供篩土壤10g加入盛有100ml無菌水的錐形瓶中，置于往復振蕩機上,以170rpm的振蕩頻率，振蕩1h后靜置0.5h；
s3、取步驟s2中錐形瓶內的上清液0.5ml，均勻涂布至初篩培養基平板上，在25℃的條件下，培養44h，得鐵紅色氧化圈菌落，其中，初篩培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸25min，過濾取濾液，濾渣棄用；濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，2-甲氧基酚0.1ml，瓊脂20g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min；
s4、利用接種環挑取初篩培養基平板上的鐵紅色氧化圈菌落至液體培養基中進行富集培養，在25℃的條件下，以110rpm的振蕩頻率，振蕩44h，得培養液，其中，液體培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸25min，過濾取濾液，濾渣棄用；濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，2-甲氧基酚0.1ml，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min；
s5、取步驟s4中所得的培養液0.5ml，均勻涂布至復篩培養基平板上，在25℃的條件下，培養20h，得透明暈圈菌落，其中，復篩培養基為：苯0.2g，nacl10g，kh2po41g，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，cacl20.2g，(nh4)2so41g，微量元素溶液1ml，蒸餾水1000ml，瓊脂20g，ph7.2；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min；其中微量元素溶液為na2moo41g，znso4·5h2o28g，cuso4·5h2o2g，mnso4·5h2o4g，h3bo44g，coso4·7h2o4.7g，feso410g，ph7.2；
s6、利用接種環挑取復篩培養基平板上的透明暈圈菌落進行劃線純化，直至得到形態單一的純化菌落；
s7、將步驟s6中純化后的菌落接種至菌種保藏培養基斜面上，在25℃的條件下，培養20h后，保存于2℃的冰箱中，備用，其中，菌種保藏培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸25min，過濾取濾液，濾渣棄用；濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，瓊脂20g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min。
實施例二
本發明提出的一種苯系污染物btex降解菌的篩選方法，包括初篩和復篩兩個階段，并對培養因子進行優化后獲取具有高效降解特性的菌株；
具體操作，包括以下步驟：
s1、菌源的采集：取自某農化廠搬遷后長期閑置用地內，經前期調查發現該場地內部分區域土壤中存在較嚴重的苯系物（苯、甲苯、二甲苯）污染，該區域具有30多年生產歷史，廠區搬遷后空置近10年，選擇本區域內0.3m深度土壤作為苯系污染物降解菌篩選菌源，進行多點采樣采集若干供篩用土，單一點位取土樣1.5kg左右；
s2、將步驟s1中取得的土壤樣品風干、破碎、除雜、混勻、研磨后過5目篩，取供篩土壤10g加入盛有100ml無菌水的錐形瓶中，置于往復振蕩機上,以250rpm的振蕩頻率，振蕩3h后靜置0.5h；
s3、取步驟s2中錐形瓶內的上清液0.5ml，均勻涂布至初篩培養基平板上，在30℃的條件下，培養52h，得鐵紅色氧化圈菌落，其中，初篩培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸25min，過濾取濾液，濾渣棄用；濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，2-甲氧基酚0.1ml，瓊脂20g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min；
s4、利用接種環挑取初篩培養基平板上的鐵紅色氧化圈菌落至液體培養基中進行富集培養，在30℃的條件下，以180rpm的振蕩頻率，振蕩52h，得培養液，其中，液體培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸25min，過濾取濾液，濾渣棄用；濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，2-甲氧基酚0.1ml，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min；
s5、取步驟s4中所得的培養液0.5ml，均勻涂布至復篩培養基平板上，在30℃的條件下，培養28h，得透明暈圈菌落，其中，復篩培養基為：苯0.2g，nacl10g，kh2po41g，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，cacl20.2g，(nh4)2so41g，微量元素溶液1ml，蒸餾水1000ml，瓊脂20g，ph7.2；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min；其中微量元素溶液為na2moo41g，znso4·5h2o28g，cuso4·5h2o2g，mnso4·5h2o4g，h3bo44g，coso4·7h2o4.7g，feso410g，ph7.2；
s6、利用接種環挑取復篩培養基平板上的透明暈圈菌落進行劃線純化，直至得到形態單一的純化菌落；
s7、將步驟s6中純化后的菌落接種至菌種保藏培養基斜面上，在30℃的條件下，培養28h后，保存于6℃的冰箱中，備用，其中，菌種保藏培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸25min，過濾取濾液，濾渣棄用；濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，瓊脂20g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min。
實施例三
本發明提出的一種苯系污染物btex降解菌的篩選方法，包括初篩和復篩兩個階段，并對培養因子進行優化后獲取具有高效降解特性的菌株；
具體操作，包括以下步驟：
s1、菌源的采集：取自某農化廠搬遷后長期閑置用地內，經前期調查發現該場地內部分區域土壤中存在較嚴重的苯系物（苯、甲苯、二甲苯）污染，該區域具有30多年生產歷史，廠區搬遷后空置近10年，選擇本區域內0.25m深度土壤作為苯系污染物降解菌篩選菌源，進行多點采樣采集若干供篩用土，單一點位取土樣1.5kg左右；
s2、將步驟s1中取得的土壤樣品風干、破碎、除雜、混勻、研磨后過5目篩，取供篩土壤10g加入盛有100ml無菌水的錐形瓶中，置于往復振蕩機上,以210rpm的振蕩頻率，振蕩2h后靜置0.5h；
s3、取步驟s2中錐形瓶內的上清液0.5ml，均勻涂布至初篩培養基平板上，在28℃的條件下，培養48h，得鐵紅色氧化圈菌落，其中，初篩培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸25min，過濾取濾液，濾渣棄用；濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，2-甲氧基酚0.1ml，瓊脂20g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min；
s4、利用接種環挑取初篩培養基平板上的鐵紅色氧化圈菌落至液體培養基中進行富集培養，在28℃的條件下，以140rpm的振蕩頻率，振蕩48h，得培養液，其中，液體培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸25min，過濾取濾液，濾渣棄用；濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，2-甲氧基酚0.1ml，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min；
s5、取步驟s4中所得的培養液0.5ml，均勻涂布至復篩培養基平板上，在28℃的條件下，培養24h，得透明暈圈菌落，其中，復篩培養基為：苯0.2g，nacl10g，kh2po41g，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，cacl20.2g，(nh4)2so41g，微量元素溶液1ml，蒸餾水1000ml，瓊脂20g，ph7.2；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min；其中微量元素溶液為na2moo41g，znso4·5h2o28g，cuso4·5h2o2g，mnso4·5h2o4g，h3bo44g，coso4·7h2o4.7g，feso410g，ph7.2；
s6、利用接種環挑取復篩培養基平板上的透明暈圈菌落進行劃線純化，直至得到形態單一的純化菌落；
s7、將步驟s6中純化后的菌落接種至菌種保藏培養基斜面上，在28℃的條件下，培養24h后，保存于4℃的冰箱中，備用，其中，菌種保藏培養基為：200g馬鈴薯加水煮沸25min，過濾取濾液，濾渣棄用；濾液加水布置1000ml，加蔗糖20g，瓊脂20g，ph自然；0.1mpa，121℃，高壓滅菌20min。
將本發明實施例一中篩選獲得的若干株降解菌株分別接種至液體培養基中，富集培養至光密度（od600）達到0.8時，取5ml菌株培養液加入100g污染土壤中拌勻；維持土壤含水率25～30%的條件下培養30d后，測得土壤中苯系污染物的去除率達42～51%。
由此可知：采用本發明提出的一種苯系污染物btex降解菌的篩選方法篩選的降解菌對土壤中苯系污染物具有良好的降解去除效果。
以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。