口蹄疫病毒重組病毒樣粒子及其制備方法和應用與流程

本發明涉及口蹄疫病毒重組病毒樣粒子及其制備方法和應用，屬于基因工程疫苗領域。

背景技術：

口蹄疫(foot-and-mouthdisease,fmd)是由微rna病毒科口蹄疫病毒屬的口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,fmdv)所引起偶蹄動物以蹄、口、鼻等部位發生水皰為主要特征的一種急性、烈性傳染病。該病對牛、豬、羊等主要畜種危害尤為嚴重，不僅能夠引起感染動物的死亡，大大降低感染畜群的生產性能；還會對發生疫情的國家的國際動物及其制品貿易產生一定的負面影響，造成巨大的經濟損失。國際動物衛生組織(oie)將fmd列為法定上報的動物疫病首位，我國也將其列于一類動物傳染病。我國是fmd疫區，該病已成為危害我國養殖業最嚴重的動物疫病之一。

fmdv在含有七種血清型，分別為a、o、c、asia1、sat1、sat2和sat3。各個血清型fmdv生物學特性及發病特征相似，但各型間無交叉免疫反應。fmdv屬于單股負鏈rna病毒，基因組全長約8.5kb，含有一個orf編碼框，編碼一個多聚蛋白。p1區結構蛋白在病毒自身蛋白酶3c的作用下裂解為vp0、vp3和vp1，該三種蛋白單體相互結合形成5s單體，并自動組裝14s五聚體，12個五聚體進一步組裝形成病毒衣殼。基因組rna與病毒衣殼作用促使vp0自催化裂解為vp4和vp2蛋白，形成完整成熟的病毒粒子。

疫苗免疫是fmd的重要手段，其中，傳統疫苗滅活疫苗在現階段fmd防疫中發揮重要的作用。隨著疫苗學和病毒結構生物學等領域的不斷發展，新型疫苗開發研究是國內外一致關注的熱點領域。病毒樣顆粒(viruslikeparticles,vlps)疫苗是由一種或多種病毒結構蛋白組裝成的空衣殼結構，形態上與真正的病毒粒子相似。vlps不含有病毒基因組，在宿主體內無法進行復制，不具有感染性。vlps類似天然病毒粒子結構的特性，使其保留了大部分病毒的特異性抗原表位，也能夠模擬病毒對宿主感染過程，有效的刺激機體產生高水平的免疫應答，是潛在安全的候選疫苗。目前，多種商品化vlps疫苗應用于市場，如pcv-2，ev-71等。

技術實現要素：

本發明的目的在于，提供一種口蹄疫病毒樣粒子的構建方法及其在制備疫苗中的應用。

基于上述發明目的，本發明提供了一種用于制備重組口蹄疫病毒樣粒子的dna分子組合物，包括o型口蹄疫vp0基因、o型口蹄疫vp1基因和o型口蹄疫vp3基因；其中，o型口蹄疫vp0基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；o型口蹄疫vp1基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；o型口蹄疫vp3基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

進一步的，所述的用于制備重組口蹄疫病毒樣粒子的dna分子組合物，由所述o型口蹄疫vp0基因、所述o型口蹄疫vp1基因和所述o型口蹄疫vp3基因和綠色熒光蛋白egfp基因組成，其中，綠色熒光蛋白egfp基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

上述含有所述dna分子組合物的表達盒、重組載體、轉基因細胞系、重組菌或重組病毒也屬于本發明的保護范圍。

所述重組載體按照下述步驟構建：

1)將o型口蹄疫vp0基因插入到pfbdm載體的ecori和xbai酶識別位點之間，得到插入了o型口蹄疫vp0基因的重組載體，命名為pfbdm-vp0；將o型口蹄疫vp1基因插入到pfbdm-vp0的smai和kpni酶識別位點之間，得到插入了o型口蹄疫vp0基因和o型口蹄疫vp1基因的重組載體，命名為pfbdm-vp0/vp1；

2)將綠色熒光蛋白egfp基因插入到pfbdm載體的ecori和xbai酶識別位點之間，得到插入了綠色熒光蛋白egfp基因的重組載體，命名為pfbdm-egfp；將o型口蹄疫vp3基因插入到pfbdm-egfp的smai和kpni酶識別位點之間，得到插入了綠色熒光蛋白egfp基因和o型口蹄疫vp3基因的重組載體，命名為pfbdm-egfp/vp1；

3)將pfbdm-vp0/vp1質粒經spei/nrui酶切得到的大片段，與經過avrii/pmei酶切的pfbdm-egfp/vp3質粒產生的小片段連接，得到插入o型口蹄疫vp0、vp1基因、vp3基因和egfp基因的重組質粒，命名為pfbdm-vp0/vp1/vp3/egfp，即上述的含有所述dna分子組合物的重組載體。

上述重組載體的構建過程中，根據o/mya98p1段序列和綠色熒光蛋白egfp基因序列，設計用于擴增fmdv結構蛋白基因vp0、vp1、vp3和egfp的引物，設計的引物也在本發明保護范圍內。

所述o型口蹄疫vp0基因是以o型口蹄疫o/mya98株基因組cdna為模板，以引物vp0f和vp0r擴增獲得；o型口蹄疫vp1基因是以o型口蹄疫o/mya98株基因組cdna為模板，以引物vp1f和vp1r擴增獲得；o型口蹄疫vp3基因是以o型口蹄疫o/mya98株基因組cdna為模板，以引物vp3f和vp3r擴增獲得；綠色熒光蛋白egfp基因是以pegfp-n1為模板，以引物egfpf和egfpr擴增獲得；引物序列如下所示：

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本發明的又一個目的是提供一種制備重組口蹄疫病毒樣粒子的方法，包括以下步驟：

1)將所述的dna分子組合物通過重組載體轉化dh10bac感受態細胞，通過篩選鑒定，得到重組桿狀病毒表達質粒；

2)步驟1)獲得的重組桿狀病毒表達質粒轉染sf9細胞，經培養傳代3次，細胞培養凍融處理3次，離心，過濾除菌后，獲得重組桿狀病毒。

所述重組載體優選為上述的重組載體。

上述的方法制備得到的重組病毒樣顆粒。

本發明的再一目的是保護一種重組口蹄疫病毒樣粒子，所述重組口蹄疫病毒樣粒子是由所述的dna分子組合物中的組分共同組裝表達的。

更進一步的，所述重組口蹄疫病毒樣粒子是按照上述的方法制備得到的重組桿狀病毒樣顆粒。

本發明還要求保護一種預防和/或治療口蹄疫感染的疫苗，其活性成分為所述的重組口蹄疫病毒樣粒子。

所述的重組口蹄疫病毒樣粒子在制備預防和/或治療口蹄疫感染的疫苗中的應用也屬于本發明的保護范圍。

關于fmdvvlps研究方面，研究人員嘗試通過痘病毒載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體及大腸桿菌載體等系統建立fmdvvlps的模型。其中，桿狀病毒系統在fmdvvlps的開發及應用中具有其他載體系統無可比擬的優勢。

基于上述的技術方案，本發明的口蹄疫病毒重組病毒樣粒子，利用fmdv結構蛋白vp0、vp3和vp1自組裝成口蹄疫病毒重組病毒樣粒子(fmdvvlps)的特性，改良fmdvvlps桿狀病毒重組載體的構建方法，并在載體中加入了綠色熒光蛋白標記，通過pfbdmbac-to-bac系統成功制備出fmdvvlps，提供了一種優異的基因工程疫苗。

本發明的另一個進步在于解決3c蛋白的細胞毒性問題及vlps組裝效率低下的問題。由于3c蛋白酶的細胞毒性及p1蛋白不能切割完全，這些在昆蟲細胞表達的重組蛋白組裝效率及產量普遍偏低。構建能夠同時表達vp0、vp1和vp3三種衣殼蛋白的重組桿狀病毒，有效的避免了之前桿狀病毒系統表達fmdvvlps研究中3c蛋白酶的細胞毒性問題和p1基因切割不完全造成vlps組裝效率低下的問題。

本發明還解決細胞病變的可觀察性不強方面的問題。桿狀病毒的感染滴度、感染復數、感染時間等參數的確定是制約桿狀病毒系統大規模生產的主要因素。其中，桿狀病毒的滴度的確定是其擴大應用的基礎。實驗室通常通過噬斑試驗和tcid50試驗確定病毒的滴度，由于桿狀病毒感染時細胞病變可觀察性對操作人員具有一定的要求，具有較大的不可控性。本發明在構建重組fmdv衣殼蛋白桿狀病毒時加入了綠色熒光標簽egfp蛋白，可通過細胞在熒光顯微鏡下是否能夠表達egfp來確定是否存在病毒的感染，能夠很好的解決細胞病變的可觀察性不強方面的問題。此外，egfp蛋白不參與fmdvvp0、vp1和vp3三種衣殼蛋白自組裝vlps生物過程，在后續vlps純化過程中可通過相應的策略有效的去除，對后續的應用無影響。

試驗證明，本發明病毒樣顆粒rbac-fluofmdv感染sf9細胞過程中能夠表達fmdv的衣殼蛋白vp0、vp1和vp3，初步純化的病毒樣顆粒rbac-fluofmdv樣品負染后進行透射電鏡觀察，可見其直徑大小為25～30nm病毒樣顆粒，并且中間發亮，表明rbac-fluofmdv感染sf9細胞過程中表達的vp0、vp1和vp3衣殼蛋白能夠組裝成vlps。以tcid50方法檢測rbac-fluofmdvp3代病毒滴度為10^-7.5/0.1ml。

附圖說明

圖1：o型fmdvvp0、vp1、vp3及egfp基因的克隆；1:dl5000dnamaker；2:egfp基因；3：vp0基因；4：vp1基因；5：vp3基因。

圖2a：vp0、vp1、vp3片段的克隆流程示意圖。

圖2b：egfp片段的克隆流程示意圖。

圖3：重組質粒構建示意圖。

圖4：rbac-fluofmdvp3感染sf9細胞綠色熒光的觀察。

圖5：rbac-fluofmdv感染sf9細胞重組蛋白的表達的westernblot檢測；

1:sf9細胞正常組；2:rbac-fluofmdvp2代感染的sf9細胞培養物；3：rbac-fluofmdvp3代感染的sf9細胞培養物；4：蛋白maker。

圖6：sf9細胞感染表達rbac-fluofmdvvlps電鏡圖片。

具體實施方式

以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發明，其不以任何方式限制本發明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。

實施例1重組載體pfbdm-vp0/vp1/vp3/egfp的構建

以o/mya98/xj/2010株基因組cdna為模板(o/mya98/xj/2010株基因組cdna可由市售的含有o/mya98/xj/2010株的口蹄疫o型滅活疫苗中提取rna經反轉錄獲得)，分別設計相應的引物(見表1)。以引物vp0f和vp0r擴增獲得o型口蹄疫vp0基因，該片段長909bp，測序表明，其核苷酸序列為序列表中序列1所示。以引物vp1f和vp1r擴增獲得o型口蹄疫vp1基因，該片段長639bp，測序表明，其核苷酸序列為序列表中序列2所示。以引物vp3f和vp3r擴增獲得o型口蹄疫vp3基因，該片段長660bp，測序表明，其核苷酸序列為序列表中序列3所示。上述擴增的示意圖請見圖2a,擴增產物的電泳圖請見圖1。

pegfp-n1質粒本實驗室保存，以pegfp-n1為模板，根據egfp基因序列，設計相應的引物(見表1)，以引物egfpf和egfpr擴增獲得綠色熒光蛋白egfp基因，片段長度為720bp，測序表明，其核苷酸序列為序列表中序列4所示。上述擴增的示意圖請見圖2b,擴增產物的電泳圖請見圖1。

表1.各片段的擴增引物

分別將擴增得到的o型口蹄疫vp0基因和綠色熒光蛋白egfp基因片段經ecori/xbai酶切消化后得到的片段，與經過相同的限制性內切酶酶切的pfbdm載體(普如汀生物技術(北京)有限公司)連接，將連接產物轉化e.colidh10b感受態細胞，涂布含有氨芐青霉素的lb平板，37℃過夜培養。挑取平板上的單菌落，在含有氨芐青霉素的液體lb培養基中培養6h，分別利用表1中vp0和egfp的克隆引物進行菌液pcr鑒定，陽性菌落送生工測序。將測序正確的菌液以1:500加入到新鮮的含有氨芐抗生素的lb培養基中，培養過夜，提取質粒，即得到插入o型口蹄疫vp0基因的重組質粒陽性克隆和插入綠色熒光蛋白egfp基因的重組質粒陽性克隆，將測序表明插入了o型口蹄疫vp0基因的重組質粒命名為pfbdm-vp0，將測序表明插入綠色熒光蛋白egfp基因的重組質粒命名為pfbdm-egfp。保存備用。上述重組質粒構建示意圖見圖3。

進一步將擴增得到的vp1基因和vp3基因片段經smai/kpni酶切消化后得到的片段，分別與經過相同的限制性內切酶酶切的pfbdm-vp0和pfbdm-egfp重組載體連接，將連接產物轉化e.colidh10b感受態細胞，涂布含有氨芐青霉素的lb平板，37℃過夜培養。挑取平板上的單菌落，在含有氨芐青霉素的液體lb培養基中培養6h，分別利用表1中vp1和vp3的克隆引物進行菌液pcr鑒定，陽性菌落送生工測序。將測序正確的菌液以1:500加入到新鮮的含有氨芐抗生素的lb培養基中，培養過夜，提取質粒，即分別得到插入o型口蹄疫vp0和vp1基因的重組質粒陽性克隆、和插入vp3基因和egfp基因的重組質粒陽性克隆。將測序表明插入o型口蹄疫vp0和vp1基因的重組質粒命名為pfbdm-vp0/vp1；將測序表明插入vp3基因和egfp基因的重組質粒命名為pfbdm-egfp/vp3。將重組質粒保存備用，上述重組質粒構建示意圖見圖3。

將提取的pfbdm-vp0/vp1質粒經spei/nrui酶切消化后得到的大片段，與經過avrii/pmei酶切的pfbdm-egfp/vp3質粒產生的小片段連接，將連接產物轉化e.colidh10b感受態細胞，涂布含有氨芐青霉素的lb平板，37℃過夜培養。挑取平板上的單菌落，在含有氨芐青霉素的液體lb培養基中培養6h，分別利用表1中vp1和vp2的克隆引物進行菌液pcr鑒定，陽性菌落送生工測序。將測序正確的菌液以1:500加入到新鮮的含有氨芐抗生素的lb培養基中，培養過夜，提取質粒，即得到插入o型口蹄疫vp0、vp1基因、vp3基因和egfp基因的重組質粒陽性克隆，將該測序正確的插入o型口蹄疫vp0、vp1基因、vp3基因和egfp基因的重組質粒命名為pfbdm-vp0/vp1/vp3/egfp。將重組質粒保存備用，其構建示意圖見圖3。

實施例2重組桿狀病毒rbac-fluofmdv的制備

將pfbdm-vp0/vp1/vp3/egfp重組質粒轉化dh10bac感受態細胞，在含有四環霉素和卡那霉素的液體lb培養基中培養4h，涂布含有慶大霉素、四環霉素和卡那霉素的lb平板，通過兩輪藍白斑篩選，挑取白色菌落，用m13f/vp1f和vp0f/m13r引物對(m13f/r引物是根據invitrogen公司bac-to-bac說明書提供的序列合成)，進行菌液pcr檢測鑒定，擴大培養正確菌株，提取重組桿狀病毒表達質粒，將其命名為bacmid-vp0/vp1/vp3/egfp，保存備用。

將對數生長期的sf9細胞鋪于六孔板，重組桿狀病毒表達質粒bacmid-vp0/vp1/vp3/egfpdna按照轉染試劑lipofectamine3000的轉染方法要求，進行稀釋，與轉染試劑混合，轉染sf9細胞。27℃恒溫培養箱中培養96h，收集細胞培養上清，經8000rpm離心5min，收集上清，經過濾除菌后，獲得重組桿狀病毒p0代病毒，保存備用，將該重組桿狀病毒命名為rbac-fluofmdv。

實施例3重組桿狀病毒rbac-fluofmdv的擴增與毒價測定

將rbac-fluofmdvp0代病毒按照病毒與培養基1/10(v/v)比例接種處于對數生長期的sf9細胞，27℃恒溫培養箱中培養96h，收集細胞培養上清，經8000rpm離心5min，收集上清，獲得p1代病毒。以p1代病毒進行擴增得到p2代，以p2病毒進行擴增得到p3代。以tcid50方法檢測rbac-fluofmdvp3代病毒滴度為10^-7.5/0.1ml。

實施例4重組蛋白在昆蟲細胞sf9中的表達及鑒定

將對數生長期的sf9細胞鋪于六孔板，接種代及p3代rbac-fluofmdv病毒，感染后60h，利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白egfp表達的情況。結果如圖4所示，重組桿狀病毒能夠大量表達綠色熒光蛋白，而未感染重組病毒的sf9細胞對照組無綠色熒光，說明綠色熒光蛋白獲得了成功的表達。

為進一步鑒定fmdv各結構蛋白的表達情況，將p2代及p3代細胞樣品進行westernblot分析，以o型fmdv豬多抗血清作為一抗，hrp標記羊抗豬igg為上海生工公司產品。用ecl顯色試劑盒顯色，使用化學發光曝光顯色。結果如圖5所示，與豬抗o型fmdv高免血清發生特異性反應的條帶與fmdv衣殼蛋白vp0(約33kd)、vp1和vp3(約24kd)分子量大小相符，表明rbac-fluofmdv感染sf9細胞過程中能夠表達fmdv的衣殼蛋白vp0、vp1和vp3。

實施例5病毒樣顆粒的大量制備

將合適密度的sf9細胞接種于搖瓶中，27℃110rpm恒溫培養箱中振蕩培養，待其密度達到2×10⁶cells/ml，以moi為5接種p3代重組桿狀病毒rbac-fluofmdv，27℃110rpm恒溫培養箱中振蕩培養72h，離心收集細胞沉淀，用1/20體積的ph8.0的pbs重懸細胞，與-80℃和室溫反復凍融3次，12000g離心10min，收集上清，即為初始病毒樣顆粒溶液。

實施例6病毒樣顆粒的初步純化

將實施例5中獲得的病毒樣顆粒溶液用0.22μm的濾膜過濾，取上清溶液做30％蔗糖墊層處理，35000g離心3.5小時，用1/10體積的pbs重懸，保存備用。

實施例7病毒樣顆粒的鑒定

實施例6初步純化的病毒樣顆粒樣品負染后進行透射電鏡觀察，結果如圖6所示，可見其直徑大小為25～30nm病毒樣顆粒，并且中間發亮，表明rbac-fluofmdv感染sf9細胞過程中表達的vp0、vp1和vp3衣殼蛋白能夠組裝成vlps。

以上對本發明具體實施方式的描述并不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求的范圍。

序列表

<110>中牧實業股份有限公司

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