本發明涉及絲素蛋白提取領域，尤其涉及一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法。
背景技術：
蠶絲主要由絲素蛋白和絲膠蛋白組成，其中絲素蛋白約占70%，是蠶絲的主要成分。絲膠為球狀蛋白，組成氨基酸中含有大量極性親水側基，穩定性差，可溶于酸、堿、蛋白酶以及低濃度碳酸鈉等溶液中；而絲素為纖維狀蛋白，天然絲素纖維含有大量分子內和分子間氫鍵,結晶度較高而難溶解于一般溶劑。
生活中比較常見的是桑蠶絲和柞蠶絲，主要由甘氨酸（gly）、丙氨酸（ala）、絲氨酸（ser）和酪氨酸（tyr）組成，但氨基酸含量和分布差異較大。在柞蠶絲素中，具有活潑基團的氨基酸（如精氨酸、天冬氨酸等）比桑蠶絲多，色氨酸、組氨酸的含量是桑蠶絲的5倍，柞蠶絲的丙氨酸含量為40%，桑蠶絲為30%。故柞蠶絲中肽鏈的彎曲和纏結程度比桑蠶絲大，這就使柞蠶絲的剛度、耐溶劑能力高于桑蠶絲。
目前，在研究過程中，常采用強酸、強堿、高濃度的鹽溶液如高濃度cacl2溶液、銅氨溶液、溴化鋰溶液、硫氰化鋰溶液等對桑蠶絲絲素蛋白進行溶解,但這些溶劑存在對蛋白質分子降解嚴重、有毒害、不穩定、不易回收等缺點，同時對柞蠶絲絲素蛋白的提取效果較差。
離子液體(il)是近年來興起的一類極具應用前景的綠色溶劑,廣泛應用于電化學、有機合成、化工分離、材料制備等領域。所謂的離子液體就是在室溫（或者稍高于室溫的溫度）下呈液態的離子體系，與常見的有機溶劑不同，離子液體中存在強大的靜電相互作用，因此表現出非同尋常特點：非揮發性、高穩定性、良好的導電與導熱性、選擇性溶解力與可設計性，同時具有環保無害、可循環使用的特性。
技術實現要素：
為了解決上述技術問題，本發明提供了一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法。本發明的提取方法較為溫和，對絲素蛋白損傷小，使用原料環保，無毒害，且提取效率較高。
本發明的具體技術方案為：一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法，以g和ml計，包括以下步驟：
1）稱取3.5-4.5g柞蠶絲，用去離子水清洗，去除表面污染物，烘干。
2）將烘干的柞蠶絲以1:95-105的浴比在含有0.4-0.6wt%的na2po4和0.8-1.2wt%的c17h35coona的混合溶液中煮沸25-35min，進行脫膠處理，共脫膠四次。
脫膠過程中，隨著絲膠的水解，溶液中氨基酸的濃度逐漸增加，ph降低，脫膠效率減弱，所以需加堿以維持脫膠液ph值的穩定，但堿濃度過大會損傷絲素，所以采用c17h35coona作為緩沖劑。
3）脫膠之后，將柞蠶絲用去離子水搓洗4次以上，放入55-65℃烘箱，得到干燥的絲素纖維。
4）稱取1.8-2.2g干燥的絲素纖維，以1:45-55的浴比浸入[amim]cl離子液體中，控制反應溫度在80~100℃范圍內，在油浴中攪拌5-7h，反應完成后，冷卻至室溫。
5）向步驟4）中離子液體內加入pm13-堿性蛋白酶粉末0.25-0.35g，在40~55℃的油浴中攪拌5-7h，得到絲素/離子液體溶液后，進行滅酶。
生物酶是一種無毒無害、與環境友好的催化劑，擁有高效的特異性；且用量少，水解條件（溫度、ph）溫和，減少污染，節約資源。離子液體(il)是近年來興起的一類極具應用前景的綠色溶劑，對絲素蛋白表現出一定的溶解性。
本發明采用pm13對堿性蛋白酶進行修飾，以保持堿性蛋白酶在離子液體中的穩定性和活性。堿性蛋白酶本身也是一種蛋白質，離子液體對其結構具有一定的破壞作用，pm13處是一種梳狀共聚物，可以覆蓋在堿性蛋白酶表面，防止堿性蛋白酶被離子溶液破壞，同時借助pm13鏈對il的親和性，不但可以提高酶的穩定性，保證酶在離子液體中的活性，而且使酶均勻的分散在il中。
此外，柞蠶絲和桑蠶絲的氨基酸組成有重要差異，雖然兩種蠶絲中丙氨酸和甘氨酸的含量都在75%左右，但柞蠶絲中丙氨酸的含量大于甘氨酸，而桑蠶絲則相反，這導致在肽鏈結構上，柞蠶絲以丙-丙肽鏈為主，而丙-丙肽鏈結構側基上的甲基，使得在側基之間形成密集的疏水作用，使柞蠶絲難以溶解。同時，由于柞蠶絲結晶區的結合力大于桑蠶絲，導致其溶解性差。因此，在對其溶解的過程中，先利用離子液體對絲素蛋白的溶解能力，在高溫條件下對絲素蛋白進行初步溶解，再加入pm13-堿性蛋白酶，在利用離子液體溶解的同時也可以提高酶對絲素蛋白的水解作用和效率。
本發明采用pm13對堿性蛋白酶進行修飾，以保持堿性蛋白酶在離子液體中的穩定性和活性。堿性蛋白酶本身也是一種蛋白質，離子液體對其結構具有一定的破壞作用，pm13處是一種梳狀共聚物，可以覆蓋在堿性蛋白酶表面，防止堿性蛋白酶被離子溶液破壞，同時借助pm13鏈對il的親和性，不但可以提高酶的穩定性，保證酶在離子液體中的活性，而且使酶均勻的分散在il中。
6）待絲素/離子液體溶液冷卻至室溫，加入無水乙醇，反復浸泡，使絲素蛋白析出，對混合物進行真空抽濾，向濾出的絲素蛋白中加入去離子水，反復浸泡后過濾，再將溶液裝入透析袋中透析20-28h，得到純凈的絲素蛋白溶液。
7）對得到的絲素蛋白溶液進行冷凍干燥，即可得到絲素蛋白粉末。
作為優選，步驟4）中，所述[amim]cl離子液體的制備方法為：按1.0-1.5:1的摩爾比向反應容器中加入烯丙基氯和n-甲基咪唑，在55-65℃油浴中攪拌回流6~8h，反應完畢后，采用旋轉蒸發除去過量的2-甲基烯丙基氯，得到淺黃色透明液體，即[amim]cl離子液體，冷凍干燥20-28h后，解凍待用。
在上述方法中，必須對得到的產物進行冷凍干燥，除去離子液體中可能存在的水分。水是極性溶劑，帶入部分氫鍵，和離子液體發生作用，從而會降低離子液體對絲素蛋白的溶解作用。
作為優選，步驟5）中，所述pm13-堿性蛋白酶的制備方法為：向90-110ml的0.1m的硼酸鈉緩沖溶液中加入0.10-0.20g堿性蛋白酶和3.5-4.0gpm13，在1-5℃條件下緩慢攪拌0.5-1.5h，在外加45-55ml1mmol/lhcl的條件下超濾除去未反應的pm13，重復三次，將濾液進行冷凍干燥，得到pm13-堿性蛋白酶粉末，待用。
作為優選，所述pm13為mw15000梳狀peg。
作為優選，在pm13-堿性蛋白酶的制備過程中，冷凍干燥前，預先在-20℃條件下冷凍4h。
作為優選，步驟5）中，滅酶時，在80℃以上的油浴中保溫至少30min。
作為優選，步驟6）中，所述透析袋的截留分子量為3500。
與現有技術對比，本發明的有益效果是：
（1）本發明利用pm13對堿性蛋白酶進行修飾，利用pm13對離子液體的親和作用，不僅提高了酶的穩定性和反應活性，同時增加了酶在離子液體中的分散均勻性，有利于其對絲素蛋白的水解。
（2）本發明在脫膠過程中，加入c17h35coona作為緩沖劑，維持堿性環境，提高脫膠效率，同時減少對絲素纖維的傷害。
（3）本發明利用離子液體和生物酶的雙重溶解作用，逐步對絲素蛋白進行處理，提高了絲素蛋白的溶解度。
（4）本發明中，生物酶無毒無害、與環境友好，同時用量少，節約資源；特異性高，作用條件溫和，對絲素蛋白的破壞小。而離子液體是“綠色溶劑”，環保無害，基團可設計，并且易于回收，可循環使用。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的描述。
實施例1：
一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法，包括以下步驟：
1）稱取4g柞蠶絲作為樣品，用去離子水清洗，去除表面污染物，烘干。
2）將烘干的樣品以1:100的浴比在含有0.5%na2po4和1%c17h35coona的混合溶液中煮沸30min，進行脫膠處理，共脫膠四次。
3）脫膠之后，將樣品用去離子水搓洗4次以上，放入60℃烘箱，得到干燥的絲素纖維。
4）稱取2g干燥的絲素纖維，以1:50的浴比浸入[amim]cl離子液體中，控制反應溫度在80℃范圍內，在油浴中攪拌6h。反應完成后，冷卻至室溫。
5）向4）中離子液體內加入pm13-堿性蛋白酶粉末0.3g，在40℃的油浴中攪拌6h，得到絲素/離子液體溶液后，進行滅酶。
6）待絲素/離子液體溶液冷卻至室溫，加入無水乙醇，反復浸泡，會有絲素蛋白析出。將混合物進行真空抽濾，向濾出的絲素蛋白中加入去離子水，反復浸泡后過濾，再將溶液裝入截留分子量3500的透析袋中透析24h，得到純凈絲素蛋白溶液。
7）將得到的絲素蛋白溶液進行冷凍干燥，即可得到絲素蛋白粉末。
其中，pm13-堿性蛋白酶的制備：向100ml的0.1m的硼酸鈉緩沖溶液中加入0.15g堿性蛋白酶和3.75gpm13（梳狀pegmw15000），在4℃條件下緩慢攪拌1h，在外加50ml1mmol/lhcl的條件下超濾除去未反應的pm13，重復三次。將濾液進行冷凍干燥，得到pm13-堿性蛋白酶粉末，待用。
[amim]cl離子液體的制備：按照1.25:1的摩爾比向三口燒瓶中加入烯丙基氯和n-甲基咪唑，在60℃油浴中攪拌回流6h，反應完畢后，采用旋轉蒸發除去過量的2-甲基烯丙基氯，得到淺黃色透明液體，即[amim]cl離子液體，冷凍干燥24h后，解凍待用。
實施例2：
一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法，包括以下步驟：
1）稱取4g柞蠶絲作為樣品，用去離子水清洗，去除表面污染物，烘干。
2）將烘干的樣品以1:100的浴比在含有0.5%na2po4和1%c17h35coona的混合溶液中煮沸30min，進行脫膠處理，共脫膠四次。
3）脫膠之后，將樣品用去離子水搓洗4次以上，放入60℃烘箱，得到干燥的絲素纖維。
4）稱取2g干燥的絲素纖維，以1:50的浴比浸入[amim]cl離子液體中，控制反應溫度在90℃范圍內，在油浴中攪拌6h。反應完成后，冷卻至室溫。
5）向4）中離子液體內加入pm13-堿性蛋白酶粉末0.3g，在47℃的油浴中攪拌6h，得到絲素/離子液體溶液后，進行滅酶。
6）待絲素/離子液體溶液冷卻至室溫，加入無水乙醇，反復浸泡，會有絲素蛋白析出。將混合物進行真空抽濾，向濾出的絲素蛋白中加入去離子水，反復浸泡后過濾，再將溶液裝入截留分子量3500的透析袋中透析24h，得到純凈絲素蛋白溶液。
7）將得到的絲素蛋白溶液進行冷凍干燥，即可得到絲素蛋白粉末。
其中，pm13-堿性蛋白酶的制備：向100ml的0.1m的硼酸鈉緩沖溶液中加入0.15g堿性蛋白酶和3.75gpm13（梳狀pegmw15000），在4℃條件下緩慢攪拌1h，在外加50ml1mmol/lhcl的條件下超濾除去未反應的pm13，重復三次。將濾液進行冷凍干燥，得到pm13-堿性蛋白酶粉末，待用。
[amim]cl離子液體的制備：按照1.25:1的摩爾比向三口燒瓶中加入烯丙基氯和n-甲基咪唑，在60℃油浴中攪拌回流7h，反應完畢后，采用旋轉蒸發除去過量的2-甲基烯丙基氯，得到淺黃色透明液體，即[amim]cl離子液體，冷凍干燥24h后，解凍待用。
實施例3：
一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法，包括以下步驟：
1）稱取4g柞蠶絲作為樣品，用去離子水清洗，去除表面污染物，烘干。
2）將烘干的樣品以1:100的浴比在含有0.5%na2po4和1%c17h35coona的混合溶液中煮沸30min，進行脫膠處理，共脫膠四次。
3）脫膠之后，將樣品用去離子水搓洗4次以上，放入60℃烘箱，得到干燥的絲素纖維。
4）稱取2g干燥的絲素纖維，以1:50的浴比浸入[amim]cl離子液體中，控制反應溫度在100℃范圍內，在油浴中攪拌6h。反應完成后，冷卻至室溫。
5）向4）中離子液體內加入pm13-堿性蛋白酶粉末0.3g，在55℃的油浴中攪拌6h，得到絲素/離子液體溶液后，進行滅酶。
6）待絲素/離子液體溶液冷卻至室溫，加入無水乙醇，反復浸泡，會有絲素蛋白析出。將混合物進行真空抽濾，向濾出的絲素蛋白中加入去離子水，反復浸泡后過濾，再將溶液裝入截留分子量3500的透析袋中透析24h，得到純凈絲素蛋白溶液。
7）將得到的絲素蛋白溶液進行冷凍干燥，即可得到絲素蛋白粉末。
其中，pm13-堿性蛋白酶的制備：向100ml的0.1m的硼酸鈉緩沖溶液中加入0.15g堿性蛋白酶和3.75gpm13（梳狀pegmw15000），在4℃條件下緩慢攪拌1h，在外加50ml1mmol/lhcl的條件下超濾除去未反應的pm13，重復三次。將濾液進行冷凍干燥，得到pm13-堿性蛋白酶粉末，待用。
[amim]cl離子液體的制備：按照1.25:1的摩爾比向三口燒瓶中加入烯丙基氯和n-甲基咪唑，在60℃油浴中攪拌回流8h，反應完畢后，采用旋轉蒸發除去過量的2-甲基烯丙基氯，得到淺黃色透明液體，即[amim]cl離子液體，冷凍干燥24h后，解凍待用。
對比實驗：
一種在水溶劑中單一酶解提取絲素蛋白的方法，步驟如下：
1）稱取4g柞蠶絲作為樣品，用去離子水清洗，去除表面污染物，烘干。
2）將烘干的樣品以1:100的浴比在含有0.5%na2po4和1%c17h35coona的混合溶液中煮沸30min，進行脫膠處理，共脫膠四次。
3）脫膠之后，將樣品用去離子水搓洗4次以上，放入60℃烘箱，得到干燥的絲素纖維。
4）稱取2g絲素纖維，以1:50的浴比浸入cb緩沖液（na2co3/nahco3緩沖液）中，調節溶液ph在9~10之間，在油浴40~55℃條件下緩慢攪拌24h，反應完成后，需進行滅酶處理。
5）將殘余的絲素纖維濾出，用截留分子量3500的透析袋對絲素蛋白溶液透析48h，得到純凈的絲素蛋白溶液。
6）將絲素蛋白溶液冷凍干燥48h，得到絲素蛋白粉末。
蛋白酶雖然具有較高的特異性，但單一酶解法對絲素蛋白的溶解度只有10%左右，溶解效率很低，而且對蠶絲的處理時間較長。所以本發明先在較高溫度下利用離子液體對絲素纖維進行初步溶脹和溶解，再加入堿性蛋白酶對絲素蛋白進行溶解，在縮短作用時間的同時，也可以提高對絲素蛋白的溶解度，其溶解度可達20%以上。
本發明中所用原料、設備，若無特別說明，均為本領域的常用原料、設備；本發明中所用方法，若無特別說明，均為本領域的常規方法。
以上所述，僅是本發明的較佳實施例，并非對本發明作任何限制，凡是根據本發明技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效變換，均仍屬于本發明技術方案的保護范圍。