本發明屬于基因檢測領域，具體涉及一種適于少量樣本的用于染色體異常檢測的測序用文庫構建方法及試劑盒。
背景技術：
染色體是細胞核中的遺傳物質，人類有23對染色體，其中22對為常染色體，1對為性染色體。染色體異常包括染色體結構異常和數目異常，由染色體異常導致的疾病，臨床上表現為染色體病，在自發性流產、死胎、早夭中占50％以上，新生兒中發病率約1％，屬于常見的出生缺陷。
染色體數目異常指多1條或數條染色體、多1條或數條染色體片段，常見的染色體數目異常為13三體、18三體及21三體。在產前診斷中，染色體異常的主要檢測技術包括：核型分析、比較基因組雜交技術(arraycgh)、熒光原位雜交技術，但是由于羊水或臍帶血中胎兒遺傳物質較少，需要對遺傳物質進行放大。如對于核型分析來說，該方法需經過細胞培養富集胎兒細胞，非常耗時耗力，病人等待報告的周期長。
近年來，隨著下一代高通量測序(nextgenerationsequencing，ngs)技術的迅速發展，由于其存在分辨率高，通量大等優勢，目前已經被廣泛應用于染色體異常的分析。通過傳統的建庫方法能夠檢測染色體異常，還可發現新變異，但該方法通常要求較高的dna樣本起始量(100ng以上)，當采集樣本數量有限并無法獲得足量dna時(如臨床采集又不經實驗再放大的羊水、臍血等樣本)，通過現有的建庫方法往往不能得到滿足后續測序需求的文庫產量。若可以實現不經細胞培養，而是直接利用羊水、臍血等少量樣本進行建庫并檢測染色體異常，能夠大大節約實驗時間和檢測成本，將會有很廣闊的應用前景。
技術實現要素：
鑒于上述現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種能夠適用于羊水等少量樣本的用于染色體異常檢測的測序用文庫的構建方法及試劑盒。
本發明人為解決上述問題進行了深入研究，結果發現通過優化反應體系及反應條件，實現構建適用于羊水少量樣本的、染色體異常檢測的測序用文庫，從而完成了本發明。
即，本發明包括：
1.一種用于染色體異常檢測的文庫構建方法，該方法包括：
步驟a：提取樣本gdna，獲得gdna；
步驟b：將所述gdna進行酶切處理，純化，獲得酶切產物；
步驟c：將所述酶切產物進行末端修復，純化，得到平末端dna片段；
步驟d：將所述平末端dna片段進行3'端加a，得到3'端加a的dna片段；
步驟e：將所述3'端加a的dna片段進行加接頭，純化，得到加接頭的dna片段；
步驟f：將所述加接頭的dna片段進行pcr擴增，純化，得到擴增產物；
其中，步驟b中所述的酶切處理使用的酶為dsdnafragmentase；
步驟c中所述末端修復使用試劑包括：1μlt4dna聚合酶，1μlt4多聚核苷酸激酶、5μl10×多聚核苷酸激酶緩沖液及1μldntp；
步驟d中所述3'端加a使用試劑包括：0.5μlklenow片段(3'-5'exo-)、2.5μldatp及2.5μl10×緩沖液；
步驟f中所述pcr擴增的擴增引物包括：
ann引物序列(seqidno:1)：
5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac-3'
index引物序列(seqidno:2)：
5'-caagcagaagacggcatacgagatannnnnnngtgactggagttc-3'；
其中，n為隨機堿基。
2.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟a中樣本為羊水、臍血、全血、組織中任意一種。
3.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟b中gdna的量為8～15ng。
4.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟b的酶切處理的條件為37℃50分鐘。
5.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟c的末端修復的條件為20℃30分鐘。
6.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟d的3'端加a的反應條件為37℃30分鐘。
7.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟f的pcr擴增條件為94℃預變性2分鐘、(94℃變性15秒、62℃退火30秒、72℃延伸30秒)17個循環、72℃延伸10分鐘、4℃保存。
8.一種用于染色體異常檢測的文庫構建試劑盒，其用于實施項1～7中任一項所述的文庫構建方法，其包括：
用于所述酶切處理的試劑；
用于所述末端修復的試劑；
用于所述3'端加a的試劑；
用于所述加接頭的試劑；
用于所述pcr擴增的試劑；
用于所述純化的試劑。
發明效果
通過本發明提供的文庫構建方法和試劑盒，成功對臨床采集的少量羊水、臍帶血樣本進行文庫構建，實現了對少量羊水、臍帶血樣本的直接檢測，既避免了細胞培養的實驗耗時，極大的節約了染色體異常檢測的時間和檢測成本，提高了染色體異常檢測結果的準確性。
發明的具體實施方式
本說明書中提及的科技術語具有與本領域技術人員通常理解的含義相同的含義，如有沖突以本說明書中的定義為準。
首先，本發明提供一種用于染色體異常檢測的文庫構建方法，其包括：
步驟a：提取樣本gdna，獲得gdna；
步驟b：將所述gdna進行酶切處理，純化，獲得酶切產物；
步驟c：將所述酶切產物進行末端修復，純化，得到平末端dna片段；
步驟d：將所述平末端dna片段進行3'端加a，得到3'端加a的dna片段；
步驟e：將所述3'端加a的dna片段進行加接頭，純化，得到加接頭的dna片段；
步驟f：將所述加接頭的dna片段進行pcr擴增，純化，得到擴增產物；
其中，步驟b中所述的酶切處理使用的酶為dsdnafragmentase；
步驟c中所述末端修復使用試劑包括：1μlt4dna聚合酶，1μlt4多聚核苷酸激酶、5μl10×多聚核苷酸激酶緩沖液及1μldntp；
步驟d中所述3'端加a使用試劑包括：0.5μlklenow片段(3'-5'exo-)、2.5μldatp及2.5μl10×緩沖液；
步驟f中所述pcr擴增的擴增引物包括：
ann引物序列(seqidno:1)：
5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac-3'
index引物序列(seqidno:2)：
5'-caagcagaagacggcatacgagatannnnnnngtgactggagttc-3'；
其中，n為隨機堿基，nnnnnnn為標簽序列。在這里，標簽序列可作為不同樣本文庫的標記，不同樣本使用的標簽序列不同，測序后將測序數據按照標簽序列將樣本數據進行區分。
優選地，所述步驟a中樣本為羊水、臍血、全血、組織中任意一種。
在本發明中，所述低起始量是指dna量在8～15ng。
優選地，所述步驟a的羊水樣本為未經培養的樣本，gdna的量為10ng。
優選地，所述步驟b的酶切處理的條件為37℃50分鐘。
優選地，所述步驟c的末端修復條件為20℃30分鐘。
優選地，所述步驟d的3'端加a的反應條件為37℃30分鐘。
優選地，步驟f的pcr擴增條件為94℃2分鐘、(94℃15秒、62℃30秒、72℃30秒)17個循環、72℃10分鐘、4℃保存。
優選地，本發明的文庫構建方法中，步驟b與步驟c之間、步驟c與步驟d之間、步驟e和步驟f之間、步驟f之后還包括產物純化步驟。本發明發明人發現，在步驟d和步驟e之間不進行純化，可提高最后文庫產量。對于本發明的純化步驟，本發明技術領域人員可以采用傳統建庫中用于純化的方法、試劑或裝置來進行。
在另一方面，本發明提供一種用于染色體異常檢測的文庫構建試劑盒(本發明的試劑盒)，其可用于實施本發明的文庫構建方法。該試劑盒包括：
用于所述酶切處理的試劑，例如dsdnafragmentase及相應的酶切反應緩沖液等；
用于所述末端修復的試劑，例如t4dna聚合酶、t4多聚核苷酸激酶、dntp、10×多聚核苷酸激酶緩沖液等；
用于所述3'端加a的試劑，例如缺失外切酶活性的klenow片段及相應的反應緩沖液等；
用于所述加接頭的試劑，例如接頭、t4dna連接酶及相應的連接反應緩沖液；
用于所述pcr擴增的試劑，例如kapahifihotstartreadmix、ann公共引物、index引物等；
用于所述純化的試劑，例如核酸純化試劑(annoroad公司)、ampurexp純化磁珠(agencourt公司)等。
實施例
以下通過實施例對本發明進行更具體的說明。應當理解，此處所描述的實施例是用于解釋本發明，而非用于限定本發明。
實施例1
1.基因組(gdna)提取
取兩份羊水樣本，分別命名為樣本1、樣本2，各取2ml使用血液/組織/細胞基因組提取試劑盒(tiangen)進行基因組dna提取，獲得樣本1gdna、樣本2gdna。
2.酶切處理
樣本1和樣本2分別取10ng進行酶切處理，單個反應體系如下表1，
表1
反應條件為37℃，50分鐘；反應結束后，加入5μl，0.5medta終止反應2分鐘；加入2.5μl10％sds混勻后，取49.5μl純化磁珠懸浮液(annoroad公司)，70％乙醇洗兩次，43μlddh2o洗脫dna，獲得樣本1/樣本2酶切產物。
3.末端修復
對步驟2獲得的酶切產物進行末端修復，反應體系如下表2，
表2
反應條件為20℃，30分鐘，取75μl純化磁珠懸浮液，70％乙醇洗兩次，20μlddh2o洗脫dna，獲得樣本1/樣本2平末端dna片段。
4.3'端加a反應
取步驟3中獲得的平末端dna片段按表3進行3'端加a反應，反應體系如下：
表3
反應條件為37℃，30分鐘，獲得樣本1/樣本23'端加a的dna片段。5.加接頭反應
取步驟4中獲得的3'端加a的dna片段進行加接頭反應，反應體系如下表4，
表4
反應條件為20℃，15分鐘，取78μl純化磁珠懸浮液，70％乙醇洗兩次，18μlddh2o洗脫dna，得到樣本1/樣本2加接頭dna片段。
6.pcr反應
取步驟5中獲得的加接頭dna片段，使用表5中的反應體系進行pcr，反應體系如下表，樣本1使用index1引物，樣本2使用index2引物，
index1引物序列(seqidno:3)：
5'-caagcagaagacggcatacgagataagcaatggtgactggagttc-3'
index2引物序列(seqidno:4)：
5'-caagcagaagacggcatacgagataatccgaagtgactggagttc-3'
表5
反應條件為：
取45μl純化磁珠懸浮液，70％乙醇洗兩次，81μlddh2o洗脫dna，獲得樣本1/樣本2pcr擴增產物(文庫)，完成文庫構建。
7.文庫濃度測定
使用caliper和qpcr方法檢測文庫的峰圖和濃度。
分析結果如下表6，樣本1文庫產量為470nmol/l，樣本2文庫產量為695nmol/l，說明該方法成功建庫，符合測序要求。
表6
實施例2
使用550ar測序儀對步驟7中獲得的文庫進行測序，測序策略為se50。通過對數據進行對比分析，得到測序數據如下表7，分析測序數據發現(如下表8)樣本1中存在21三體，樣本2羊水中存在18三體。
為了進一步證明本發明的結果，使用核型分析的方法對樣本1和樣本2進行分析，分析發現樣本1存在21三體，樣本2存在18三體，結果與本發明方法獲得文庫的測序結果一致。
表7
表8
還需要說明的是，在可實施且不明顯違背本發明的主旨的前提下，在本說明書中作為某一技術方案的構成部分所描述的任一技術特征或技術特征的組合同樣也可以適用于其它技術方案；并且，在可實施且不明顯違背本發明的主旨的前提下，作為不同技術方案的構成部分所描述的技術特征之間也可以以任意方式進行組合，來構成其它技術方案。本發明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術方案，并且這些技術方案相當于記載在本說明書中。
上述說明示出并描述了本發明的優選實施例，如前所述，應當理解本發明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環境，并能夠在本文所述發明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域技術人員所進行的改動和變化不脫離本發明的精神和范圍，則都應在本發明所附權利要求的保護范圍內。
工業實用性
根據本發明，能夠適用于羊水樣本等少量樣本的、染色體異常檢測的文庫構建方法及試劑盒。
序列表
<110>安諾優達基因科技（北京）有限公司
<120>一種用于染色體異常檢測的文庫構建方法及試劑盒
<130>1701rgcn
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<400>ann引物
aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac45
<210>2
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<400>index引物
caagcagaagacggcatacgagatannnnnnngtgactggagttc45
<210>3
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<400>index1引物
caagcagaagacggcatacgagataagcaatggtgactggagttc45
<210>4
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<400>index2引物
caagcagaagacggcatacgagataatccgaagtgactggagttc45