一種將miRNA轉染進豬精子并評估其轉染效率的方法與流程

本發明屬于細胞生物學領域，具體涉及一種將mirna轉染進豬精子并評估其轉染效率的方法。
背景技術：
：精子(sperm)是雄性生殖細胞，來源于希臘語意思是“種子”。哺乳動物的精子細胞由頭部、頸部、中間部分和尾巴組成。頭部包含有密集的染色質纖維的細胞核，周圍環繞著一種高纖維，其中含有用于穿透女性卵子的酶；頸部則是精子的中心，中間部分有一個中央絲狀的核心，周圍有許多線粒體螺旋狀的螺旋體，用于atp的生產，通過女性子宮頸、子宮和子宮管；尾巴或“鞭毛”會執行推動精子細胞的鞭毛運動。在受精過程中，精子能為卵細胞提供3個基本部分：(1)信號或激活因子，使代謝休眠的卵母細胞激活；(2)單倍體父基因組；(3)中粒，負責形成中心體和微管系統。microrna(mirna)是1993年在秀麗線蟲中發現的一類單鏈、內源性的、非編碼的小rna，長度約為22個堿基，廣泛存在于動物、植物、病毒等多種有機體中。mirna作用于mrna的3’utr，從而抑制靶mrna的翻譯或者介導靶mrna的降解。通過這兩種方式對靶基因進行負調控，行使它的生物學功能。mirna的主要作用是調控基因的轉錄后表達，并且在表達上具有時序性和組織特異性。精子在細胞結構上不同于普通的細胞系或者細胞株，并且不能貼壁生長和分裂，而處于懸浮狀態，容易死亡。常規的lipofectamine2000、3000等脂質體轉染試劑對精子的轉染效果不佳，是因為這些轉染試劑在與需導入的核酸形成脂質體-dna復合物后，跟貼壁細胞相比，與懸浮的精子細胞的接觸機會大大降低，更難通過內吞作用進入細胞。由于x-tremegenesirnatransfectionreagent這種轉染試劑具有更高的轉染效率和更小的細胞毒性。因此，本發明采用這種經過優化的脂質體轉染試劑來轉染精子細胞。此外，本發明采用qrt-pcr對轉效率進行評估。將外源核酸導入動物精子是作為研究精子功能以及后續試驗的一種重要方法，因此一種有效的精子轉染方法是一切試驗的保證。技術實現要素：本發明針對上述存在的問題做出改進，即本發明要解決的技術問題是提供一種將mirna轉染進豬精子并評估其轉染效率的方法，該方法可以有效的將mirna轉染進豬精子中，并能評估mirna的轉染效率。為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種將mirna轉染進豬精子并評估其轉染效率的方法，包括以下步驟：a、首先將稀釋后的新鮮豬精液45度立于co2培養箱中孵育1h，接著用巴氏吸管吸出適量上層精子懸浮液，通過離心濃縮精子，然后加入等體積的稀釋液進行稀釋；b、使用x-tremegenesirnatransfectionreagent轉染試劑將mirna轉染進精子，將其放置于17℃保溫箱上，轉染6h；c、通過離心沉淀精子，然后使用trizolls抽提精子中的totalrna；d、對抽提出的totalrna進行mirna反轉錄以及相關mirna的定量，并對精子的轉染效率進行評估。進一步的，步驟a具體為：a1、將新鮮豬精液轉至數個50ml離心管中，傾斜45度立于5％co2、飽和濕度、37℃的培養箱中孵育1h，使具有高度活力的精子上游至溶液上層；a2、用巴氏吸管輕輕吸出上層精子懸浮液于新的50ml離心管中，1000rpm離心5min，去除上清液，得到具有高度活力的精子；a3、加入與上清液等體積的稀釋液重懸精子，使精子均勻分布在溶液中。進一步的，步驟b具體為：b1、轉染試驗分為mimicgroup(m)、mimicnegativecontrolgroup(mc)、inhibitorgroup(i)、inhibitornegativecontrolgroup(ic)、controlgroup(c)五個試驗組，m、mc組轉染體系為：2.5μlx-tremegenesirnatransfectionreagent與50μlopti-mem預混成a液，2.5μl20μmmirna存儲液與50μlopti-mem預混成b液；i、ic組轉染體系為：5μlx-tremegenesirnatransfectionreagent與50μlopti-mem預混成a液，5μlmirna與50μlopti-mem預混成b液；b2、五個組都按將a液預混5min，b液預混5min，再將a液和b液于一起預混20min；b3、將步驟a3得到的混勻精液分裝在數個無rna酶的1.5ml的ep管中，m、mc分別加入895μl的重懸精液，i、ic組分別加入890μl的重懸精液，c組加入1ml的重懸精液；b4、等a液b液20min預混時間到，將ab混合液分別加入已經加好精子重懸液的各組，m、mc組分別加入105μl，i、ic組加入110μl，五個組總體積均為1ml，蓋好ep管的蓋子，輕輕的上下顛倒，使其混合均勻；b5、將其放置于17℃保溫箱上，轉染6h。進一步的，步驟c具體為：c1、轉染6h后，按4000×g離心5min去除上清液，得到精子細胞；c2、每管加入1ml的trizolls試劑，用漩渦儀充分混合均勻，室溫放置5min；c3、加入200μl氯仿，蓋好管蓋，充分振蕩，于冰上靜置5min；c4、按12000×g，4℃離心15min后，樣品會自動分成三層：上層為無色的水相，中間為薄薄的白色蛋白層，下層為有顏色的有機相，輕輕吸取上清液轉移至一個新的離心管中，注意寧愿少吸也不要將其他層吸入以免造成蛋白質等污染；c5、加入500μl氯仿，蓋好管蓋，充分振蕩，于冰上靜置5min；c6、按12000×g，4℃離心15min后，再一次吸取上清液到新的1.5ml的ep管中，此步驟重復為獲得更純的rna；c7、向裝有上清液的ep管中加入等體積的異丙醇，并加入1μl的糖原以促進rna沉降，蓋好管蓋，充分振蕩，于冰上靜置15min；c8、按12000×g，4℃離心10min，試管底部會出現少量白色的沉淀物，棄去上清液保留沉淀；c9、沿ep管管壁緩慢地加入75％的乙醇1ml，蓋好管蓋，上下顛倒ep管，使白色沉淀漂浮在75％的乙醇中，更好的洗滌異丙醇等有機物，然后按12000×g，4℃離心5min，棄去乙醇保留沉淀；c10、于冰上干燥沉淀3min左右后，每管加入20μl的rnase-freedh2o溶解沉淀，得到的rna溶液于-80℃保存。進一步的，步驟d具體為：d1、使用mir-xtmmirnafirst-strandsynthesiskit試劑盒進行mirna的反轉錄，反應體系為：mrqbuffer5μl，totalrna3.75μl，mrqenzymemix1.25μl；反應條件為37℃60min，85℃5sec；d2、向得到的反轉錄反應液中添加90μlrnasefreedh2o進行稀釋，得到cdna；d3、對轉染進精子的mirna進行qrt-pcr定量，每個樣品重復3次，并用u6作為內參矯正，反應體系為：2×sybrgreenmixextaq5μl、forwardprimer0.5μl、reverseprimer0.5μl、rnase-freedh2o3μl、cdna1μl；反應條件為：95℃預變性10sec，95℃變性5sec，60℃退火20sec，40個循環；溶解曲線條件為：95℃60sec，55℃30sec，95℃30sec；d4、根據熒光定量結果，對精子細胞內mirna相對表達量進行計算。本發明的有益技術效果是：本發明采用45度孵育精子來獲得具有高度活力的精子，從而為下一步轉染實驗做好準備。本發明采用17℃保溫箱進行轉染實驗，從而能有效保證轉染過程中精子的損傷最小。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發明實施例1中精子轉染示意圖；圖2為本發明實施例2中mir-26a-5p熒光定量數值分段柱狀圖。具體實施方式下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。實施例1采集新鮮大白公豬精液，保留中段精液50ml，稀釋液(beltsvillethawingsolution稀釋粉50g用1000ml雙蒸水稀釋得到的稀釋液)與精液按1:1稀釋，得到100ml的稀釋后精液。該精液用于后續mirna的轉染。轉染大白公豬精液的方法包括以下步驟：(1)將稀釋后新鮮豬精液轉至兩個50ml離心管中，傾斜45度立于傾斜45度立于5％co2、飽和濕度、37℃恒溫培養箱中孵育1h，使具有高度活力的精子上游至溶液上層；(2)兩管用巴氏吸管均輕輕吸出20ml的上層精子懸浮液于一個新的50ml離心管中，1000rpm離心5min，去除上清液，得到具有高度活力的精子；(3)加入40ml的稀釋液重懸精子，使精子均勻分布在溶液中；(4)轉染試驗分為mimicgroup(m)、mimicnegativecontrolgroup(mc)、inhibitorgroup(i)、inhibitornegativecontrolgroup(ic)、controlgroup(c)五個試驗組，每個組6個重復，按表1將a液預混5min，b液預混5min，再將a液和b液于一起預混20min；表1精子轉染體系(5)將(3)中得到的混勻精液分裝在個30個無rna酶的1.5ml的ep管中，m、mc組分別加入895μl的重懸精液，i、ic組分別加入890μl的重懸精液，c組加1ml的重懸精液；(6)等a液b液20min預混時間到，將ab混合液分別加入已經加好精子重懸液的各組，m、mc組分別加入105μl，i、ic組分別加入110μl，五個組總體積均為1ml，蓋好ep管的蓋子，輕輕的上下顛倒，使其混合均勻；(7)將其放置于17℃保溫箱上，轉染6h。實施例2將實施例1中得到的轉染過mir-26a-5p的精子進行totalrna的抽提，mirna反轉錄和定量，以及轉染效率的評估。具體方法包括以下步驟：(1)轉染6h后，按4000×g離心5min去除上清液，得到精子細胞；(2)每管加入1ml的trizolls試劑，用漩渦儀充分混合均勻，室溫放置5min；(3)加入200μl氯仿，蓋好管蓋，充分振蕩，于冰上靜置5min；(4)按12000×g，4℃離心15min后，樣品會自動分成三層：上層為無色的水相(上清液)，中間為薄薄的白色蛋白層，下層為有顏色的有機相，輕輕吸取上清液轉移至一個新的離心管中，注意寧愿少吸也不要將其他層吸入以免造成蛋白質等污染；(5)加入500μl氯仿，蓋好管蓋，充分振蕩，于冰上靜置5min；(6)按12000×g，4℃離心15min后，再一次吸取上清液到新的1.5ml的ep管中，此步驟重復為獲得更純的rna；(7)向裝有上清液的ep管中加入等體積的異丙醇，并加入1μl的糖原以促進rna沉降，蓋好管蓋，充分振蕩，于冰上靜置15min；(8)按12000×g，4℃離心10min，試管底部出現少量白色的沉淀物，棄去上清液保留沉淀；(9)沿ep管管壁緩慢地加入75％的乙醇1ml，蓋好管蓋，上下顛倒ep管，使白色沉淀漂浮在75％的乙醇中，更好的洗滌異丙醇等有機物，然后按12000×g，4℃離心5min，棄去乙醇保留沉淀；(10)于冰上干燥沉淀3min左右后，每管加入20μl的rnase-freedh2o溶解沉淀，得到rna溶液(-80℃保存)；(11)使用mir-xtmmirnafirst-strandsynthesiskit試劑盒進行mirna的反轉錄，反應體系如表2。表2mirnas反轉錄體系試劑體積(μl)mrqbuffer5μlmrqenzymemix1.25μltotalrna3.75μl總體積10μl(12)反應條件為37℃60min，85℃5sec；(13)向得到的反轉錄反應液中添加90μlrnasefreedh2o進行稀釋，得到cdna；(14)對mir-26a-5p進行qrt-pcr定量，每個樣品重復3次，并用u6作內參矯正，反應體系如表3；反應條件為：95℃預變性10sec，95℃變性5sec，60℃退火20sec(加上熒光照相)，40個循環；溶解曲線條件為：95℃60sec，55℃30sec(加上熒光照相)，95℃30sec；表4為五個組精子中mir-26a-5p定量的ct值比較。表3mirna熒光定量反應體系試劑體積(μl)2×sybrgreenmixextaqtm5μlpcrforwardprimer0.5μlpcrreverseprimer0.5μlrnase-freedh2o3μlcdna1μl總體積10μl表4mir-26a-5p定量數值比較實施例2對實施例1中轉染mir-26a-5p后的精子進行了rna的抽提及mirna反轉錄及qrt-pcr定量，經計算后結果表明：m組mir-26a-5p的表達量最高，與mc組及c組均差異極顯著；i組mir-26a-5p的表達量最低，與ic組及c組均差異極顯著(表4，圖2)，以上結果證明mir-26a-5p確實能被轉染到大白公豬的精子中。當前第1頁12