本發明涉及生物醫用材料技術領域，特別涉及一種水溶性膠原的提取方法。
背景技術：
膠原種類較多，常見類型為ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型、ⅴ型和?型，膠原因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，而廣泛應用于食品、保健品、醫用生物材料、組織工程、化妝品等領域。在醫學領域中，膠原由于具有低免疫原性、纖維的再形成性、機械性能高和生物可降解性等優點，先后制成了醫用膠原海綿、膜性生物補片、人工皮膚、美容填充植入劑、化妝品等。
目前膠原提取方法提出的膠原溶解性多為酸溶或堿溶，這給制備適合人體需要的中性生物材料的制備帶來不小的麻煩。因此需要一種能在不破壞膠原原有三螺旋結構的情況下，能溶解于水的膠原。
技術實現要素：
為解決上述技術問題，本發明提供一種水溶性膠原的提取方法，能夠保證完整的三股螺旋結構的情況下去除末端肽，且通過此方法制備的膠原能溶解于水。技術方案如下：
本發明提供了一種水溶性膠原的提取方法，包括以下步驟，
先對富含iii型膠原的組織進行切片；
再將切片組織清洗浸泡在0.1%~40%(w/v)的堿溶液中，浸泡0.5~24h。清洗至ph為5~8后生理鹽水浸泡約0.5-48h，瀝去多余水分，2~8℃組織搗碎后分散進酶解液中，2~40℃環境酶解1~72h；酶解完畢后調ph值至7~13，2-40℃靜置2~24h；30~150目濾網過濾，去除未酶解物。20%-50%(w/v)鹽溶液鹽析，收集固形物，截留分子量為4000~8000的透析袋透析，去除多余離子和雜質，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調ph值至1~5，30~150目濾網過濾，去除析出物，將濾液鹽析后透析，得目的膠原。
在本發明的一種優選實施方式中，所述富含iii型膠原的組織為海參、小牛皮、胎牛皮、小豬皮、胎豬皮的一種或幾種；小牛皮、小豬皮動物年齡在0~3個月。
在本發明的一種優選實施方式中，所述浸泡用堿溶液的質量分數為0.1%~40%(w/v)。
在本發明的一種優選實施方式中，所述浸泡用堿溶液的溶質為氫氧化鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉中的一種或幾種；ph為8~14。
在本發明的一種優選實施方式中，所述生理鹽水溶質為氯化鈉，濃度為0.7~0.9%。
在本發明的一種優選實施方式中，所述酶解液為酸性蛋白酶，效價為1:1500~1:12000，酸性蛋白酶：組織切片為1:50~1:1000(w/w);酶解液ph值為2~6。
在本發明的一種優選實施方式中，所述鹽析用鹽溶液的溶質為氯化鈉、硫酸鈉、硫酸銨、氯化鉀、氯化鈣中的一種或幾種，濃度為20%~50%(w/v)。
在本發明的一種優選實施方式中，所述首次鹽析前待鹽析物的ph為7~13，再次鹽析前鹽析物的ph為1~5；調ph所用堿液為氫氧化鈉溶液、碳酸氫鈉溶液、檸檬酸鈉溶液中的一種或幾種；調ph所用酸液為鹽酸溶液、檸檬酸溶液、硫酸溶液、磷酸、醋酸溶液的一種或幾種，堿液濃度為0.01~5mol/l,酸液濃度為0.01~10mol/l。
在本發明的一種優選實施方式中，在對動物組織進行膠原提取之前，先對所述組織進行預處理；所述預處理為用水對組織進行反復沖洗，之后切片，再用質量分數為0.05%~20%醋酸氯己定溶液浸泡0.5~24h，再用水反復沖洗。
在本發明的一種優選實施方式中，所述切片為冷凍切片。
具體實施方式
需要說明的是，本發明所使用的水均為醫藥行業所用的純化水或注射用水，滿足藥典標準。
試劑和儀器
試劑均市售可得。
實施例1
選取新鮮的小牛皮組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；
稱取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡0.5h，純化水浸泡清洗5次，瀝去多余水分備用。再將切片組織清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸鈉溶液中，浸泡6h。純化水清洗至ph為8，然后用0.7%生理鹽水浸泡約2h，瀝去多余水分，2~8℃組織搗碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：組織切片為1:150的比例稱取酸性蛋白酶，蛋白酶效價為1:3000，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的4000ml鹽酸溶液中，攪拌均勻。調溶液ph為4。
將搗碎組織分散進酶解液中，最終定容到5000ml。4℃環境酶解72h；酶解完畢后，氫氧化鈉溶液調ph值至13，4℃靜置10h；
100目濾網過濾，去除未酶解物；20%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為生理鹽水水平，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調ph值至3，100目濾網過濾，去除析出物，將濾液用20%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為純化水水平，得目的膠原。
實施例2
選取新鮮的小牛皮組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；
稱取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡5h，純化水浸泡清洗5次，瀝去多余水分備用。再將切片組織清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸鈉溶液中，浸泡6h。純化水清洗至ph為7，然后用0.7%生理鹽水浸泡約2h，瀝去多余水分，2~8℃組織搗碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：組織切片為1:300的比例稱取酸性蛋白酶，蛋白酶效價為1:6000，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的4000ml鹽酸溶液中，攪拌均勻。調溶液ph為3。
將搗碎組織分散進酶解液中，最終定容到5000ml。4℃環境酶解48h；酶解完畢后，氫氧化鈉溶液調ph值至9，4℃靜置16h；
100目濾網過濾，去除未酶解物；20%(w/v)氯化鈣溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為生理鹽水水平，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調ph值至3，100目濾網過濾，去除析出物，將濾液用20%(w/v)氯化鈣溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為純化水水平，得目的膠原。
實施例3
選取新鮮的小豬皮組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；
稱取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡1h，純化水浸泡清洗5次，瀝去多余水分備用。再將切片組織清洗浸泡在3.0%(w/v)的碳酸鈉溶液中，浸泡6h。純化水清洗至ph為8，然后用0.7%生理鹽水浸泡約2h，瀝去多余水分，2~8℃組織搗碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：組織切片為1:80的比例稱取酸性蛋白酶，蛋白酶效價為1:1500，溶解到摩爾濃度為0.01mol/l的4000ml鹽酸溶液中，攪拌均勻。調溶液ph為5。
將搗碎組織分散進酶解液中，最終定容到5000ml。37℃環境酶解1h；酶解完畢后，氫氧化鈉溶液調ph值至10，4℃靜置12h；
100目濾網過濾，去除未酶解物；30%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為生理鹽水水平，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調ph值至4，100目濾網過濾，去除析出物，將濾液用30%(w/v)硫酸鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測硫酸根離子濃度為純化水水平，得目的膠原。
實施例4
選取新鮮的小牛皮組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；
稱取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，純化水浸泡清洗5次，瀝去多余水分備用。再將切片組織清洗浸泡在5%(w/v)的碳酸鈉溶液中，浸泡6h。純化水清洗至ph為8，然后用0.7%生理鹽水浸泡約2h，瀝去多余水分，2~8℃組織搗碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：組織切片為1:150的比例稱取酸性蛋白酶，蛋白酶效價為1:3000，溶解到摩爾濃度為0.1mol/l的4000ml磷酸溶液中，攪拌均勻。調溶液ph為4。
將搗碎組織分散進酶解液中，最終定容到5000ml。30℃環境酶解72h；酶解完畢后，氫氧化鈉溶液調ph值至13，4℃靜置24h；
100目濾網過濾，去除未酶解物；50%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為生理鹽水水平，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調ph值至5，100目濾網過濾，去除析出物，將濾液用50%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為純化水水平，得目的膠原。
實施例5
選取新鮮的小牛皮組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；
稱取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，純化水浸泡清洗5次，瀝去多余水分備用。再將切片組織清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸鈉溶液中，浸泡6h。純化水清洗至ph為8，然后用0.7%生理鹽水浸泡約2h，瀝去多余水分，2~8℃組織搗碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：組織切片為1:100的比例稱取酸性蛋白酶，蛋白酶效價為1:3000，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的4000ml鹽酸溶液中，攪拌均勻。調溶液ph為4。
將搗碎組織分散進酶解液中，最終定容到5000ml。4℃環境酶解72h；酶解完畢后，氫氧化鈉溶液調ph值至13，4℃靜置10h；
100目濾網過濾，去除未酶解物；20%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為生理鹽水水平，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調ph值至3，100目濾網過濾，去除析出物，將濾液用20%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為純化水水平，得目的膠原。
實施例6
選取新鮮的小牛皮組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；
稱取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡6h，純化水浸泡清洗5次，瀝去多余水分備用。再將切片組織清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸鈉溶液中，浸泡6h。純化水清洗至ph為8，然后用0.7%生理鹽水浸泡約2h，瀝去多余水分，2~8℃組織搗碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：組織切片為1:300的比例稱取酸性蛋白酶，蛋白酶效價為1:6000，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的4000ml鹽酸溶液中，攪拌均勻。調溶液ph為4。
將搗碎組織分散進酶解液中，最終定容到5000ml。4℃環境酶解72h；酶解完畢后，氫氧化鈉溶液調ph值至8，4℃靜置10h；
100目濾網過濾，去除未酶解物；20%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為生理鹽水水平，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調ph值至3，100目濾網過濾，去除析出物，將濾液用20%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為純化水水平，得目的膠原。
實施例7
選取新鮮的小牛皮組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；
稱取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，純化水浸泡清洗5次，瀝去多余水分備用。再將切片組織清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸鈉溶液中，浸泡6h。純化水清洗至ph為8，然后用0.7%生理鹽水浸泡約2h，瀝去多余水分，2~8℃組織搗碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：組織切片為1:150的比例稱取酸性蛋白酶，蛋白酶效價為1:3000，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的4000ml鹽酸溶液中，攪拌均勻。調溶液ph為6。
將搗碎組織分散進酶解液中，最終定容到5000ml。4℃環境酶解72h；酶解完畢后，氫氧化鈉溶液調ph值至9，4℃靜置10h；
100目濾網過濾，去除未酶解物；30%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為生理鹽水水平，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調ph值至2，100目濾網過濾，去除析出物，將濾液用30%(w/v)硫酸鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測硫酸根離子濃度為純化水水平，得目的膠原。
實施例8
選取新鮮的小牛皮組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；
稱取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡0.5h，純化水浸泡清洗5次，瀝去多余水分備用。再將切片組織清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸鈉溶液中，浸泡6h。純化水清洗至ph為8，然后用0.7%生理鹽水浸泡約2h，瀝去多余水分，2~8℃組織搗碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：組織切片為1:150的比例稱取酸性蛋白酶，蛋白酶效價為1:3000，溶解到摩爾濃度為0.01mol/l的4000ml鹽酸溶液中，攪拌均勻。調溶液ph為3。
將搗碎組織分散進酶解液中，最終定容到5000ml。4℃環境酶解72h；酶解完畢后，氫氧化鈉溶液調ph值至9，4℃靜置10h；
100目濾網過濾，去除未酶解物；40%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為生理鹽水水平，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調ph值至4，100目濾網過濾，去除析出物，將濾液用40%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為純化水水平，得目的膠原。
實施例9
選取新鮮的小牛皮組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；
稱取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡0.5h，純化水浸泡清洗5次，瀝去多余水分備用。再將切片組織清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸鈉溶液中，浸泡6h。純化水清洗至ph為8，然后用0.8%生理鹽水浸泡約16h，瀝去多余水分，2~8℃組織搗碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：組織切片為1:150的比例稱取酸性蛋白酶，蛋白酶效價為1:10000，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的4000ml鹽酸溶液中，攪拌均勻。調溶液ph為3。
將搗碎組織分散進酶解液中，最終定容到5000ml。35℃環境酶解48h；酶解完畢后，氫氧化鈉溶液調ph值至12，4℃靜置16h；
100目濾網過濾，去除未酶解物；20%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為生理鹽水水平，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調ph值至5，100目濾網過濾，去除析出物，將濾液用20%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為純化水水平，得目的膠原。
實施例10
選取新鮮的小牛皮組織0.5kg，水清洗至無肉眼可見異物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片，切片厚度約1mm，備用；
稱取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，純化水浸泡清洗5次，瀝去多余水分備用。再將切片組織清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸鈉溶液中，浸泡6h。純化水清洗至ph為8，然后用0.7%生理鹽水浸泡約2h，瀝去多余水分，2~8℃組織搗碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：組織切片為1:150的比例稱取酸性蛋白酶，蛋白酶效價為1:5000，溶解到摩爾濃度為0.02mol/l的4000ml鹽酸溶液中，攪拌均勻。調溶液ph為4。
將搗碎組織分散進酶解液中，最終定容到5000ml。4℃環境酶解72h；酶解完畢后，氫氧化鈉溶液調ph值至10，4℃靜置10h；
100目濾網過濾，去除未酶解物；20%(w/v)硫酸鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測硫酸根離子濃度為生理鹽水水平，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調ph值至3，100目濾網過濾，去除析出物，將濾液用20%(w/v)氯化鈉溶液鹽析，收集固形物，裝入透析袋透析，檢測氯離子濃度為純化水水平，得目的膠原。
以上所述僅是為了便于本領域的技術人員理解本發明的技術方案，并不用以限制本發明。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。