亞洲棉短絨性狀QTL的分子標記及其應用的制作方法

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種亞洲棉短絨性狀qtl的分子標記及其應用。
背景技術：
：棉纖維的起始發育決定著纖維的產量,而短絨與長纖維的發育存在著一定的互作關系。因此，對棉花短絨分化發育相關基因的篩選，不僅有利于棉花短絨發育分子機理的研究，也有利于揭示棉纖維分化發育機理，進而提高棉纖維的產量與品質。根據棉籽上長纖維和短纖維的有無，棉纖維突變體可分為三種：種子上有纖維而無短絨光籽突變體、種子上無纖維無短絨無絨無絮突變體以及沒有長纖維的纖維極端縮短突變體。整個纖維發育過程涉及上千個基因的表達，突變及基因的不正常表達均會導致突變體的形成。一般突變體與野生型具有相同的遺傳背景，為近等基因系，是進行基因功能研究的良好種質資源。目前，已報道了多種纖維發育突變體，其中一些突變體已通過非整倍體定位到在細胞水平可識別的染色體上。這些突變體類型主要有超短纖維突變體li1和li2(carver1929；ware1929)，無絨無絮突變體md17、sl1-7-1和xz142flm(張天真等，1991)，陸地棉無絨有絮突變體n1和n2(kohel1973)，亞洲棉無絨有絮突變體dpl972。根據現有的棉花基因組圖譜，對短絨性狀的相關基因進行圖位克隆以及功能分析，可以在一定程度上促進闡明纖維的發育機制，對改良棉花纖維品質以及進行相關基因的基因工程研究都有著重要意義。分子生物學以及數量性狀基因位點作圖方法的發展為棉纖維品質改良提供了有效手段。借助分子標記對目標性狀的基因型直接進行選擇，而不必考慮作物生長時期和發育條件，可在早期進行選擇，又能減少來自同一位點不同等位基因或不同位點的非等位基因間的相互干擾，有利于快速壘集目標基因，加速育種進程，克服不利性狀連鎖，極大地縮短了育種時間。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題為：如何篩選出穩定的與短絨相關的qtl及其緊密連鎖的分子標記，用于棉花纖維改良的分子育種。本發明的技術方案為：亞洲棉短絨性狀qtl的分子標記，qtl有三個，分別是qfz-1-1、qfz-9-1和qfz-9-2；其中qfz-1-1位于染色體a01，與分子標記dpl490緊密連鎖，遺傳距離是0.051cm；qfz-9-1、qfz-9-2位于染色體a09上，與qfz-9-1緊密連鎖的分子標記是gh118和nau3966，遺傳距離分別是0.075cm和0.043cm；與qfz-9-2緊密連鎖的分子標記是gh112和nau1375，遺傳距離分別是0.048cm和1.705cm；分子標記dpl490的前引物序列如seqidno.1所示，后引物序列如seqidno.2所示；分子標記gh118前引物序列如seqidno.3所示，后引物序列如seqidno.4所示；分子標記nau3966前引物序列如seqidno.5所示，后引物序列如seqidno.6所示；分子標記gh112前引物序列如seqidno.7所示，后引物序列如seqidno.8所示；分子標記nau1375前引物序列如seqidno.9所示，后引物序列如seqidno.10所示。亞洲棉短絨性狀qtl的分子標記方法，以待鑒定亞洲棉的dna為模版，用分子標記dpl490、gh118、nau3966、gh112或nau1375的引物對進行pcr擴增，能分別擴增出約254bp、138bp、203bp、157bp、203bp的特異dna片段的植株為含有亞洲棉短絨性狀qtl的植株。亞洲棉短絨性狀qtl的分子標記在棉花育種上的應用。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：本發明找到了與亞洲棉短絨性狀qtl緊密連鎖的5個標記。其中有4個標記遺傳距離都小于1cm，能解釋20-36％的表型變異。可用于光籽性狀的分子標記輔助選擇以及光籽基因精細定位和圖位克隆，為棉花纖維起始研究、纖維品質改良以及棉花遺傳育種提供理論依據。附圖說明圖1為引物nau1375對73個毛籽材料的擴增效果；圖2為f2群體短絨性狀qtl的定位結果。具體實施方式實施例1(1)以野生型毛籽971為父本，其突變體光籽972為母本進行雜交，獲得f1代，自交產生f2代230株，構建作圖群體。(2)用ctab法提取親本，f1及f2群體單株幼苗dna。(3)用實驗室現有的5680對引物對兩親本毛籽971和光籽972進行多態性篩選，由于兩親本遺傳背景極其相似，屬于近等基因系，所以他們之間的多態性引物及其難找，在5680對引物中僅得到44對擴增效果好的多態性引物。用這44對多態性引物對230個f2親本中的73個毛籽dna進行多態性擴增，對擴增結果用8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，分離及印染，具體方法都是常規的ssr實驗方法，這里就不贅述了。將獲得的分離群體的基因型數據利用joinmap4.0構建遺傳圖譜。連鎖的最低lod值為2.5，作圖采用kosambi函數，共得到7個連鎖群，覆蓋全基因組111.476cm。(4)利用qtl作圖軟件windowsqtlcartographer2.5，采用復合區間作圖法(compositeintervalmapping，cim)進行qtl定位，并用mapchart進行遺傳圖譜以及qtl相關區段圖形的繪制。獲得了和毛籽相關的7個qtl。在這7個和毛籽相關的qtl中，有3個qtl和5個標記緊密連鎖，它們分別是qfz-1-1位于染色體a01，與標記dpl490緊密連鎖，其遺傳距離是0.051cm。qfz-9-1,qfz-9-2都位于染色體a09上；與qfz-9-1緊密連鎖的標記是gh118和nau3966，遺傳距離分別是0.075cm和0.043cm；與qfz-9-2緊密連鎖的標記是gh112和nau1375.遺傳距離分別是0.048cm和1.705cm。它們的遺傳距離都小于2cm，能解釋較大范圍的表型變異。上述結果說明本發明篩選的引物對：dpl490，gh118，nau3966，gh112和nau1375(見表一)可作為與短絨性狀緊密連鎖的分子標記，用于短絨性狀的分子標記輔助選擇以及棉花纖維改良的分子育種。以待鑒定亞洲棉的dna為模版，用分子標記dpl490、gh118、nau3966、gh112或nau1375的引物對進行pcr擴增，能分別擴增出約254bp、138bp、203bp、157bp、203bp的特異dna片段的植株為含有亞洲棉短絨性狀qtl的植株。表一：5對和qtl緊密連鎖的分子標記信息引物名稱染色體位置前向引物后向引物dpl490a01agtatcgtcacttgtcaaagtccactcatgcatgcttatcacacatcgh118a09cggaagctagtgaaggaggtctttccttgttcgtggagtnau3966a09tttgatttcttgcccttttcttgaggagttggaatttggtgh112a09ggttgggtttccacaatagctgttgcaaccttggaaaccnau1375a09cttcattgctcttccacctcgatgggataatggcaacttc以上所述實施例僅表達了本申請的具體實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本申請保護范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本申請技術方案構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本申請的保護范圍。sequencelisting<110>中國農業科學院棉花研究所<120>亞洲棉短絨性狀qtl的分子標記及其應用<130>2017.7.30<160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<400>1agtatcgtcacttgtcaaagtcca24<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2ctcatgcatgcttatcacacatc23<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3cggaagctagtgaaggagg19<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4tctttccttgttcgtggagt20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5tttgatttcttgcccttttc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6ttgaggagttggaatttggt20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7ggttgggtttccacaatagc20<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列<400>8tgttgcaaccttggaaacc19<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9cttcattgctcttccacctc20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10gatgggataatggcaacttc20當前第1頁12