檢測人類樣本的成套試劑與應用的制作方法

本發明涉及生物技術領域中，檢測人類樣本的成套試劑與應用。

背景技術：

目前，法醫dnastr檢測工作在我國開展廣泛，市場上也有不少產品，但是這些產品在解決實際問題是還有一些不足之處。如其核心位點在中國人群中的適用性仍偏弱(試劑盒不包含d6s1043),或是其擴增產物的片段較大在案件檢材檢驗中存在不足(擴增大片段產物達到450bp-500bp)。另外，目前常染色體試劑盒中添加的用于印證的y-str位點多為dys391，該位點在中國人群中的特異性也不高。因此研制包含更多高特異性的、適合中國人群的、擴增片段較小的str試劑盒仍有很大必要。

技術實現要素：

本發明的目的是提供檢測人類樣本的成套試劑。

本發明首先提供了可用于擴增人類基因座位點和檢測人類樣本的成套試劑，其名稱為成套試劑1，所述成套試1由名稱依次為amel-p、d5s818-p、d21s11-p、d7s820-p、csf1po-p、d2s1338-p、d3s1358-p、vwa-p、d8s1179-p、d16s539-p、pentae-p、tpox-p、th01-p、d19s433-p、d18s51-p、fga-p、d6s1043-p、d13s317-p、d12s391-p和pentad-p的引物對組成；

所述amel-p由序列表中序列1和2所示的兩條單鏈dna組成；

所述d5s818-p由序列表中序列3和4所示的兩條單鏈dna組成；

所述d21s11-p由序列表中序列5和6所示的兩條單鏈dna組成；

所述d7s820-p由序列表中序列7和8所示的兩條單鏈dna組成；

所述csf1po-p由序列表中序列9和10所示的兩條單鏈dna組成；

所述d2s1338-p由序列表中序列11和12所示的兩條單鏈dna組成；

所述d3s1358-p由序列表中序列13和14所示的兩條單鏈dna組成；

所述vwa-p由序列表中序列15和16所示的兩條單鏈dna組成；

所述d8s1179-p由序列表中序列17和18所示的兩條單鏈dna組成；

所述d16s539-p由序列表中序列19和20所示的兩條單鏈dna組成；

所述pentae-p由序列表中序列21和22所示的兩條單鏈dna組成；

所述tpox-p由序列表中序列23和24所示的兩條單鏈dna組成；

所述th01-p由序列表中序列25和26所示的兩條單鏈dna組成；

所述d19s433-p由序列表中序列27和28所示的兩條單鏈dna組成；

所述d18s51-p由序列表中序列29和30所示的兩條單鏈dna組成；

所述fga-p由序列表中序列31和32所示的兩條單鏈dna組成；

所述d6s1043-p由序列表中序列33和34所示的兩條單鏈dna組成；

所述d13s317-p由序列表中序列35和36所示的兩條單鏈dna組成；

所述d12s391-p由序列表中序列37和38所示的兩條單鏈dna組成；

所述pentad-p由序列表中序列39和40所示的兩條單鏈dna組成。

所述人類基因座位點為p1)：

p1)amelogenin、d5s818、d21s11、d7s820、csf1po、d2s1338、d3s1358、vwa、d8s1179、d16s539、pentae、tpox、th01、d19s433、d18s51、fga、d6s1043、d13s317、d12s391和pentad；

所述amel-p可用于擴增amelogenin；

所述d5s818-p可用于擴增d5s818；

所述d21s11-p可用于擴增d21s11；

所述d7s820-p可用于擴增d7s820；

所述csf1po-p可用于擴增csf1po；

所述d2s1338-p可用于擴增d2s1338；

所述d3s1358-p可用于擴增d3s1358；

所述vwa-p可用于擴增vwa；

所述d8s1179-p可用于擴增d8s1179；

所述d16s539-p可用于擴增d16s539；

所述pentae-p可用于擴增pentae；

所述tpox-p可用于擴增tpox；

所述th01-p可用于擴增th01；

所述d19s433-p可用于擴增d19s433；

所述d18s51-p可用于擴增d18s51；

所述fga-p可用于擴增fga；

所述d6s1043-p可用于擴增d6s1043；

所述d13s317-p可用于擴增d13s317；

所述d12s391-p可用于擴增d12s391；

所述pentad-p可用于擴增pentad。

本發明還提供了可用于擴增人類基因座位點和檢測人類樣本的成套試劑，其名稱為成套試劑a，所述成套試劑a由所述成套試劑1與名稱為d1s1656-p的引物對組成，所述d1s1656-p由序列表中序列41和42所示的兩條單鏈dna組成。

其中，所述人類基因座位點為p2)：

p2)amelogenin、d5s818、d21s11、d7s820、csf1po、d2s1338、d3s1358、vwa、d8s1179、d16s539、pentae、tpox、th01、d19s433、d18s51、fga、d6s1043、d13s317、d12s391、pentad和d1s1656。

所述d1s1656-p可用于擴增d1s1656。

本發明還提供了可用于擴增人類基因座位點和檢測人類樣本的成套試劑，其名稱為成套試劑b，所述成套試劑b由所述成套試劑1與名稱為dys448-p的引物對組成，所述dys448-p由序列表中序列43和44所示的兩條單鏈dna組成。

其中，所述人類基因座位點為p3)：

p3)amelogenin、d5s818、d21s11、d7s820、csf1po、d2s1338、d3s1358、vwa、d8s1179、d16s539、pentae、tpox、th01、d19s433、d18s51、fga、d6s1043、d13s317、d12s391、pentad和dys448。

所述dys448-p可用于擴增dys448。

上述各成套試劑中，每個引物對中均可有一條引物由熒光物質標記。所述熒光物質具體可為fam、hex、tamra或rox。

所述熒光物質可標記在引物的5′端。

上述各成套試劑中各引物對的兩條單鏈dna的摩爾比均可為1:1。所述成套試劑1中所述amel-p、所述d5s818-p、所述d21s11-p、所述d7s820-p、所述csf1po-p、所述d2s1338-p、所述d3s1358-p、所述vwa-p、所述d8s1179-p、所述d16s539-p、所述pentae-p、所述tpox-p、所述th01-p、所述d19s433-p、所述d18s51-p、所述fga-p、所述d6s1043-p、所述d13s317-p、所述d12s391-p和所述pentad-p的摩爾比可依次為4:5:5:4:6:5:4:4:4:6:6:5:5:4.5:5:5.5:6:4:5:6，每個引物對均以單條引物計。所述成套試劑a中所述amel-p、所述d5s818-p、所述d21s11-p、所述d7s820-p、所述csf1po-p、所述d2s1338-p、所述d3s1358-p、所述vwa-p、所述d8s1179-p、所述d16s539-p、所述pentae-p、所述tpox-p、所述th01-p、所述d19s433-p、所述d18s51-p、所述fga-p、所述d6s1043-p、所述d13s317-p、所述d12s391-p、所述pentad-p和所述d1s1656-p的摩爾比可依次為4:5:5:4:6:5:4:4:4:6:6:5:5:4.5:5:5.5:6:4:5:6:4，每個引物對均可以單條引物計。所述成套試劑b中所述amel-p、所述d5s818-p、所述d21s11-p、所述d7s820-p、所述csf1po-p、所述d2s1338-p、所述d3s1358-p、所述vwa-p、所述d8s1179-p、所述d16s539-p、所述pentae-p、所述tpox-p、所述th01-p、所述d19s433-p、所述d18s51-p、所述fga-p、所述d6s1043-p、所述d13s317-p、所述d12s391-p、所述pentad-p和所述dys448-p的摩爾比可依次為4:5:5:4:6:5:4:4:4:6:6:5:5:4.5:5:5.5:6:4:5:6:4.5，每個引物對均以單條引物計。

上述各成套試劑中各引物對可按照上述比例混合后分裝，也可每個引物對獨立包裝，也可每條引物獨立包裝。

本發明還提供了用于檢測人類樣本的系統，所述系統包括所述成套試劑1、所述成套試劑a或所述成套試劑b。

所述系統還可包括上述人類基因座位點p1)、p2)或p3)在人群中的分型。所述系統具體可由所述成套試劑1、所述成套試劑a或所述成套試劑b與上述人類基因座位點p1)、p2)或p3)在人群中的分型組成。各位點的各個分型可作為利用所述成套試劑1、所述成套試劑a或所述成套試劑b檢測待測樣本時各基因座分型的標準。各位點的各個分型的序列見strbase數據庫，網址為：http://www.cstl.nist.gov/strbase/。

所述成套試劑1與人類基因座位點p1)在人群中的分型配套使用，所述成套試劑a與人類基因座位點p2)在人群中的分型配套使用，所述成套試劑b與人類基因座位點p3)在人群中的分型配套使用。

所述系統還可包括作為標準品的人類樣本。所述系統具體可由所述成套試劑1、所述成套試劑a或所述成套試劑b與作為標準品的人類樣本組成，還可由所述成套試劑1、所述成套試劑a或所述成套試劑b、上述人類基因座位點p1)、p2)或p3)在人群中的分型以及作為標準品的人類樣本組成。

上述系統可為試劑盒。

本發明還提供了下述ⅰ或ⅱ的應用：

ⅰ、所述成套試劑1、所述成套試劑a或所述成套試劑b的下述任一應用：

x1、在制備檢測或輔助檢測人類樣本試劑盒中的應用；

x2、在制備檢測或輔助檢測人類男性樣本試劑盒中的應用；

x3、在制備檢測或輔助檢測人類女性樣本試劑盒中的應用；

x4、在制備擴增人類基因座位點試劑盒中的應用；

x5、在檢測或輔助檢測人類樣本中的應用；

x6、在檢測或輔助檢測人類男性樣本中的應用；

x7、在檢測或輔助檢測人類女性樣本中的應用；

x8、在擴增所述人類基因座位點中的應用；

ⅱ、檢測人類基因座位點的物質的下述任一應用；

y1、在檢測或輔助檢測人類樣本中的應用；

y2、在檢測或輔助檢測人類男性樣本中的應用；

y3、在檢測或輔助檢測人類女性樣本中的應用；

所述人類基因座位點均為上述p1)、p2)或p3)。

本發明還提供了非診斷目的的檢測或輔助檢測人類樣本的方法，所述方法包括：利用所述成套試劑a對待測樣本的基因組dna進行擴增，得到擴增產物，根據下述m1)或m2)確定待測樣本是否為人類樣本：

m1)如果所述擴增產物符合下述a1)-a21)的全部標準，則所述待測樣本為或候選為人類樣本；如果所述擴增產物不符合如下a1)-a21)的全部標準，則所述待測樣本非或候選非人類樣本：

a1)所述amel-p的擴增產物呈藍顏色且大小為93-108bp；

a2)所述d5s818-p的擴增產物呈藍顏色且大小為114-150bp；

a3)所述d21s11-p的擴增產物呈藍顏色且大小為186-230bp；

a4)所述d7s820-p的擴增產物呈藍顏色且大小為248-276bp；

a5)所述csf1po-p的擴增產物呈藍顏色且大小為288.5-324.5bp；

a6)所述d2s1338-p的擴增產物呈藍顏色且大小為341-393bp；

a7)所述d3s1358-p的擴增產物呈綠顏色且大小為99-131bp；

a8)所述vwa-p的擴增產物呈綠顏色且大小為145-177bp；

a9)所述d8s1179-p的擴增產物呈綠顏色且大小為203-247bp；

a10)所述d16s539-p的擴增產物呈綠顏色且大小為259-299bp；

a11)所述pentae-p的擴增產物呈綠顏色且大小為305-381bp；

a12)所述tpox-p的擴增產物呈黑顏色且大小為80-108bp；

a13)所述th01-p的擴增產物呈黑顏色且大小為129-168bp；

a14)所述d19s433-p的擴增產物呈黑顏色且大小為180-232bp；

a15)所述d18s51-p的擴增產物呈黑顏色且大小為245-309bp；

a16)所述fga-p的擴增產物呈黑顏色且大小為333-385bp；

a17)所述d6s1043-p的擴增產物呈紅顏色且大小為89-140bp；

a18)所述d13s317-p的擴增產物呈紅顏色且大小為164-188bp；

a19)所述d12s391-p的擴增產物呈紅顏色且大小為198-250bp；

a20)所述pentad-p的擴增產物呈紅顏色且大小為334-384bp；

a21)所述d1s1656-p的擴增產物呈紅顏色且大小為255-302bp；

m2)對所述擴增產物進行str分型，如果所述擴增產物的str分型符合人類樣本中上述p2)的全部人類基因座的分型，所述待測樣本為或候選為人類樣本；如果所述擴增產物的str分型不符合人類樣本中上述p2)的全部人類基因座的分型，則所述待測樣本非或候選非人類樣本。

利用所述成套試劑a在進行pcr擴增時，反應體系中amel-p、d5s818-p、d21s11-p、d7s820-p、csf1po-p、d2s1338-p、d3s1358-p、vwa-p、d8s1179-p、d16s539-p、pentae-p、tpox-p、th01-p、d19s433-p、d18s51-p、fga-p、d6s1043-p、d13s317-p、d12s391-p、pentad-p和d1s1656-p的兩條引物的濃度分別可為0.25與0.25μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.28與0.28μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.34與0.34μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.25與0.25μmol/l。所述pcr擴增的退火溫度可為59℃。

本發明還提供了非診斷目的的檢測或輔助檢測人類樣本的方法，所述方法包括：利用所述成套試劑b對待測樣本的基因組dna進行擴增，得到擴增產物，根據下述n1)或n2)確定待測樣本是否為人類樣本：

n1)如果所述擴增產物符合下述b1)-b21)的全部標準，則所述待測樣本為或候選為人類樣本；如果所述擴增產物不符合如下b1)-b21)的全部標準，則所述待測樣本非或候選非人類樣本：

b1)所述amel-p的擴增產物呈藍顏色且大小為93-108bp；

b2)所述d5s818-p的擴增產物呈藍顏色且大小為114-150bp；

b3)所述d21s11-p的擴增產物呈藍顏色且大小為186-230bp；

b4)所述d7s820-p的擴增產物呈藍顏色且大小為248-276bp；

b5)所述csf1po-p的擴增產物呈藍顏色且大小為288.5-324.5bp；

b6)所述d2s1338-p的擴增產物呈藍顏色且大小為341-393bp；

b7)所述d3s1358-p的擴增產物呈綠顏色且大小為99-131bp；

b8)所述vwa-p的擴增產物呈綠顏色且大小為145-177bp；

b9)所述d8s1179-p的擴增產物呈綠顏色且大小為203-247bp；

b10)所述d16s539-p的擴增產物呈綠顏色且大小為259-299bp；

b11)所述pentae-p的擴增產物呈綠顏色且大小為305-381bp；

b12)所述tpox-p的擴增產物呈黑顏色且大小為80-108bp；

b13)所述th01-p的擴增產物呈黑顏色且大小為129-168bp；

b14)所述d19s433-p的擴增產物呈黑顏色且大小為180-232bp；

b15)所述d18s51-p的擴增產物呈黑顏色且大小為245-309bp；

b16)所述fga-p的擴增產物呈黑顏色且大小為333-385bp；

b17)所述d6s1043-p的擴增產物呈紅顏色且大小為89-140bp；

b18)所述d13s317-p的擴增產物呈紅顏色且大小為164-188bp；

b19)所述d12s391-p的擴增產物呈紅顏色且大小為198-250bp；

b20)所述pentad-p的擴增產物呈紅顏色且大小為334-384bp；

b21)所述dys448-p的擴增產物呈紅顏色且大小為266-320bp；

n2)對所述擴增產物進行str分型，如果所述擴增產物的str分型符合人類樣本中上述p3)的全部人類基因座的分型，所述待測樣本為或候選為人類樣本；如果所述擴增產物的str分型不符合人類樣本中上述p3)的全部人類基因座的分型，則所述待測樣本非或候選非人類樣本。

利用所述成套試劑b在進行pcr擴增時，amel-p、d5s818-p、d21s11-p、d7s820-p、csf1po-p、d2s1338-p、d3s1358-p、vwa-p、d8s1179-p、d16s539-p、pentae-p、tpox-p、th01-p、d19s433-p、d18s51-p、fga-p、d6s1043-p、d13s317-p、d12s391-p、pentad-p和dys448-p的兩條引物的濃度分別可為0.25與0.25μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.28與0.28μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.34與0.34μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.28與0.28μmol/l。所述pcr擴增的退火溫度可為59℃。

上述各方法中，在所述待測樣本為或候選為人類樣本時，根據所述amel-p的擴增產物進一步確定待測樣本為女性樣本還是男性樣本。具體可為根據amel-p的擴增產物的str分型與amelogenin基因座位點的分型進行比較：如果amel-p的擴增產物的str分型為x型和y型，所述待測樣本為或候選為人類男性樣本；如果amel-p的擴增產物的str分型為x型，所述待測樣本為或候選為人類女性樣本。

本發明中，所述樣本和所述待測樣本均可為離體樣本。所述樣本和所述待測樣本具體均可為血液、唾液、骨骼、毛發、組織或脫落細胞檢材。

實驗證明，本發明的成套試劑1、成套試劑a和成套試劑b不僅可用于擴增人類基因座位點(amelogenin、d5s818、d21s11、d7s820、csf1po、d2s1338、d3s1358、vwa、d8s1179、d16s539、pentae、tpox、th01、d19s433、d18s51、fga、d6s1043、d13s317、d12s391、pentad、d1s1656和dys448)，還可以用于檢測人類樣本。利用本發明的成套試劑a和成套試劑b在檢測待測樣本時，可以特異檢測出人類樣本，還可以進一步確定檢測到的人類樣本為女性樣本還是男性樣本，并且還具有高靈敏度，可以檢測案發現場取到的少量樣本以及血卡樣本，最低可檢測到濃度為0.1ng/μl的人類樣本基因組dna。表明，本發明的成套試劑a和成套試劑b具有很強的適用性。

附圖說明

圖1為包含d1s1656位點的ladder的結果。

圖2為成套試劑a檢測9947a的str分型結果。

圖3為成套試劑a檢測猴、牛、豬的結果。

圖4為包含dys448位點的ladder的結果。

圖5為成套試劑b檢測9948的str分型結果。

圖6為typer500圖譜。

圖7為血卡樣本的str分型結果。

圖8為案件樣本的str分型結果。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

實施例1、用于檢測人類樣本的成套試劑的制備

本實施例提供的用于檢測人類樣本的成套試劑，為基于20個常染色體str基因座的成套試劑1、基于20個常染色體str基因座和1個性別標識位點的成套試劑a和基于19個str常染色體基因座、1個y染色體str基因座和1個性別標識位點的成套試劑b，成套試劑1由名稱為amel-p、d5s818-p、d21s11-p、d7s820-p、csf1po-p、d2s1338-p、d3s1358-p、vwa-p、d8s1179-p、d16s539-p、pentae-p、tpox-p、th01-p、d19s433-p、d18s51-p、fga-p、d6s1043-p、d13s317-p、d12s391-p和pentad-p的引物對組成，成套試劑a由成套試劑1與名稱為d1s1656-p的引物對組成，成套試劑b由成套試劑1與名稱為dys448-p的引物對組成，每個引物對均由兩條單鏈dna組成。

上述各成套試劑中各引物對的兩條單鏈dna的摩爾比均為1:1，成套試劑1中amel-p、d5s818-p、d21s11-p、d7s820-p、csf1po-p、d2s1338-p、d3s1358-p、vwa-p、d8s1179-p、d16s539-p、pentae-p、tpox-p、th01-p、d19s433-p、d18s51-p、fga-p、d6s1043-p、d13s317-p、d12s391-p和pentad-p的摩爾比依次為4:5:5:4:6:5:4:4:4:6:6:5:5:4.5:5:5.5:6:4:5:6(每個引物對均以單條引物計)，成套試劑a中amel-p、d5s818-p、d21s11-p、d7s820-p、csf1po-p、d2s1338-p、d3s1358-p、vwa-p、d8s1179-p、d16s539-p、pentae-p、tpox-p、th01-p、d19s433-p、d18s51-p、fga-p、d6s1043-p、d13s317-p、d12s391-p、pentad-p和d1s1656-p的摩爾比依次為4:5:5:4:6:5:4:4:4:6:6:5:5:4.5:5:5.5:6:4:5:6:4(每個引物對均以單條引物計)，成套試劑b中amel-p、d5s818-p、d21s11-p、d7s820-p、csf1po-p、d2s1338-p、d3s1358-p、vwa-p、d8s1179-p、d16s539-p、pentae-p、tpox-p、th01-p、d19s433-p、d18s51-p、fga-p、d6s1043-p、d13s317-p、d12s391-p、pentad-p和dys448-p的摩爾比依次為4:5:5:4:6:5:4:4:4:6:6:5:5:4.5:5:5.5:6:4:5:6:4.5(每個引物對均以單條引物計)。

上述各成套試劑中每個引物對中均有一條單鏈dna的5′端由熒光物質標記(表1)。

上述各成套試劑中各引物對按照上述比例混合后分裝。

各引物對的具體信息如表1所示，每個引物對能擴增相應的基因座。

表1、用于檢測人類樣本的成套試劑

實施例2、用于檢測人類樣本的成套試劑的成套試劑的特異性

一、實施例1的成套試劑a

供試樣本：代表人類樣本的細胞標準品9947a(女性)以及猴、牛、豬三類常見的動物物種的血液，利用無菌水作為陰性對照。

檢測方法：提取各樣本的基因組dna，向基因組dna中加入成套試劑a及擴增緩沖液(擴增緩沖液由溶質和溶劑組成，其中溶劑為tris緩沖液(0.05mol/l,ph為7.5)，溶質及其濃度分別為0.1mol/l牛血清白蛋白、0.08mol/ldatp、0.08mol/ldttp、0.08mol/ldgtp、0.08mol/ldctp、0.1mol/l吐溫-20、0.3mol/l氯化鎂、0.25mol/l氯化鉀、0.01mol/l疊氮化鈉、0.3mol/l甘油、0.05mol/ltaq酶、0.1mol/l硫酸銨，溶質中的taq酶、datp、dttp、dgtp、dctp和牛血清白蛋白均為羅氏公司產品，其余組分均為sigma公司產品)混合均勻，將配置好的反應體系置于pcr儀中進行pcr擴增。

10μl反應體系中含有4.5μl成套試劑a的溶液，4.5μl擴增緩沖液以及1μl基因組dna。該反應體系中，成套試劑a中所有引物的總濃度為12.88μmol/l(即各引物在反應體系中的濃度之和),amel-p、d5s818-p、d21s11-p、d7s820-p、csf1po-p、d2s1338-p、d3s1358-p、vwa-p、d8s1179-p、d16s539-p、pentae-p、tpox-p、th01-p、d19s433-p、d18s51-p、fga-p、d6s1043-p、d13s317-p、d12s391-p、pentad-p和d1s1656-p的兩條引物的濃度分別為0.25與0.25μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.28與0.28μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.34與0.34μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.25與0.25μmol/l。

反應條件為：95℃變性10分鐘，之后運行28個循環的(94℃30秒，59℃2分鐘，72℃1分鐘)，接著60℃延伸60分鐘，最終4℃保溫。

檢測時使用ab公司的3130、3500系列測序儀或公安部第一研究所的ga118測序儀，采用g5通道，具體檢測流程依據相關儀器36cm毛細管5色通道檢測方法進行。

檢測過程中采用包含d1s1656的ladder(記為ladder1)確定各擴增產物大小。其中ladder1包括各位點(amel，d5s818，d21s11，d7s820，csf1po，d2s1338，d3s1358，vwa，d8s1179，d16s539，pentae，tpox，th01，d19s433，d18s51，fga，d6s1043，d13s317，d12s391，d1s1656和pentad)在人群中的常見分型，具體分型如下：

amel包括x和y共2個分型(x為99bp，y比x大6bp)；

d5s818包括7-16共10分型，分別記為7、8、9、10、11、12、13、14、15和16(其中7大小為114bp，后面依次增大4bp)；

d21s11包括26-37中共計13個分型，分別記為26、27、28、29、30、30.3、31、32、33、34、35、36和37(其中26大小為186bp，后面每個整數依次增大4bp，30.3比30多3bp)；

d7s820包括7-14共計8個分型，分別記為7、8、9、10、11、12、13和14(其中7大小為248bp，后面依次增大4bp)；

csf1po包括6-15共計10個分型，分別記為6、7、8、9、10、11、12、13、14和15(其中6大小為288.5bp，后面依次增大4bp)；

d2s1338包括15-28共計14個分型，分別記為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28(其中15大小為341bp，后面依次增大4bp)；

d3s1358包括12-20共計9個分型，分別記為12、13、14、15、16、17、18、19和20(其中12大小為99bp，后面依次增大4bp)；

vwa包括13-21共計9個分型，分別記為13、14、15、16、17、18、19、20和21(其中13大小為145bp，后面依次增大4bp)；

d8s1179包括7-18共計12個分型，分別記為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18(其中7大小為203bp，后面依次增大4bp)；

d16s539包括5-15共計9個分型，分別記為5、8、9、10、11、12、13、14和15(其中5大小為259bp，8大小為271bp，后面依次增大4bp)；

pentae包括5-24共計18個分型，分別記為5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24(其中5大小為305bp，8大小為320bp，后面依次增大5bp)；

tpox包括6-13共計8個分型，分別記為6、7、8、9、10、11、12和13(其中6大小為80bp，后面依次增大4bp)；

th01包括4-13.3共計10個分型，分別記為4、5、6、7、8、9、9.3、10、11和13.3(其中4大小為129bp，后面每個整數依次增大4bp，9.3比9多3bp，13.3比11多11bp)；

d19s433包括5.2-18.2共計20個分型，分別記為5.2、6.2、8、9、10、11、12、12.2、13、13.2、14、14.2、15、15.2、16、16.2、17、17.2、18和18.2(其中5.2大小為180bp，6.2大小為184bp，8大小為190bp，后面每個整數依次增大4bp，12.2、13.2、14.2、15.2、16.2、17.2和18.2分別比12、13、14、15、16、17和18多2bp)；

d18s51包括10-26共計17個分型，分別記為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26(其中10大小為245bp，后面依次增大4bp)；

fga包括17-30共計14個分型，分別記為17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30(其中17大小為333bp，后面依次增大4bp)；

d6s1043包括9-21.3共計14個分型，分別記為9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和21.3(其中9大小為89bp，后面每個整數依次增大4bp，21.3比21多3bp)；

d13s317包括8-14共計7個分型，分別記為8、9、10、11、12、13和14(其中8大小為164bp，后面依次增大4bp)；

d12s391包括14-27共計15個分型，分別記為14、15、16、17、18、19、19.3、20、21、22、23、24、25、26和27(其中14大小為198bp，后面每個整數依次增大4bp，19.3比19多3bp)；

d1s1656包括9-20.3共計15個分型，分別記為9、10、11、12、13、14、15、16、16.3、17、17.3、18、18.3、19.3和20.3(其中9大小為255bp，后面每個整數依次增大4bp，16.3比15多7bp，18.3、19.3和20.3分別比18多3bp，7bp和10bp)；

pentad包括6-16共計11個分型，分別記為6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16(其中6大小為334bp，后面依次增大5bp)。

各位點的各個分型的序列見strbase數據庫，網址為：http://www.cstl.nist.gov/strbase/。amel，d5s818，d21s11，d7s820，csf1po，d2s1338的各分型均由fam標記，d3s1358，vwa，d8s1179，d16s539，pentae的各分型均由hex標記，tpox，th01，d19s433，d18s51，fga的各分型均由tamra標記，d6s1043，d13s317，d12s391，d1s1656和pentad的各分型均由rox標記。

在檢測待測樣本時，根據下述m1)或m2)確定待測樣本是否為人類樣本：

m1)如果成套試劑a的擴增產物符合如下a1)-a21)的全部標準，則待測樣本為人類樣本；如果成套試劑a的擴增產物不符合如下a1)-a21)的全部標準，則待測樣本非人類樣本，該標準具體如下：

a1)amel-p的擴增產物呈藍顏色且大小為93-108bp；

a2)d5s818-p的擴增產物呈藍顏色且大小為114-150bp；

a3)d21s11-p的擴增產物呈藍顏色且大小為186-230bp；

a4)d7s820-p的擴增產物呈藍顏色且大小為248-276bp；

a5)csf1po-p的擴增產物呈藍顏色且大小為288.5-324.5bp；

a6)d2s1338-p的擴增產物呈藍顏色且大小為341-393bp；

a7)d3s1358-p的擴增產物呈綠顏色且大小為99-131bp；

a8)vwa-p的擴增產物呈綠顏色且大小為145-177bp；

a9)d8s1179-p的擴增產物呈綠顏色且大小為203-247bp；

a10)d16s539-p的擴增產物呈綠顏色且大小為259-299bp；

a11)pentae-p的擴增產物呈綠顏色且大小為305-381bp；

a12)tpox-p的擴增產物呈黑顏色且大小為80-108bp；

a13)th01-p的擴增產物呈黑顏色且大小為129-168bp；

a14)d19s433-p的擴增產物呈黑顏色且大小為180-232bp；

a15)d18s51-p的擴增產物呈黑顏色且大小為245-309bp；

a16)fga-p的擴增產物呈黑顏色且大小為333-385bp；

a17)d6s1043-p的擴增產物呈紅顏色且大小為89-140bp；

a18)d13s317-p的擴增產物呈紅顏色且大小為164-188bp；

a19)d12s391-p的擴增產物呈紅顏色且大小為198-250bp；

a20)pentad-p的擴增產物呈紅顏色且大小為334-384bp；

a21)d1s1656-p的擴增產物呈紅顏色且大小為255-302bp；

m2)對擴增產物進行str分型，如果擴增產物的str分型符合人類樣本中下述p2)的全部人類基因座的分型，待測樣本為人類樣本；如果擴增產物的str分型不符合人類樣本中下述p2)的全部人類基因座的分型，則待測樣本非人類樣本；

p2)amelogenin、d5s818、d21s11、d7s820、csf1po、d2s1338、d3s1358、vwa、d8s1179、d16s539、pentae、tpox、th01、d19s433、d18s51、fga、d6s1043、d13s317、d12s391、pentad和d1s1656。

利用ab公司9700型pcr儀、3500測序儀以及idx分析軟件對ladder1與成套試劑a的擴增產物進行分析與分型，ladder1的分型結果如圖1所示(圖1中15和16.3兩個峰間的峰為16的峰)，9947a的各基因座位點的str分型結果如圖2所示。結果顯示，與圖1中ladder1的各位點的分型相比，9947a的各基因座位點中，amel-p得到的95.6bp的基因片段分型為x，d5s818-p得到的127.2bp的基因片段分型為11，d21s11-p得到的198.6bp的基因片段分型為30，d7s820-p得到的257.7bp,261.8bp的基因片段分型為10和11，csf1po-p得到的304.5bp,312.5bp的基因片段分型為10和12，d2s1338-p得到的354.3bp,369.9bp的基因片段分型為19和23，d3s1358-p得到的102.3bp,106.3bp的基因片段分型為14和15，vwa-p得到的166.5bp,170.5bp的基因片段分型為17和18，d8s1179-p得到的222.7bp的基因片段分型為13，d16s539-p得到的279bp,283bp的基因片段分型為11和12，pentae-p得到的338.5bp,343.5bp的基因片段分型為12和13，tpox-p得到的94.5bp的基因片段分型為8，th01-p得到的145bp,152bp的基因片段分型為8和9.3，d19s433-p得到的215bp,219bp的基因片段分型為14和15，d18s51-p得到的265bp,281bp的基因片段分型為15和19，fga-p得到的358bp,362bp的基因片段分型為23和24，d6s1043-p得到的106bp,130bp的基因片段分型為12和18，d13s317-p得到的176.5bp的基因片段分型為11，d12s391-p得到的216bp,224bp的基因片段分型為18和20，pentad-p得到的364bp的基因片段分型為12，d1s1656-p得到的294bp的基因片段分型為18.3。9947a的各位點的str分型結果均符合ladder1的分型。

因此，利用成套試劑a檢測9947a可以確定該細胞為人類細胞，由于amel-p中僅有x分型，表明該細胞為人類女性細胞，該結果與其實際情況一致。而利用成套試劑a對猴、牛、豬的樣本進行檢驗時，均無擴增產物出現(圖3，圖3中從上至下依次為猴、牛和豬的樣本)，說明成套試劑a在檢驗人類樣本時各位點均會出現擴增產物，而檢測非人源樣本時則無擴增產物，表明成套試劑a的種族特異性較好，能用于人類str檢驗。

二、實施例1的成套試劑b

供試樣本：代表人類樣本的細胞標準品9948(男性)以及猴、牛、豬三類常見的動物物種的血液；利用無菌水作為陰性對照。

檢測方法：提取各樣本的基因組dna，向基因組dna中加入成套試劑b及步驟一的擴增緩沖液混合均勻，將配置好的反應體系置于pcr儀中進行pcr擴增。

10μl反應體系中含有4.5μl成套試劑b的溶液，4.5μl擴增緩沖液以及1μl基因組dna。該反應體系中，成套試劑b中所有引物的總濃度為12.94μmol/l(即各引物在反應體系中的濃度之和)amel-p、d5s818-p、d21s11-p、d7s820-p、csf1po-p、d2s1338-p、d3s1358-p、vwa-p、d8s1179-p、d16s539-p、pentae-p、tpox-p、th01-p、d19s433-p、d18s51-p、fga-p、d6s1043-p、d13s317-p、d12s391-p、pentad-p和dys448-p的兩條引物的濃度分別為0.25與0.25μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.28與0.28μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.34與0.34μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.25與0.25μmol/l、0.31與0.31μmol/l、0.38與0.38μmol/l、0.28與0.28μmol/l。

擴增流程為：95℃變性10分鐘，之后運行28個循環的(94℃30秒，59℃2分鐘，72℃1分鐘)，接著60℃延伸60分鐘，最終4℃保溫。

檢測時使用ab公司的3130、3500系列測序儀或公安部第一研究所的ga118測序儀，采用g5通道，具體檢測流程依據相關儀器36cm毛細管5色通道檢測方法進行。

采用包含dys448位點的ladder(記為ladder2)確定各擴增產物大小。其中ladder2包括各位點(amel，d5s818，d21s11，d7s820，csf1po，d2s1338，d3s1358，vwa，d8s1179，d16s539，pentae，tpox，th01，d19s433，d18s51，fga，d6s1043，d13s317，d12s391，dys448，pentad)在人群中的常見分型。其中amel，d5s818，d21s11，d7s820，csf1po，d2s1338，d3s1358，vwa，d8s1179，d16s539，pentae，tpox，th01，d19s433，d18s51，fga，d6s1043，d13s317，d12s391，dys448，pentad的分型同步驟一，dys448包括15-24共計10個分型，分別記為15、16、17、18、19、20、21、22、23和24(其中15大小為266bp，后面依次增大6bp)，圖4。

各位點的各個分型的序列見strbase數據庫，網址為：http://www.cstl.nist.gov/strbase/。amel，d5s818，d21s11，d7s820，csf1po，d2s1338的各分型均由fam標記，d3s1358，vwa，d8s1179，d16s539，pentae的各分型均由hex標記，tpox，th01，d19s433，d18s51，fga的各分型均由tamra標記，d6s1043，d13s317，d12s391，dys448和pentad的各分型均由rox標記。

在檢測待測樣本時，根據下述n1)或n2)確定待測樣本是否為人類樣本：

n1)如果成套試劑b的擴增產物符合如下b1)-b21)的全部標準，則待測樣本為人類樣本；如果成套試劑b的擴增產物不符合如下b1)-b21)的全部標準，則待測樣本非人類樣本。該標準具體如下：

b1)amel-p的擴增產物呈藍顏色且大小為93bp-108bp；

b2)d5s818-p的擴增產物呈藍顏色且大小為114-150bp；

b3)d21s11-p的擴增產物呈藍顏色且大小為186-230bp；

b4)d7s820-p的擴增產物呈藍顏色且大小為248-276bp；

b5)csf1po-p的擴增產物呈藍顏色且大小為288.5-324.5bp；

b6)d2s1338-p的擴增產物呈藍顏色且大小為341-393bp；

b7)d3s1358-p的擴增產物呈綠顏色且大小為99-131bp；

b8)vwa-p的擴增產物呈綠顏色且大小為145-177bp；

b9)d8s1179-p的擴增產物呈綠顏色且大小為203-247bp；

b10)d16s539-p的擴增產物呈綠顏色且大小為259-299bp；

b11)pentae-p的擴增產物呈綠顏色且大小為305-381bp；

b12)tpox-p的擴增產物呈黑顏色且大小為80-108bp；

b13)th01-p的擴增產物呈黑顏色且大小為129-168bp；

b14)d19s433-p的擴增產物呈黑顏色且大小為180-232bp；

b15)d18s51-p的擴增產物呈黑顏色且大小為245-309bp；

b16)fga-p的擴增產物呈黑顏色且大小為333-385bp；

b17)d6s1043-p的擴增產物呈紅顏色且大小為89-140bp；

b18)d13s317-p的擴增產物呈紅顏色且大小為164-188bp；

b19)d12s391-p的擴增產物呈紅顏色且大小為198-250bp；

b20)pentad-p的擴增產物呈紅顏色且大小為334-384bp；

b21)dys448-p的擴增產物呈紅顏色且大小為266-320bp；

n2)對擴增產物進行str分型，如果擴增產物的str分型符合人類樣本中下述p3)的全部人類基因座的分型，待測樣本為人類樣本；如果擴增產物的str分型不符合人類樣本中下述p3)的全部人類基因座的分型，則待測樣本非人類樣本；

p3)amelogenin、d5s818、d21s11、d7s820、csf1po、d2s1338、d3s1358、vwa、d8s1179、d16s539、pentae、tpox、th01、d19s433、d18s51、fga、d6s1043、d13s317、d12s391、pentad和dys448。

利用ab公司9700型pcr儀、3500測序儀以及idx分析軟件對ladder2與成套試劑b的擴增產物進行分析與分型，ladder2的分型結果如圖4所示，9948的各基因座位點的str分型結果如圖5所示。結果顯示，與圖4中ladder1的各位點的分型相比，9948的各基因座位點中，amel-p得到的96bp，102bp的基因片段分型為x和y，d5s818-p得到的127bp,135bp的基因片段分型為11和13，d21s11-p得到的194.5bp,198.5bp的基因片段分型為29和30，d7s820-p得到的262bp的基因片段分型為11，csf1po-p得到的304bp,308bp的基因片段分型為10和11，d2s1338-p得到的370bp的基因片段分型為23，d3s1358-p得到的106bp,114bp的基因片段分型為15和17，vwa-p得到的166bp的基因片段分型為17，d8s1179-p得到的218bp,222bp的基因片段分型為12和13，d16s539-p得到的278bp的基因片段分型為11，pentae-p得到的333bp的基因片段分型為11，tpox-p得到的92bp,96bp的基因片段分型為8和9，th01-p得到的135bp和150bp的基因片段分型為6和9.3，d19s433-p得到的208bp,212bp的基因片段分型為13和14，d18s51-p得到的264bp,276bp的基因片段分型為15和18，fga-p得到的361bp,369bp的基因片段分型為24和26，d6s1043-p得到的104bp的基因片段分型為12，d13s317-p得到的173bp的基因片段分型為11，d12s391-p得到的214bp,238bp的基因片段分型為18和24，pentad-p得到的343bp,363bp的基因片段分型為8和12，dys448-p得到的291bp的基因片段分型為19。9948的各位點的str分型結果均符合ladder2的分型。

因此，利用成套試劑b檢測9948可以確定該細胞為人類細胞，由于amel-p中有x分型和y分型，表明該細胞為人類男性細胞，該結果與其實際情況一致。而利用成套試劑b對猴、牛、豬的樣本進行檢驗時，均無擴增產物出現，說明成套試劑b在檢驗人類樣本時各位點均會出現擴增產物，而檢測非人源樣本時則無擴增產物，表明成套試劑b的種族特異性較好，能用于人類str檢驗。

在利用成套試劑a和成套試劑b在檢測待測樣本時，不僅可以確定待測樣本是否為人類樣本，還可以根據其中的amel-p進一步確定人類樣本的性別特征，在待測樣本為人類樣本時，如amel的擴增產物的分型僅為x型，待測樣本為人類女性樣本，如amel的擴增產物的分型為x型和y型，待測樣本為人類男性樣本。

圖2和圖5中，下面標注有方框的峰為有效峰，圖1、2、4和5中方框中的數字代表分型，峰的高度代表產物的豐度，峰的顏色為熒光經激發后產生的顏色，其中，藍色的峰代表經fam標記的擴增產物，綠色的峰代表經hex標記的擴增產物，黑色的峰代表經tamra標記的擴增產物，紅色的峰代表經rox標記的擴增產物(圖1、2、4和圖5中每幅圖從上到下四行峰的顏色分別為藍色、綠色、黑色和紅色)。

步驟一和步驟二中，采用typer500作為內標，其圖譜如圖6所示。

實施例3、用于檢測人類樣本的成套試劑的靈敏性

一、實施例1的成套試劑a

將實施例2步驟一中9947a的基因組dna利用無菌水稀釋，得到濃度分別為1ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.1ng/μl、0.05ng/μl的9947a基因組溶液。

按照實施例2步驟一的方法，利用實施例1的成套試劑a檢測上述各9947a基因組溶液。

結果顯示，9947a基因組溶液在dna濃度為0.1ng/μl、0.125ng/μl、0.25ng/μl、0.5ng/μl和1ng/μl時，9947a的str分型結果均包含全部位點的峰型，均與實施例2步驟一的結果一致。9947a基因組溶液在dna濃度為0.05ng/μl時，9947a的str分型結果部分產物峰無法標注，表明，利用實施例1的成套試劑a最低可檢測到濃度為0.1ng/μl的人類樣本基因組dna溶液。

二、實施例1的成套試劑b

將實施例2步驟二中9948的基因組dna利用無菌水稀釋，得到濃度分別為1ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.1ng/μl、0.05ng/μl的9948基因組溶液。

按照實施例2步驟一的方法，利用實施例1的成套試劑b檢測上述各9948基因組溶液。

結果顯示，9948基因組溶液在dna濃度為0.1ng/μl、0.125ng/μl、0.25ng/μl、0.5ng/μl和1ng/μl時，9948的str分型結果均包含全部位點的峰型，均與實施例2步驟二的結果一致。9948基因組溶液在dna濃度為0.05ng/μl時，9948的str分型結果部分產物峰無法標注，表明，利用實施例1的成套試劑b最低可檢測到濃度為0.1ng/μl的人類樣本基因組dna溶液。

實施例4、用于檢測人類樣本的成套試劑的成套試劑的檢測血卡樣本

利用實施例1的成套試劑a按照實施例2中的方法檢測含有一人類男性志愿者血液樣本的血卡樣本。

結果(圖7)顯示，該志愿者的str分型結果包含全部檢測位點，滿足實施例2的a1)-a21)的全部標準，且可確定該志愿者為男性，與實際樣本一致，表明，實施例1的成套試劑a可用于血卡樣本的檢測。

利用實施例1的成套試劑b按照實施例2中的方法檢測含有一人類男性志愿者血液樣本的血卡樣本。

結果顯示，該志愿者的str分型結果包含全部檢測位點，滿足實施例2的b1)-b21)的全部標準，且可確定該志愿者為男性，與實際樣本一致，表明，實施例1的成套試劑b可用于血卡樣本的檢測。

實施例5、用于檢測人類樣本的成套試劑的檢測案件樣本

將在案發現場取到的一男性遺留煙頭一枚，提取基因組dna，利用實施例1的成套試劑a按照實施例2中的方法進行擴增并進行str分型。

結果(圖8)顯示，成套試劑a的擴增產物的str分型結果滿足實施例2的a1)-a21)的全部標準，表明，該待測對象含有人類男性基因組dna，說明，實施例1的成套試劑a可用于案件樣本的檢測，確定待測樣本是否為人類樣本及性別。

將在案發現場取到的人的女性毛發3根，提取基因組dna，利用實施例1的成套試劑b按照實施例2中的方法進行擴增并進行str分型。

結果顯示，成套試劑b的擴增產物的str分型結果滿足實施例2的b1)-b21)的全部標準，表明，該待測對象含有人類基因組dna，然后根據amel的擴增產物的分型確定該待測樣本為女性樣本，說明，實施例1的成套試劑b可用于案件樣本的檢測，確定待測樣本是否為人類樣本及性別。

實施例6、實施例1的成套試劑a與成套試劑b的擴增條件的優化

一、濃度

按照實施例2中步驟一的方法，調整成套試劑a在反應體系中的濃度，成套試劑a的濃度設置包括：0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25μm、0.3μm和0.35μm，各濃度均以amel-p的每條引物來計，其余引物的濃度均滿足實施例1中成套試劑a中amel-p與各引物間的比例關系。反應體系中其他物質的濃度及反應條件均不變，以9947a的基因組dna為模板進行擴增并利用3500測序儀檢測擴增結果。結果顯示，在0.1μm-0.25μm內，隨著成套試劑a的濃度的升高，擴增結果的均衡性更好，但是在高濃度狀態(0.3μm-0.35μm)時，單純的提升引物終濃度無法獲得更好的擴增效果，此時taq酶已經處于飽和狀態，因此反應體系中最適宜的成套試劑a的濃度為0.25μm。

按照實施例2中步驟二的方法，調整成套試劑b在反應體系中的濃度，成套試劑b的濃度設置包括：0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25μm、0.3μm和0.35μm，各濃度均以amel-p的每條引物來計，其余引物的濃度均滿足實施例1中成套試劑b中amel-p與各引物間的比例關系。反應體系中其他物質的濃度及反應條件均不變，以9948的基因組dna為模板進行擴增并利用3500測序儀檢測擴增結果。結果顯示，在0.1μm-0.25μm內，隨著成套試劑b的濃度的升高，擴增結果的均衡性更好，但是在高濃度狀態(0.3μm-0.35μm)時，單純的提升引物終濃度無法獲得更好的擴增效果，此時taq酶已經處于飽和狀態，因此反應體系中最適宜的成套試劑b的濃度為0.25μm。

二、擴增循環數

按照實施例2中步驟一的方法，利用成套試劑a的反應體系，調整擴增循環數，以9947a的基因組dna為模板進行擴增并利用3500測序儀測擴增結果，循環數的設置包括26、28、30和32。結果顯示，當循環數為26時擴增產物量普遍較少，可能會出現部分位點丟帶的現象，當循環數為28、30和32時，擴增產物的量已經達到較高的水平。當案件檢材dna模板量較低的情況下，可以使用高循環數，如30、32來增加擴增產物的量，從而保證檢驗效果。

按照實施例2中步驟二的方法，利用成套試劑b的反應體系，調整擴增循環數，以9948的基因組dna為模板進行擴增并利用3500測序儀檢測擴增結果，循環數的設置包括26、28、30和32。結果顯示，當循環數為26時擴增產物量普遍較少，可能會出現部分位點丟帶的現象，當循環數為28、30和32時，擴增產物的量已經達到較高的水平。當案件檢材dna模板量較低的情況下，可以使用高循環數，如30、32來增加擴增產物的量，從而保證檢驗效果。

三、退火溫度

按照實施例2中步驟一的方法，利用成套試劑a的反應體系，調整退火溫度，以9947a的基因組dna為模板進行擴增并利用3500測序儀檢測擴增結果，退火溫度的設置包括55、56、57、58、59、60、61和62℃。結果顯示，隨著退火溫度變化，擴增擴增效率逐漸提升，到59℃時達到最大效率，但是隨著溫度的進一步提高，擴增效率急劇下降，因此成套試劑a的最佳退火溫度為59℃。

按照實施例2中步驟二的方法，利用成套試劑b的反應體系，調整退火溫度，以9948的基因組dna為模板進行擴增并利用3500測序儀檢測擴增結果，退火溫度的設置包括55、56、57、58、59、60、61和62℃。結果顯示，隨著退火溫度變化，擴增擴增效率逐漸提升，到59℃時達到最大效率，但是隨著溫度的進一步提高，擴增效率急劇下降，因此成套試劑b的最佳退火溫度為59℃。

<110>公安部物證鑒定中心

<120>檢測人類樣本的成套試劑與應用

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