一種生產無巖藻糖基化蛋白的基因工程細胞系及其建立方法與流程

本發明屬于生物工程
技術領域：
，涉及一種可以生產無巖藻糖基化蛋白的基因工程細胞系及其建立方法。技術背景自從1986年批準第一個抗體藥物以來，抗體類藥物已經過30多年的蓬勃發展，由于抗體藥物具有高度的靶向性、特異性、專一性等明顯優勢，治療領域也從傳統的癌癥、自身免疫性疾病逐步擴展到抗感染、代謝性疾病以及心血管疾病的診治方面等，并取得了矚目的療效，在其改善患者生存質量的同時，也創造了巨大的經濟效益。針對腫瘤的抗體除了阻斷靶點介導的信號轉導從而誘導細胞凋亡外，更多的治療性抗體通過以下效應功能發揮治療作用：細胞依賴的細胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，adcc)、細胞依賴的吞噬作用(antibody-dependentcellularphagocytosis，adcp)、補體依賴的細胞毒性作用(complement-dependentcytotoxicity，cdc)等。細胞依賴的細胞毒性作用(adcc)是指表達抗體fc受體(如fcγriiia)的自然殺傷細胞(nk)、巨噬細胞或中性粒細胞等，通過fc受體與已結合在靶細胞表面的igg抗體的fc段結合，進而活化，釋放穿孔素、顆粒酶等細胞毒物質直接殺傷靶細胞的作用。adcc是治療性抗體臨床療效的關鍵機制之一，對于抗體發揮療效至關重要，這一點也得到了臨床研究的支持。抗體與fc受體(如fcγriiia)的結合情況直接影響抗體的adcc效應功能，可以通過改變抗體fc段的蛋白結構或是fc段的寡糖鏈修飾以增強抗體與fc受體(如fcγriiia)的結合能力，進而增強adcc效應，增強抗體臨床治療效果。增強治療性抗體的效應功能不僅能夠獲得更好的治療效果，同時可以減少治療所需抗體用量從而降低治療成本。近年來，研究發現去除或降低巖藻糖基化后，治療性抗體在動物體內或臨床表現出更好的療效。主要是由于去除或降低巖藻糖基化的抗體提高與fcγriiia親和力，可以在更低濃度下通過與fcγriiia的高親和力而表現出較強的adcc作用，去除或降低巖藻糖基化成為提高下一代治療性抗體效能的有效方法之一。因此，研究出能生產無巖藻糖基化抗體的工程細胞株是本領域的技術人員急待解決的問題。但目前大多數單克隆抗體都是由中國倉鼠卵巢細胞(cho)細胞制備的，這類抗體的核心巖藻糖基化水平很高，如何去除抗體fc區的核心巖藻糖提高其adcc效應是目前此類抗體研究的主要熱點之一。其中，于2013年被批準上市的gazyva(obinutuzumab)，是獲批上市的糖工程化單克隆抗體，其巖藻糖敲除是基于羅氏的glycomabtm技術平臺，通過高表達β-1,4-n乙酰葡萄糖胺基-轉移酶iii(gntiii酶)，促進n-糖末端平分型半乳糖苷的加入，進而抑制抗體核心巖藻糖修飾，進一步增強了抗體的adcc活性。但是該糖基化改造技術存在一定的缺陷：該技術通過引入平分型半乳糖苷，使得抗體上的糖型多達30種以上，其種類更多、更為復雜化，增加了糖型的異質性和產品的質量控制難度；此外該方法的巖藻糖去除效率低，仍有約30％的糖型含有核心巖藻糖。本申請通過對slc35c1和fut8兩個基因同時敲除能夠完全去除蛋白的巖藻糖基化，并且傳30代次后仍無法檢測到巖藻糖基化的蛋白，解決了巖藻糖基化去除不完全和傳代不穩定的兩大問題。技術實現要素：為了克服現有技術的缺陷，本發明提供了一種可以完全去除蛋白巖藻糖基化的方法，所述方法是通過敲除slc35c1基因、和/或fut8基因來實現去除細胞生產出的蛋白巖藻糖基化的目的。根據上述方法，本發明還提供了一種可用于生產無巖藻糖基化蛋白的基因工程細胞系，使用該基因工程細胞系可以制備無巖藻糖基化的蛋白。在本發明具體實施例中，使用該基因工程細胞系可以制備無巖藻糖基化的抗cd20的單克隆抗體。無巖藻糖基化的抗cd20的單克隆抗體與巖藻糖基化的抗cd20的單克隆抗體相比，具有增強的adcc效應。根據本發明的一個方面，本發明提供了一種生產無巖藻糖基化蛋白的基因工程細胞系，所述基因工程細胞系是slc35c1基因沉默、和/或fut8基因沉默的細胞系。進一步，所述基因工程細胞系對以下至少一種凝集素具有抗性：小扁豆凝集素、豌豆凝集素、蠶豆凝集素、陳皮木耳凝集素。進一步，所述蛋白是含有fc區的蛋白。進一步，所述基因工程細胞系中含有編碼含有fc區的蛋白的核苷酸序列。所述編碼含有fc區的蛋白的核苷酸序列可以獨立于所述基因工程細胞系的基因組存在，也可以整合到所述基因工程細胞系的基因組中。進一步，所述基因工程細胞系中含有cas9基因序列。所述cas9基因序列可以獨立于所述基因工程細胞系的基因組存在，也可以整合到所述基因工程細胞系的基因組中。本發明的cas9包括但不限于spcas9、cas9-nickase(cas9n)、dcas9-foki等。在本發明的具體實施方式中，本發明采用的是spcas9。進一步，所述基因工程細胞系中含有針對slc35c1基因的sgrna的基因序列、和/或含有針對fut8基因的sgrna的基因序列。所述sgrna的基因序列可以獨立于所述基因工程細胞系的基因組存在，也可以整合到所述基因工程細胞系的基因組中。根據本發明的另一個方面，本發明提供了前面所述的基因工程細胞系的建立方法，所述建立方法包括如下步驟：敲除宿主細胞中的slc35c1基因、和/或fut8基因，獲得slc35c1基因沉默、和/或fut8基因沉默的細胞系。進一步，所述建立方法包括如下步驟：利用crispr/cas9技術敲除宿主細胞中的slc35c1基因、和/或fut8基因，獲得slc35c1基因沉默、和/或fut8基因沉默的細胞系。再進一步，所述建立方法包括如下步驟：針對單獨敲除slc35c1基因來說，(1)利用crispr/cas9技術，針對宿主細胞中的slc35c1基因設計sgrna序列，將其基因序列與cas9基因序列同時導入宿主細胞中；(2)抗性壓力篩選獲得生產無巖藻糖基化蛋白的基因工程細胞系；針對單獨敲除fut8基因來說，(1)利用crispr/cas9技術，針對宿主細胞中的fut8基因設計sgrna序列，將其基因序列與cas9基因序列同時導入宿主細胞中；(2)抗性壓力篩選獲得生產無巖藻糖基化蛋白的基因工程細胞系；針對同時敲除slc35c1基因和fut8基因來說，(1)利用crispr/cas9技術，針對宿主細胞中的slc35c1基因和fut8基因分別設計sgrna序列，將其基因序列與cas9基因序列同時導入宿主細胞中；(2)抗性壓力篩選獲得生產無巖藻糖基化蛋白的穩定基因工程細胞系。上述建立方法中，將sgrna基因序列與cas9基因序列同時導入宿主細胞中的步驟可以包括：將sgrna基因序列與cas9基因序列分別連接到載體上構建敲除載體，將兩個敲除載體同時轉染進入宿主細胞中。作為可替代的方式，將sgrna基因序列與cas9基因序列同時導入宿主細胞中的步驟可以包括：將sgrna基因序列與cas9基因序列共同連接到一個載體上構建敲除載體，將構建的敲除載體轉染進入宿主細胞中。在本發明的具體實施方案中，將sgrna基因序列與cas9基因序列同時導入宿主細胞中的步驟包括：將sgrna基因序列與cas9基因序列共同連接到一個載體上構建敲除載體，將構建的敲除載體轉染進入宿主細胞中。根據本發明的又一個方面，本發明提供了一種無巖藻糖基化的蛋白。所述蛋白是由前面所述的基因工程細胞系產生的。根據本發明的又一個方面，本發明提供了一種前面所述的無巖藻糖基化的蛋白的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：(1)根據前面所述的建立方法建立前面所述的基因工程細胞系；(2)將蛋白的編碼序列導入步驟(1)獲得的基因工程細胞系中，獲得無巖藻糖基化的蛋白。根據本發明的又一個方面，本發明提供了前面所述的基因工程細胞系在制備無巖藻糖基化的蛋白中的應用。本發明的蛋白可以是重組蛋白，也可以是內源性蛋白。重組蛋白是將編碼蛋白的核酸序列構建到表達載體中并將其導入宿主細胞以表達形成的外源蛋白。在具體的實施方式中，本發明的蛋白是重組蛋白。在具體的實施方式中，本發明的蛋白是含有fc的蛋白。本發明的含有fc的蛋白包括抗體、雙特異性抗體、免疫粘附素和其它至少包含免疫球蛋白ch2和ch3區域的功能部分的結合蛋白。“功能部分”是指能夠結合fc受體(例如fcγr或fcrn)的ch2和ch3區域，和/或能夠參與補體激活的區域。如果ch2和ch3區域包含刪除、置換、和/或插入或使其不能結合任何fc受體并且也不能激活補體的其它修飾，則該ch2和ch3區域不是功能性的。本發明的含有fc的蛋白還包括抗體衍生物，抗體衍生物包含抗體或包含抗體的fc結構域或fc區，通過共價結合異源分子進行修飾。抗體衍生物的例子包括結合結構域-ig融合體，其中所述結合結構域可以是，例如，配體、受體的胞外結構域、肽、非天然形成的肽，等等。免疫球蛋白或fc區的示范性融合體的例子包括：依那西普，其為stnfrii與fc區的融合蛋白(美國專利5,605,690)；阿來法塞，其為抗原呈遞細胞上表達的lfa-3與fc區的融合蛋白(美國專利5,914,111)；細胞毒t淋巴細胞相關抗原-4(ctla-4)與fc區的融合蛋白(j.exp.med.181:1869(1995))；白介素15與fc區的融合蛋白(j.immunol.160:5742(1998))；因子vii與fc區的融合蛋白(proc.natl.acad.sci.usa98:12180(2001))；白介素10與fc區的融合蛋白(j.immunol.154:5590(1995))；白介素2與fc區的融合蛋白j.immunol.146:915(1991))；cd40與fc區的融合蛋白(surgery132:149(2002))；flt-3(fms-樣酪氨酸激酶)與抗體fc區的融合蛋白(acta.haemato.95:218(1996))；ox40與抗體fc區的融合蛋白(j.leu.biol.72:522(2002))；以及與下述分子的融合蛋白：其他cd分子(例如，cd2，cd30(tnfrsf8)，cd95(fas)，cd106(vcam-i)，cd137)，粘附分子(例如，alcam(激活的白細胞粘附分子)，鈣粘著蛋白，icam(胞內粘附分子)-1，icam-2，icam-3)細胞因子受體(例如，白介素-4r，白介素-5r，白介素-6r，白介素-9r，白介素-10r，白介素-12r，白介素-13rα1，白介素-13rα2，白介素-15r，白介素-21rα)，趨化因子，細胞死亡誘導信號分子(例如，b7-h1，dr6(死亡受體6)，pd-1(程序化死亡-1)，trailr1)，共刺激分子(例如，b7-1，b7-2，b7-h2，icos(可誘導共刺激物))，生長因子(例如，erbb2，erbb3，erbb4，hgfr)，分化誘導分子(例如，b7-h3)，活化因子(例如，nkg2d)，信號轉移分子(例如，gpl30)，bcma，和taci。利用本發明的前面所述的基因工程細胞系可以制備出任何種類的無巖藻糖基化的抗體或抗體衍生物。利用本發明的前面所述的基因工程細胞系制備出的無巖藻糖基化的抗體或抗體衍生物的實例包括但不限于：抗her2單抗：曲妥珠單抗(trastuzumab，美國專利no5821337)、帕妥珠單抗(pertuzumab,美國專利no7862817)；抗egfr單抗：西妥昔單抗(cetuximab，美國專利no6217866)；抗cd20單抗：利妥昔單抗(rituximab，世界專利wo9411026)、obinutuzumab(中國專利授權公告號：cn1902231b)、ocrelizumab(中國專利公開號：cn101151278)；抗cd19單抗：輕重鏈cdr與hd37雜交瘤(pezzutto(1997),j.immunol.138,2793-9)相同的igg1嵌合抗體；抗cld18a2抗體：imab362(中國專利授權公告號：cn101687929)。在本發明的具體實施例中，利用本發明的前面所述的基因工程細胞系制備出的無巖藻糖基化的蛋白是無巖藻糖基化的抗cd20的抗體。抗cd20的抗體的重鏈蛋白序列如seqidno.1所示，編碼重鏈蛋白的dna序列如seqidno.29；輕鏈蛋白序列如seqidno.2所示，編碼輕鏈蛋白的dna序列如seqidno.30。利用本發明的基因工程細胞制備出的抗體包括但不限于鼠源抗體、人源化抗體、嵌和抗體、全人源抗體。優選地，本發明的基因工程細胞制備出的抗體是igg型單克隆抗體。利用本發明的基因工程細胞制備出的抗體可以是igg的不同亞型，包括igg1、igg2、igg3、igg4。按照本發明的方法制備的抗體和抗體衍生物可用于各種治療或非治療用途。例如，所述抗體可用作治療抗體。抗體衍生物(例如，受體-fc融合體)可用作治療分子。所述抗體或抗體衍生物可與其他分子偶聯。所述抗體偶聯于合適的藥物(例如，抗體藥物偶聯物)或其他活性劑。所述抗體和抗體衍生物也可用于非治療目的，如診斷試驗、預后試驗、釋放試驗，等等。按照本發明方法制備的抗體和抗體衍生物可被制成治療用品或非治療用品。所述抗體和衍生物可被制成藥物組合物，其中包含治療或預防有效量的抗體或衍生物以及一種或多種藥學上相容的(可接受的)成分。例如，藥物或非藥物組合物通常包含一種或多種藥物載體(例如無菌液體，如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等)。靜脈內給予該藥物組合物時，水是更常見的載體。鹽水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液體載體，特別適用于注射液。合適的賦形劑包括，例如，氨基酸、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊(chalk)、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，組合物也可含有少量潤濕劑或乳化劑或ph緩沖劑。這些組合物可采取溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末劑、緩釋制劑等形式。e.w.martin的《雷明頓藥物科學》(remington'spharmaceuticalsciences)描述了合適藥物載體的例子。這種組合物通常含有治療有效量的蛋白質，通常為純化形式，以及適量載體，以提供適合給予患者的形式。制劑對應于給藥方式。靜脈內給予的組合物通常是無菌等滲水性緩沖液配制的溶液。如果需要，藥物也可含有增溶劑和局部麻醉劑，例如利多卡因來減輕注射部位的疼痛。通常，各成分單獨提供或混合在一起以單位劑型的形式提供，例如在標明活性物質含量的密封容器如安瓿或藥囊中的凍干粉末或無水濃縮物。通過輸液給予該藥物時，可用含有無菌藥物級水或鹽水的輸液瓶分配該藥物。通過注射給予該藥物時，可提供一安瓿的無菌注射用水或鹽水，以便在給藥前混合諸成分。本發明構建的前面所述的基因工程細胞系可以是瞬時轉染/轉導產生的細胞系，也可以是穩定轉染/轉導產生的細胞系。在具體實施例中，在本發明的所述基因工程細胞系是穩定細胞系。本文術語“穩定細胞系”是指細胞的性質可以穩定遺傳，一般指的是穩定轉染/轉導產生的細胞系，即進入細胞的核苷酸序列整合到細胞的基因組上穩定遺傳下去。本文術語“無巖藻糖基化”是指蛋白的糖基化修飾中不含巖藻糖基化。本文術語“核心巖藻糖”是指：在n-糖的核心五糖中，與天冬酰胺相連的glcnac上鏈接的巖藻糖。本文使用的術語“adcc”是指細胞介導的細胞毒性反應。本文使用的術語“增強adcc”是指在效應細胞存在下，與接觸巖藻糖基化抗體的相同細胞的細胞殺傷相比，接觸無巖藻糖基化抗體時，任何可測量的細胞裂解的增加，例如，細胞裂解增加至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或325％。本文使用的術語“載體”是指能夠轉運與其連接的另一種核酸的核酸分子。一種載體類型是“質粒”，它是指環形雙鏈dna環，其中可以連接另外的dna片段。另一種載體類型是病毒載體，其中另外的dna片段可以連接到病毒基因組內。某些載體能夠在它所導入的宿主細胞中自主復制(例如具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動物載體)在導入宿主細胞后可以整合到宿主細胞的基因組中，由此隨宿主基因組一起復制。另外，某些載體能夠引導與它們有效連接的基因的表達。這些載體在本文中被稱為“重組表達載體”(或者簡稱為“表達載體”)。通常在重組dna技術中使用的表達載體常常為質粒形式。在本說明書中，“質粒”和“載體”可以互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。但是，本發明也包括其他形式的表達載體，如病毒載體(例如復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們起等同的功能。本文術語“宿主細胞”包括適合于表達重組核酸序列的任何細胞。細胞包括真核細胞(單細胞或多細胞)、酵母細胞(例如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德畢赤酵母、甲醇型畢赤酵母等)、植物細胞、昆蟲細胞(例如sf-9、sf-21、桿狀病毒感染的昆蟲細胞、粉紋夜蛾(trichoplusiani)等)、非人類的動物細胞、人類細胞或細胞融合物，例如雜交瘤或四源雜交瘤(quadroma)。宿主細胞可以是人、猴子、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在一些實施方式中，細胞是真核細胞并且選自下列細胞：cho(例如chok1、dxb-11cho、veggie-cho)，cos(例如cos-7)，敘利亞倉鼠，大鼠黑素瘤，小鼠黑素瘤(例如sp2/0、ns0)，視網膜細胞，vero，cv1，腎(例如hek293，293ebna，msr293，mdck，hak，bhk，bhk21)，hela，hepg2，wi38，mrc5，colo205，hb8065，hl-60，jurkat，daudi，a431(表皮的)，cv-1，u937，3t3，l細胞，c127細胞，mmt060562，sertoli細胞，brl3a細胞，ht1080細胞，人黑素瘤細胞，腫瘤細胞，人淋巴瘤細胞(例如namalwa細胞)和源自前述細胞的細胞系。在本發明的具體實施例中，宿主細胞選用的是cho。本文術語“抗體”表示：(1)免疫球蛋白多肽和免疫球蛋白多肽的免疫學活性部分，即免疫球蛋白家族的多肽或其部分，包含免疫特異性結合域特定抗原(例如，cd20)的抗原結合位點和包括復雜n-糖苷-連接糖鏈的fc結構域，或(b)這種免疫球蛋白多肽或免疫特異性結合抗原(例如，cd20)的片段的保守性取代衍生物。抗體的描述通常參見例如，harlow&lane，《抗體：實驗室手冊》(antibodies：alaboratorymanual)(冷泉港實驗室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，1988)。術語“雙特異性抗體”包括能夠選擇性結合兩個或兩個以上表位的抗體。雙特異性抗體一般包含2個不同的重鏈，每個重鏈特異性結合不同的表位-兩個不同分子上的不同表位(例如兩個不同抗原上的不同表位)或同一分子上的不同表位(例如，同一抗原上的不同表位)。如果雙特異性抗體能夠選擇性結合兩個不同表位(第一表位和第二表位)，則第一重鏈針對第一表位的親和性一般比第一重鏈針對第二表位的親和性低至少1至2或3或4或更多的數量級，反之亦可。由雙特異性抗體特異性結合的表位可以在相同或不同的靶標上(例如在相同或不同的蛋白上)。可以通過例如組合識別同一抗原上的不同表位的重鏈來制備雙特異性抗體。例如，可以將編碼識別相同抗原上的不同表位的重鏈可變序列的核酸序列融合至編碼相同或不同重鏈恒定區的核酸序列，可以在表達免疫球蛋白輕鏈的細胞中表達此類序列。典型的雙特異性抗體具有2個重鏈，每個具有3個重鏈cdr，后跟(從n-末端至c-末端)ch1結構域、鉸鏈區、ch2結構域和ch3結構域；還具有免疫球蛋白輕鏈，其不賦予表位結合特異性但是可以與每個重鏈結合，或者可以與每個重鏈結合并且可以結合重鏈表位結合區所結合的一個或多個表位，或者可以與每個重鏈結合并能使1個或2個重鏈與1個或2個表位結合。術語“單克隆抗體”指衍生自單個細胞克隆，包括任何真核或原核細胞克隆或噬菌體克隆的抗體。術語“fc區”表示抗體的恒定區，例如，ch1-絞鏈-ch2-ch3結構域，任選具有ch4結構域，或這種fc區的保守性取代的衍生物。術語“fc結構域”表示抗體的恒定區結構域，例如，ch1、絞鏈、ch2、ch3或ch4結構域，或這種fc結構域的保守性取代衍生物。本發明的有益效果：本發明利用crispr/cas9技術構建了slc35c1基因沉默、和/或fut8基因沉默的基因工程細胞系，該基因工程細胞系可以制備無巖藻糖基化的抗體，且細胞系的該性質可以長期穩定的遺傳下去。附圖說明圖1質粒px330結構和插入位點示意圖；圖2顯示不同細胞株表達的em201抗體n-糖型分析圖；圖3顯示不同細胞株傳代穩定性的n-糖型分析圖；圖4顯示抗cd20的抗體與fcγriiia的結合活性檢測圖；圖5顯示抗cd20的抗體對daudi細胞的adcc效應圖；圖6顯示抗cd20的抗體治療對daudi細胞裸小鼠皮下移植瘤體積的影響圖。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例1slc35c1基因敲除載體的構建靶向中國倉鼠slc35c1基因的mrna序列(nm_001246808.1，如seqidno.3所示)的編碼區設計了4段grna(表1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，兩條配對的單鏈(f和r)梯度退火后，與bbsi限制性內切酶消化的px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9(購買自addgene，貨號plasmid42230；multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.congl,ranfa,coxd,lins,barrettor,habibn,hsupd,wux,jiangw,marraffinila,zhangf.science.2013jan3.10.1126/science.1231143pubmed23287718)載體連接。載體結構和插入位點示意圖如圖1所示。測序驗證后確認獲得了正確的克隆，轉染top-10感受態細胞，挑取單克隆后搖瓶內培養，用無內毒素質粒大提試劑盒(天根生化科技北京有限公司)獲得轉染中國倉鼠細胞cho所用的質粒。表1靶向slc35c1基因的grna設計實施例2：fut8基因敲除載體的構建靶向中國倉鼠fut8基因的mrna序列(xm_003501735.2，如seqidno.14所示)的編碼區設計了5段grna(表2)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，兩條配對的單鏈(f和r)梯度退火后，與bbsi限制性內切酶消化的px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9(購買自addgene，貨號plasmid42230；multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.congl,ranfa,coxd,lins,barrettor,habibn,hsupd,wux,jiangw,marraffinila,zhangf.science.2013jan3.10.1126/science.1231143pubmed23287718)載體連接。表2靶向fut8基因的grna設計測序驗證后確認獲得了正確的克隆，轉染top-10感受態細胞，挑取單克隆后搖瓶內培養，用無內毒素質粒大提試劑盒(天根生化科技北京有限公司)獲得轉染中國倉鼠細胞cho所用的質粒。實施例3slc35c1基因敲除的cho細胞構建于125ml細胞培養搖瓶中接種30ml密度5×105的cho-k1(atcc)細胞，細胞活率在98％以上，細胞離心后，以電轉緩沖液稀釋至1×107cells/ml密度，將40μg構建好的靶向slc35c1基因的px330質粒加入電擊杯中，再加入0.7ml細胞懸液，最后補入電轉緩沖液至0.8ml，輕輕混勻，在300v，20ms的條件下電擊一次，將電擊杯置于冰盒中冰浴5min，轉染后加入培養基，置于37℃、5％co2、轉速130rpm的細胞培養搖床上培養。2天后，加入小扁豆凝集素lca(lensculinarisagglutinin)至200μg/ml，篩選穩定的抗性克隆；加藥5天后，離心收集細胞，利用小扁豆凝集素lca對蛋白巖藻糖基的特異性親和力，將共轉染后的細胞使用biotin-lca標記、結合anti-biotinmicrobeads和macsld柱進行負性分選；分選后在300μg/ml的小扁豆凝集素lca培養24hr，有限稀釋法將細胞接種到96孔板中進行細胞單克隆化，在300μg/ml的小扁豆凝集素lca克隆化培養，之后進一步接種到12孔或6孔直至轉移至培養瓶中，獲得單克隆細胞株。獲得的單克隆細胞株抽提基因組dna后，pcr擴增slc35c1基因片段檢測其中基因的突變情況，pcr正向引物序列為：5'-atgtgacaattgaaggctgtacc-3'(seqidno.12)；反向引物序列為：5'-agaaggaagtggtctgtttgag-3'(seqidno.13)。pcr產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，克隆到t載體pgm-simple-tfastvector(天根生化科技北京有限公司)，克隆后的載體用來測序，篩選出slc35c1基因閱讀框都發生移碼突變的單克隆細胞株，記作cho-k1-s-/-。實施例4fut8基因敲除的cho細胞構建于125ml細胞培養搖瓶中接種30ml密度5×105的cho-k1(atcc)細胞，細胞活率在98％以上，細胞離心后，以電轉緩沖液稀釋至1×107cells/ml密度，將40μg構建好的靶向fut8基因的px330質粒加入電擊杯中，再加入0.7ml細胞懸液，最后補入電轉緩沖液至0.8ml，輕輕混勻，在300v，20ms的條件下電擊一次，將電擊杯置于冰盒中冰浴5min，轉染后加入培養基，置于37℃、5％co2、轉速130rpm的細胞培養搖床上培養。2天后，加入小扁豆凝集素lca(lensculinarisagglutinin)至200μg/ml，篩選穩定的抗性克隆；加藥5天后，離心收集細胞，利用小扁豆凝集素lca對蛋白巖藻糖基的特異性親和力，將共轉染后的細胞使用biotin-lca標記、結合anti-biotinmicrobeads和macsld柱進行負性分選；分選后在300μg/ml的小扁豆凝集素lca培養24hr，有限稀釋法將細胞接種到96孔板中進行細胞單克隆化，在300μg/ml的小扁豆凝集素lca克隆化培養，之后進一步接種到12孔或6孔直至轉移至培養瓶中，獲得單克隆細胞株。獲得的單克隆細胞株抽提基因組dna后，pcr擴增fut8基因片段檢測其中基因的突變情況，pcr正向引物序列為：5'-gattccaggttcccatatattc-3'(seqidno.25)，反向引物序列為：5'-tgatgactgctagtgatgctac-3'(seqidno.26)，或正向引物序列為：5'-tgtctgaagcatcatgtgttg-3'(seqidno.27)，反向引物序列為：5'-acagtatttcatcaaatccttg-3'(seqidno.28)。pcr產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，克隆到t載體pgm-simple-tfastvector(天根生化科技北京有限公司)，克隆后的載體用來測序，篩選出fut8基因閱讀框都發生移碼突變的單克隆細胞株，記作cho-k1-f-/-。實施例5slc35c1和fut8基因雙敲除的cho細胞構建將構建的敲除了slc35c1基因的穩定株cho-k1-s-/-細胞，按照實施例4敲除fut8基因，篩選出的克隆株即為slc35c1和fut8基因雙敲除的cho細胞，記作cho-k1-sf-/-。實施例6抗cd20抗體的表達和純化采用pcdna3.1作為骨架載體，將neomycin新霉素選擇標簽切除，替換為gs(谷氨酰胺合成酶，glutaminesynthetase)表達盒子，作為篩選標記；其中gscdna可以從表達gs的細胞系cho中通過rt-pcr獲得，經改造后的載體命名為gs篩選載體。分別合成編碼em201重鏈和輕鏈的dna序列(編碼重鏈的dna序列如seqidno.29所示，編碼輕鏈的dna序列如seqidno.30所示)，在輕鏈和重鏈間插入cmv啟動子后，通過常規pcr在5’端引入hindiii酶切位點，在3’端引入noti酶切位點，插入到gs篩選載體的hindiii和noti之間，構建獲得真核表達載體pem201。于125ml細胞培養搖瓶中接種30ml密度5×105的cho-k1、cho-k1-s-/-、cho-k1-f-/-和cho-k1-sf-/-細胞，細胞活率在98％以上，細胞以1×107cells/ml密度接種于電轉緩沖液，將40μgpem201質粒加入電擊杯中，再加入0.7ml細胞懸液，最后補入電轉緩沖液至0.8ml，輕輕混勻，不要產生氣泡。在300v，20ms的條件下電擊一次，將電擊杯置于冰盒中冰浴5min，稀釋到6ml培養基中在37℃co2培養箱中恢復24h，向種子培養基中加入75μmmsx經過有限稀釋法進行亞克隆篩選。通過有限稀釋方法分單克隆細胞至96孔板內，37℃，5％co2培養箱培養，待細胞擴增至一定數量，進行elisa驗證，挑選陽性克隆依次放大到24孔板、6孔板、t25方瓶。經過6～8周的培養及篩選，獲得能夠高效表達抗cd20抗體的單克隆細胞株。該抗cd20的抗體命名為em201，其重鏈和輕鏈的蛋白序列見seqidno.1和seqidno.2。單克隆細胞株經過培養基多步的擴大培養，接種密度為0.5×106cells/ml，加入msx至75μm，持續2周后，離心收集細胞于125ml搖瓶中培養，置于37℃、5％co2、轉速130rpm的搖床上懸浮培養12天，期間在第3、6、9天以4g/l的終濃度補加葡萄糖，培養結束后收獲上清，將上清進行純化。采用akta(ge公司)進行em201抗體的分離純化。首先收集過proteina親和層析柱(mabselectsure)ph在3.4-3.6范圍(用280nm進行監測)的洗脫液，調ph值至8.0，上樣到陰離子交換層析柱(q-sepharoseff)，280nm進行監控和收集樣品。將收集液ph值調節至5.5，上樣到陽離子交換層析柱(poros)收集樣品,超濾濃縮后獲得抗cd20的抗體。實施例7抗cd20抗體(em201)的糖型分析取200μg抗cd20抗體，超濾管除鹽后加入10μlg7酶切緩沖液、1μlpngasef、加水至100μl，于37℃恒溫10hr。將酶切好的樣品加入300μl的-20℃乙醇混勻，靜置20min后12000rpm離心3min，取上清真空濃縮干燥，得到n-糖干粉。dmso和乙酸按照350μl:150μl比例混勻，取5mg2-ab、6mgsodiumcyanoborohydride溶于100μl的dmso和乙酸混合液中，取混合液10μl加入真空濃縮的n-糖干粉中，65℃衍生3小時，加入80％的乙腈和水混合液200μl，離心2mins，取上清，液相分析：色譜柱：watersacquityuplcbehamide1.7μm；柱溫：40℃；激發波長：λex＝330nm；λem＝420nm；進樣量：10μl；液相梯度如表3所示。表3梯度洗脫時間表時間(min)流動a％(甲酸銨)流動相b％(乙腈)02080202080252575754060806535856535862080962080抗cd20的抗體em201分別由cho-k1、cho-k1-f-/-、cho-k1-s-/-和cho-k1-sf-/-細胞表達，其糖型圖譜如圖2所示，由圖2以及下面的表4可見，與cho-k1細胞株表達的em201相比，cho-k1-f-/-、cho-k1-s-/-細胞表達的抗體巖藻糖的含量顯著降低，僅有0.6％和1.8％的糖型含有巖藻糖；而cho-k1-sf-/-細胞表達的抗體未檢出含有巖藻糖的糖型，表明與單獨敲除slc35c1和fut8基因相比，雙基因敲除去除巖藻糖更為完全。表4不同細胞株表達的em201抗體n-糖型比例圖例：n-乙酰氨基葡萄糖：■；巖藻糖：；甘露糖和半乳糖：●實施例8巖藻糖敲除穩定株的傳代穩定性為滿足蛋白藥物產業化生產規模對傳代和細胞倍增水平的要求，對構建的穩定細胞株進行傳代穩定性研究。從細胞庫開始傳代至30代，涵蓋了擬定的產業化生產規模對傳代和細胞倍增水平的要求，并在此基礎上增加15代以保證穩定性研究對未來生產規模要求的覆蓋性。細胞每2-4天傳一次，共30代次，通過調查細胞在不同階段的倍增時間、倍增水平、最大細胞密度、生產能力、抗體比生成速率，以及評估抗體表達量和質量，對細胞的傳代穩定性進行分析。細胞株傳代穩定性結果顯示，細胞傳代至p30，細胞密度、細胞倍增時間、活率、抗體比生成速率、抗體表達量及抗體質量基本穩定，符合作為工程細胞株的要求。但是cho-k1-s-/-和cho-k1-f-/-細胞株隨著傳代次數的增多，巖藻糖糖型的比例顯著增加(圖3和表5)，分別增至1.7％和4.7％，可能是由于其它糖基化的旁路被激活所致；而雙基因敲除的cho-k1-fs-/-細胞株傳代至30代，仍無含有巖藻糖的糖型檢出(圖4和表5)。表明與單獨敲除slc35c1和fut8基因相比，雙基因敲除的細胞株其cho-k1-fs-/-傳代穩定性更好，且核心巖藻糖敲除更徹底，優選的作為巖藻糖徹底敲除的細胞株進行應用開發。表5不同細胞株傳代穩定性的n-糖型比例圖例：n-乙酰氨基葡萄糖：■；巖藻糖：；甘露糖和半乳糖：●實施例9抗cd20抗體與fcγriiia結合活性分析anti-his(r&d公司)抗體用ph9.6的碳酸鹽緩沖液將稀釋至1μg/ml，加入酶標板中4℃孵育過夜。洗板并封閉后(含5％脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液)，加入1μg/ml的fcγriiia(158v)(r&d公司)，37℃孵育1h。將待測樣品：em201(cho-k1-fs-/-表達)、em201(cho-k1表達)、gazyva(genentech公司)分別與anti-humanκ(r&d公司)以1:2的比例混勻，37℃孵育1h后將抗體稀釋到50μg/ml，再進行3倍的梯度稀釋獲得10個濃度點。酶標板加入稀釋后的抗體和anti-humanκ的混合液100μl，37℃孵育1小時。洗板后將hrp偶聯的goatf(ab′)2anti-humaniggf(ab′)2(r&d公司)以1:5000的比例稀釋，以100μl/孔的量加入到酶標板中，37℃孵育1h。洗板后加100μl/孔的tmb室溫顯色30min，加入100μl/孔的2mol/lh2so4終止顯色反應，置酶標儀上測定450nm波長處測定吸光值，以樣品濃度為橫坐標，吸光度平均值為縱坐標，四參數方程曲線擬合。em201(cho-k1-fs-/-表達)為不含核心巖藻糖的糖型的抗cd20的抗體；em201(cho-k1表達)是以核心巖藻糖的糖型(>84％比例)為主的抗cd20的抗體；gazyva為部分含有核心巖藻糖的糖型(～50％比例)為主的抗cd20的抗體。em201(cho-k1-fs-/-表達)、em201(cho-k1表達)和gazyva(genentech公司)與fcγriiia(158v)的結合活性實驗結果如圖4所示，實驗結果表明em201(cho-k1-fs-/-表達)與fcγriiia(158v)的結合活性約為gazyva的2倍，更是顯著強于em201(cho-k1表達)的結合活性(約6倍)，表明無巖藻糖基化抗cd20抗體對fcγriiia具有更高的親和力。實施例10抗cd20抗體的對人b細胞淋巴瘤daudi細胞的adcc效應人burkitt's淋巴瘤細胞系daudi細胞購自美國典型培養物保藏中心(atcc)，作為adcc測試中的靶細胞；以細胞膜上高表達fcγrⅲa的nk-92mi-cd16a為效應細胞(華博生物醫藥技術有限公司)。96孔板中每孔加入5×104個nk-92mi-cd16a和1×104個40μldaudi細胞；將em201(cho-k1-fs-/-表達)、em201(cho-k1表達)、gazyva(genentech公司)分別加入96孔板中，至樣品終濃度1×10-1～1×10-8μg/ml(10倍梯度，共8個濃度點)，37℃、5％co2細胞培養箱中培養4h。用乳酸脫氫酶ldh測試劑盒顯色后酶標儀492nm處讀取od值，計算靶細胞裂解率，以樣品濃度為橫坐標，靶細胞裂解率為縱坐標，四參數方程擬合分析。em201(cho-k1-fs-/-表達)、em201(cho-k1表達)和gazyva(genentech公司)的adcc活性實驗結果如圖5所示，實驗結果表明em201(cho-k1-fs-/-表達)adcc活性約為gazyva的4倍，更是顯著強于em201(cho-k1表達)的adcc活性(約為20倍)，表明無巖藻糖基化抗cd20抗體比巖藻糖基化抗體具有更高的adcc效能。實施例11抗cd20抗體對人b細胞淋巴瘤daudi裸小鼠皮下移植瘤的療效為評估抗cd20抗體的體內抗腫瘤活性，采用balb/ca-nude裸小鼠(6-7周，♀，購自上海靈暢生物科技有限公司)為宿主的人腫瘤移植模型。裸小鼠皮下接種人b細胞淋巴瘤daudi細胞，待腫瘤生長至130-180mm3后，將動物隨機分組。將空白對照(pbs)和三種抗cd20抗體：em201(cho-k1-fs-/-表達)、em201(cho-k1表達)和gazyva(genentech公司)分別給藥，三種抗cd20抗體給藥方案為3mg/kg，每周2次，共4次。每周測2-3次瘤體積，稱鼠重，記錄數據。結果表明：如圖6所示，空白對照組小鼠的腫瘤體積顯著增大；與對照組相比，抗cd20的三組抗體都能顯著抑制腫瘤的生長；em201(cho-k1-fs-/-表達)為不含核心巖藻糖的糖型的抗cd20的抗體；與以核心巖藻糖的糖型為主的em201(cho-k1表達)抗體，相比，具有較低的巖藻糖含量的抗體em201(cho-k1-fs-/-表達)和gazyva(genentech公司)具有更好的抑制瘤效果，且荷瘤小鼠對敲除巖藻糖的抗cd20抗體藥物能很好耐受，沒有體重減輕等癥狀發生。上述實施例的說明只是用于理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發明權利要求的保護范圍內。sequencelisting<110>江蘇東抗生物醫藥科技有限公司<120>一種生產無巖藻糖基化蛋白的基因工程細胞系及其建立方法<160>30<170>patentinversion3.5<210>1<211>449<212>prt<213>人源<400>1glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser151015servallysvalsercyslysalaserglytyralaphesertyrser202530trpileasntrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyargilepheproglyaspglyaspthrasptyrasnglylysphe505560lysglyargvalthrilethralaasplysserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasnvalpheaspglytyrtrpleuvaltyrtrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphe115120125proleualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleu130135140glycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrp145150155160asnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleu165170175glnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproser180185190serserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislyspro195200205serasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplys210215220thrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglypro225230235240servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser245250255argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasp260265270progluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn275280285alalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargval290295300valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu305310315320tyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulys325330335thrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthr340345350leuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthr355360365cysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu370375380serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu385390395400aspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplys405410415serargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglu420425430alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserprogly435440445lys<210>2<211>219<212>prt<213>人源<400>2aspilevalmetthrglnthrproleuserleuprovalthrprogly151015gluproalaserilesercysargserserlysserleuleuhisser202530asnglyilethrtyrleutyrtrptyrleuglnlysproglyglnser354045proglnleuleuiletyrglnmetserasnleuvalserglyvalpro505560aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile65707580serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysalaglnasn859095leugluleuprotyrthrpheglyglyglythrlysvalgluilelys100105110argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu115120125glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe130135140tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln145150155160serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser165170175thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu180185190lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser195200205provalthrlysserpheasnargglyglucys210215<210>3<211>1098<212>dna<213>鼠源<400>3atgaacagggcgcctctgaagcggtccaggatcctgcgcatggcgctgactggaggctcc60actgcctctgaggaggcagatgaggacagcaggaacaagccgtttctgctgcgggcgctg120cagatcgcgctggtcgtctctctctactgggtcacctccatctccatggtattcctcaac180aagtacctgctggacagcccctccctgcagctggatacccctatcttcgtcactttctac240caatgcctggtgacctctctgctgtgcaagggcctcagcactctggccacctgctgccct300ggcaccgttgacttccccaccctgaacctggaccttaaggtggcccgcagcgtgctgcca360ctgtcggtagtcttcattggcatgataagtttcaataacctctgcctcaagtacgtaggg420gtggccttctacaacgtggggcgctcgctcaccaccgtgttcaatgtgcttctgtcctac480ctgctgctcaaacagaccacttccttctatgccctgctcacatgtggcatcatcattggt540ggtttctggctgggtatagaccaagagggagctgagggcaccctgtccctcataggcacc600atcttcggggtgctggccagcctctgcgtctccctcaatgccatctataccaagaaggtg660ctcccagcagtggacaacagcatctggcgcctaaccttctataacaatgtcaatgcctgt720gtgctcttcttgcccctgatggttctgctgggtgagctccgtgccctccttgactttgct780catctgtacagtgcccacttctggctcatgatgacgctgggtggcctcttcggctttgcc840attggctatgtgacaggactgcagatcaaattcaccagtcccctgacccacaatgtatca900ggcacagccaaggcctgtgcgcagacagtgctggccgtgctctactatgaagagactaag960agcttcctgtggtggacaagcaacctgatggtgctgggtggctcctcagcctatacctgg1020gtcaggggctgggagatgcagaagacccaagaggaccccagctccaaagagggtgagaag1080agtgctatcagggtgtga1098<210>4<211>28<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<223>nisa,c,g,ort<400>4caccggcggtccaggatcctgcgcangg28<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列<400>5aaactgcgcaggatcctggaccgcc25<210>6<211>28<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<223>nisa,c,g,ort<400>6caccgatcctgcgcatggcgctgacngg28<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列<400>7aaacgtcagcgccatgcgcaggatc25<210>8<211>28<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<223>nisa,c,g,ort<400>8caccggcgggcgctgcagatcgcgcngg28<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列<400>9aaacgcgcgatctgcagcgcccgcc25<210>10<211>28<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<223>nisa,c,g,ort<400>10caccgaacctctgcctcaagtacgtngg28<210>11<211>25<212>dna<213>人工序列<400>11aaacacgtacttgaggcagaggttc25<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列<400>12atgtgacaattgaaggctgtacc23<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列<400>13agaaggaagtggtctgtttgag22<210>14<211>2823<212>dna<213>鼠源<400>14ttcaggttgctgctctggcttaggccatctatgaccctggtggtgttttcattcactata60agtccttcccatctttattaactgagcaagttcagctagtaattttagagaccgaggttc120aagcaataacacctatctctgcaataccgtgtggctttcttcaatgtcttacatcctaag180gaaaggaagcatgtagagcccaggaagcacaggacaagaaagctgcctccttgtatcacc240aggaagatctttttgtaagagtcatcacagtaaccagagagactaattttgtctgaagca300tcatgtgttgaaacaacagaaacttattttcctgtgtggctaactagaaccagagtacaa360tgtttccaattctttgagctccgagaagacagaagggagttgaaactctgaaaatgcggg420catggactggttcctggcgttggattatgctcattctttttgcctgggggaccttattgt480tttatataggtggtcatttggttcgagataatgaccaccctgaccattctagcagagaac540tctccaagattcttgcaaagctggagcgcttaaaacaacaaaatgaagacttgaggagaa600tggctgagtctctccgaataccagaaggccctattgatcaggggacagctacaggaagag660tccgtgttttagaagaacagcttgttaaggccaaagaacagattgaaaattacaagaaac720aagctaggaatgatctgggaaaggatcatgaaatcttaaggaggaggattgaaaatggag780ctaaagagctctggttttttctacaaagtgaattgaagaaattaaagaaattagaaggaa840acgaactccaaagacatgcagatgaaattcttttggatttaggacatcatgaaaggtcta900tcatgacagatctatactacctcagtcaaacagatggagcaggtgagtggcgggaaaaag960aagccaaagatctgacagagctggtccagcggagaataacatatctgcagaatcccaagg1020actgcagcaaagccagaaagctggtatgtaatatcaacaaaggctgtggctatggatgtc1080aactccatcatgtggtttactgcttcatgattgcttatggcacccagcgaacactcatct1140tggaatctcagaattggcgctatgctactggaggatgggagactgtgtttagacctgtaa1200gtgagacatgcacagacaggtctggcctctccactggacactggtcaggtgaagtgaagg1260acaaaaatgttcaagtggtcgagctccccattgtagacagcctccatcctcgtcctcctt1320acttacccttggctgtaccagaagaccttgcagatcgactcctgagagtccatggtgatc1380ctgcagtgtggtgggtatcccagtttgtcaaatacttgatccgtccacaaccttggctgg1440aaagggaaatagaagaaaccaccaagaagcttggcttcaaacatccagttattggagtcc1500atgtcagacgcactgacaaagtgggaacagaagcagccttccatcccattgaggaataca1560tggtacacgttgaagaacattttcagcttctcgaacgcagaatgaaagtggataaaaaaa1620gagtgtatctggccactgatgacccttctttgttaaaggaggcaaagacaaagtactcca1680attatgaatttattagtgataactctatttcttggtcagctggactacacaaccgataca1740cagaaaattcacttcggggcgtgatcctggatatacactttctctcccaggctgacttcc1800ttgtgtgtactttttcatcccaggtctgtagggttgcttatgaaatcatgcaaacactgc1860atcctgatgcctctgcaaacttccattctttagatgacatctactattttggaggccaaa1920atgcccacaaccagattgcagtttatcctcaccaacctcgaactaaagaggaaatcccca1980tggaacctggagatatcattggtgtggctggaaaccattggaatggttactctaaaggtg2040tcaacagaaaactaggaaaaacaggcctgtacccttcctacaaagtccgagagaagatag2100aaacagtcaaataccctacatatcctgaagctgaaaaatagagatggagtgtaagagatt2160aacaacagaatttagttcagaccatctcagccaagcagaagacccagactaacatatggt2220tcattgacagacatgctccgcaccaagagcaagtgggaaccctcagatgctgcactggtg2280gaacgcctctttgtgaagggctgctgtgccctcaagcccatgcacagtaaaataatgtac2340tcacacataacatacaaatggattattttctactttgccctttaaatattctgtccccat2400gaaacaaacactgccacattatgtaatttaagtgacacagacgttttgtgtgagacttca2460aacatggtgcctatatctgagagacctctgtgatttactgagaagatgagaacagctccc2520ttctgtggggaagttggttcttagtcagtggtggactggccactgaattcactgcaatca2580acagattcagaatgagaatggatgtttttcctttatatggttgtctggattttttttaaa2640gtaatttcatcagttcagttcatccacctcattaataaatgaaggaatataccaataaaa2700tcaaatgaaatattcactgtccattaggaagttttataaaacaatgccatgaacaaaaaa2760ttctttagtactcaatgtttctggacattctctttgataacaaaaataaattttaaaaag2820gaa2823<210>15<211>28<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<223>nisa,c,g,ort<400>15caccggtcagacgcactgacaaagtngg28<210>16<211>25<212>dna<213>人工序列<400>16aaacactttgtcagtgcgtctgacc25<210>17<211>28<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<223>nisa,c,g,ort<400>17caccgggataaaaaaagagtgtatcngg28<210>18<211>25<212>dna<213>人工序列<400>18aaacgatacactctttttttatccc25<210>19<211>28<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<223>nisa,c,g,ort<400>19caccggtgtaccatgtattcctcaangg28<210>20<211>25<212>dna<213>人工序列<400>20aaacttgaggaatacatggtacacc25<210>21<211>28<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<223>nisa,c,g,ort<400>21caccggggaccttattgttttatatngg28<210>22<211>25<212>dna<213>人工序列<400>22aaacatataaaacaataaggtcccc25<210>23<211>28<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<223>nisa,c,g,ort<400>23caccggttttatataggtggtcattngg28<210>24<211>25<212>dna<213>人工序列<400>24aaacaatgaccacctatataaaacc25<210>25<211>22<212>dna<213>人工序列<400>25gattccaggttcccatatattc22<210>26<211>22<212>dna<213>人工序列<400>26tgatgactgctagtgatgctac22<210>27<211>21<212>dna<213>人工序列<400>27tgtctgaagcatcatgtgttg21<210>28<211>22<212>dna<213>人工序列<400>28acagtatttcatcaa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