一種癌癥聯合診斷標記物及其用途的制作方法

本發明屬于腫瘤分子生物學領域，具體涉及一種癌癥聯合診斷標記物、癌癥聯合診斷標記物的用途，和基于其設計的引物、檢測探針、檢測芯片和試劑盒。
背景技術：
：甲狀腺癌(thyroidcarcinoma)是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，是來源于甲狀腺上皮細胞的惡性腫瘤。其發病率約占全身惡性腫瘤的1.3％-1.5％，在內分泌系統疾病中排第一，是臨床上的常見病、多發病，且保持逐年升高趨勢。絕大部分甲狀腺癌起源于濾泡上皮細胞，按病理類型可分為乳頭狀癌(60％)、濾泡狀腺癌(20％)、未分化癌(15％)、髓樣癌(7％)。其中乳頭狀癌較早出現頸淋巴結轉移，但預后較好；濾泡狀腺癌腫瘤生長較快，屬中度惡性，易經血運轉移；未分化癌預后很差，平均存活時間3-6個月。甲狀腺癌的診斷與鑒別診斷目前仍是困擾臨床醫師的一個重要課題。隨著甲狀腺癌分子診斷的發展，對分化型甲狀腺癌的個性化治療漸漸走入人們的視線。然而目前在甲狀腺癌中發現的一系列指征腫瘤狀態的分子指標，例如：braf突變，ras(kras，hras，nras)和re-ptc重排并不足以滿足臨床上的需求。甲狀腺癌的發病率與死亡率之間存在較大差異，甲狀腺癌的病情進展相對緩慢，生存時間較長，多數甲狀腺癌患者預后較好，但仍有少數甲狀腺癌患者因腫瘤局部侵犯，或腫瘤遠處轉移而最終死于甲狀腺癌。以最常見的乳頭狀甲狀腺癌為例，其預后大多良好，但是術后10年的復發轉移風險仍有約30％，并且發病機制尚不清楚。甲狀腺癌轉移方式一般包括三種，甲狀腺癌內擴散：癌細胞沿組織間隙、淋巴管、血管侵入鄰近正常的甲狀腺組織；淋巴結轉移：癌細胞沿胸鎖乳突肌深部在頸內靜脈周圍及喉前、氣管前淋巴結轉移，患側病變亦可轉移至對側頸淋巴結，或縱隔淋巴結或全身淋巴結；血行轉移：癌細胞進入血液循環轉移至全身，如肺、肝、胸腔、骨骼等處。乳頭狀甲狀腺癌作為甲狀腺癌的常見類型，其頸淋巴轉移率為20％-90％。淋巴結轉移的診斷與治療在甲狀腺癌診治中具有廣泛的應用價值。在人類基因組的轉錄本當中，90％以上的基因并不具備編碼蛋白的能力，他們往往被轉錄成非編碼rna(non-codingrna,ncrna)。依據核苷酸的長度，我們把ncrna又分為兩大類：分別為核苷酸長度少于200nt的短鏈非編碼rna和核苷酸長度大于200nt的長鏈非編碼rna(lncrna)。lncrna一度曾被認為是基因轉錄時的“噪音”和“垃圾”，并不具有特定的生物學功能。隨著這些年的研究發現，lncrna在多種類型腫瘤細胞的增殖、克隆、凋亡、侵襲、轉移以及藥物耐藥等方面均發揮著重要的作用，同時由于lncrna具有顯著的腫瘤組織特異性，為癌癥臨床診斷提供了無創、快捷和低成本的篩查手段。隨著lncrna研究的興起，人們開始關注甲狀腺癌中lncrna的表達及調控方式，以期完善對甲狀腺的發生發展機制的理解，實現精準醫療的目標。長鏈非編碼rna是腫瘤早期診斷和基因治療研究的熱點，找到甲狀腺癌異常表達的長鏈非編碼rna并將其應用于診斷，具有非常重要的實用價值。《長鏈非編碼rnah19對促進甲狀腺癌轉移的影響》(王龍強，武漢市中心醫院甲狀腺乳腺外科，中華實驗外科雜志，2015)觀察到了一種長鏈非編碼rna(1ncrna)h19在甲狀腺癌的進展過程中的影響。h19通過提供mir-675，結合于cdh13基因，阻斷cdh13表達，進而促進甲狀腺癌細胞的侵襲和遷移能力。《alongnon-codingrna,ptcsc3,asatumorsuppressorandatargetofmirnasinthyroidcancercells》鑒定了非編碼rna乳頭狀甲狀腺癌易感性候選物3(lncrnaptcsc3)。該lncrna轉染甲狀腺癌細胞后可引起甲狀腺癌細胞增殖抑制，細胞周期阻滯和細胞凋亡增加。上述文獻分別闡述了lncrnah19或lncrnaptcsc3作為甲狀腺癌的分子診斷標記物的潛能，但是無論是lncrnah19還是lncrnaptcsc3，將其單獨應用于甲狀腺癌檢測時，都存在檢測的靈敏度低、特異性差的問題，在甲狀腺癌的轉移診斷中，易出現假陽性或假陰性，無法有效應用于甲狀腺癌的診斷、預后評估或療效監測，為臨床癌癥診斷和治療提供可靠信息。技術實現要素：為此，本發明要解決的技術問題在于解決現有技術中甲狀腺癌的檢測標記物檢測靈敏度低、特異性差，無法為甲狀腺癌的診斷、預后評估或療效監測提供有效信息；從而提供一種靈敏度高、特異性強的癌癥聯合診斷標記物。本發明提供了一種癌癥聯合診斷標記物，所述癌癥聯合診斷標記物包括lncrnah19和lncrnaptcsc3。所述的癌癥聯合診斷標記物，所述lncrnah19的cdna序列如seqidno.1所示，所述lncrnaptcsc3的cdna核苷酸序列如seqidno.2所示。本發明提供了上述的癌癥聯合診斷標記物在制備癌癥診斷、癌癥預后評估和/或癌癥治療監測的試劑中的用途。所述的用途，所述癌癥為甲狀腺癌。所述的用途，所述癌癥診斷為甲狀腺癌淋巴結轉移診斷。本發明提供了一種用于癌癥診斷的引物組，所述引物組包括基于上述的癌癥聯合診斷標記物設計的引物。所述的引物組，所述引物組包括如下所述引物：lncrnah19-f，其核苷酸序列如seqidno.3所示；lncrnah19-r，其核苷酸序列如seqidno.4所示；lncrnaptcsc3-f，其核苷酸序列如seqidno.5所示；lncrnaptcsc3-r，其核苷酸序列如seqidno.6所示。lncrnah19-f’，其核苷酸序列如seqidno.7所示；lncrnah19-r’，其核苷酸序列如seqidno.8所示；lncrnaptcsc3-f’，其核苷酸序列如seqidno.9所示；lncrnaptcsc3-r’，其核苷酸序列如seqidno.10所示。本發明提供了一種用于癌癥診斷的檢測探針組，所述檢測探針組包括基于所述的癌癥聯合診斷標記物設計的檢測探針。所述的檢測探針組，所述檢測探針組包括如下所述探針：lncrnah19-p，其核苷酸序列如seqidno.11所示；lncrnaptcsc3-p，其核苷酸序列如seqidno.12所示。所述的檢測探針組，所述檢測探針的5’端連接有報告熒光基團，3’端連接有淬滅熒光基團；所述報告熒光基團選自fam、hex或cy5，所述淬滅熒光基團選自tamra、bhq-1、bhq-2或bhq-3。本發明提供了一種用于癌癥診斷的檢測芯片，所述檢測芯片包括上述的檢測探針。本發明提供了一種用于癌癥診斷的試劑盒，所述試劑盒包括所述的引物、所述的檢測探針和/或所述的檢測芯片。所述的用于癌癥診斷的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：(1)提取樣本總rna，將總rna反轉錄為cdna；(2)以cdna作為qpcr的模板，應用所述引物、所述檢測探針或所述的檢測芯片，分別檢測樣本中所述lncrnah19和所述lncrnaptcsc3的表達量。所述的用于癌癥診斷的試劑盒的使用方法，所述樣本選自腫瘤組織、全血、血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、眼淚或外泌體。本發明相對現有技術具有如下優點：(1)本發明提供的癌癥聯合診斷標記物，包括lncrnah19和lncrnaptcsc3。通過分別檢測lncrnah19和lncrnaptcsc3的表達量，然后利用數學方法得到兩者的聯合檢測預測值，以聯合檢測預測值為變量，根據不同閾值(即變量值)對癌癥診斷的特異性和靈敏度繪制roc曲線，并計算auc值，最終根據auc值、靈敏度和特異性對癌癥樣本進行分類，應用于癌癥的診斷；將lncrnah19和lncrnaptcsc3作為標記物對癌癥進行聯合檢測，其檢測的特異性強、靈敏度高，能夠有效避免單獨以lncrnah19或lncrnaptcsc3基因作為癌癥檢測標記物時易出現的假陽性或假陰性結果，為癌癥的診斷、預后或療效監測提供可靠信息。(2)本發明提供的癌癥聯合診斷標記物能夠應用于制備癌癥診斷、癌癥預后評估和/或癌癥治療監測的試劑，其中所述的癌癥為甲狀腺癌，所述的癌癥診斷為甲狀腺癌的淋巴結轉移診斷。利用lncrnah19和lncrnaptcsc3基因所制備的試劑，在應用于甲狀腺癌患者檢測時具有準確度高的優點，能夠為甲狀腺癌淋巴結轉移的診斷、甲狀腺癌預后，以及治療效果的評估提供重要的參考信息，便于提供及時、針對性的治療，提高患者的存活率和生存質量。(3)本發明提供了用于癌癥診斷的引物組，是基于癌癥聯合診斷標記物設計的，能夠特異性檢測lncrnah19和lncrnaptcsc3基因在細胞或組織中的表達水平，進而可以對甲狀腺癌淋巴結轉移進行診斷，檢測的準確度高。(4)本發明提供的檢測探針為熒光標記的探針，能夠采用qpcr技術對lncrnah19和lncrnaptcsc3基因進行定量檢測，具有特異性和靈敏度高、時間短、操作簡單及效率高的優點。(5)本發明提供的癌癥診斷的檢測芯片，包括上述的檢測探針，將其應用于檢測甲狀腺癌患者體內lncrnah19和lncrnaptcsc3的表達情況，具有檢測特異性高、靈敏度強，以及適用于大通量篩查的優點。(6)本發明提供的癌癥診斷的試劑盒，包括上述的引物組、上述的檢測探針和/或上述的檢測芯片，能夠特異性檢測lncrnah19和lncrnaptcsc3基因的表達情況，檢測結果準確度高，在甲狀腺癌淋巴結轉移、預后和療效監測中具有較高的應用價值。(7)本發明提供的用于癌癥診斷的試劑盒的使用方法，在樣本檢測中的用途，其中的檢測樣本能夠取自外周血、尿液、唾液或眼淚等，具有取材方便、創傷小或無創傷，以及安全等優點。附圖說明為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發明實施例1中所檢測的lncrnah19和lncrnaptcsc3在甲狀腺癌淋巴結非轉移和轉移患者中不同的表達水平；圖2為本發明實施例2中所檢測的lncrnah19和lncrnaptcsc3在甲狀腺癌淋巴結非轉移和轉移患者中不同的表達水平；圖3為本發明實施例3中lncrnah19和lncrnaptcsc3聯合檢測的roc曲線；圖4為本發明對比例1中lncrnah19單獨檢測的roc曲線、lncrnaptcsc3單獨檢測的roc曲線，以及lncrnah19和lncrnaptcsc3聯合檢測的roc曲線；圖5為本發明對比例2中lncrnabancr單獨檢測的roc曲線，以及lncrnabancr和ptcsc3聯合檢測的roc曲線；圖6為本發明對比例3中lncrnabancr、h19和ptcsc3聯合檢測的roc曲線；具體實施方式以下通過具體實施例來說明本發明的實施方式，除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法均采用本
技術領域：
常規技術，所有引物合成由(生工生物工程(上海)股份有限公司)完成，實施例中所用到的試劑和原料均可由市場購得。如反轉錄試劑盒購自takara，sybr購自takara。實施例1本實施例提供一種測定樣本中lncrnah19和lncrnaptcsc3表達量的方法，具體包括以下步驟：1、樣本的采集在江蘇省原子醫學研究所附院江原醫院隨機采取41例乳頭狀甲狀腺癌患者的手術后組織樣本，選取其腫瘤組織以及距離腫瘤組織1cm以上的組織作為腫瘤臨近正常組織，分別檢測lncrnah19和lncrnaptcsc3的表達量。2、檢測乳頭狀甲狀腺癌患者的腫瘤組織和腫瘤臨近正常組織中lncrnah19以及lncrnaptcsc3的表達量：1)細胞總rna的提取(1)取腫瘤組織和腫瘤臨近正常組織各50mg，分別用pbs(ph為7.4)清洗，加入1mltrizol，移入1.5mlep管中，混勻，靜置5min；(2)12000rpm，4℃離心10min；(3)加入200μl氯仿，劇烈搖晃15s，靜置5min；(4)12000rpm，4℃離心15min；小心將上層水相移入新的1.5mlep管中，加入等體積的異丙醇，混勻后放入-20℃下1小時；(5)12000rpm，4℃離心10min，小心棄上清；(6)加入1ml的體積濃度為75％乙醇(depc水配置)洗滌沉淀，加入乙醇后，將rna沉淀彈起漂洗；(7)12000rpm，4℃離心10min，倒出液體，剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸棄沉淀；(8)室溫晾干，用30μl的depc(焦碳酸二乙酯)水溶解，測濃度。2)去除基因組dna的反應，使用superscriptiiifirst-strandsynthesissystemkit，將步驟1)中提取的細胞總rna配制為表1所示的混合體系，將混合體系在42℃下靜置2min，去除rna中混有的基因組dna。表1去除dna的反應混合體系試劑使用量5*gdnaeraserbuffer2μlgdnaeraser1μltotalrna1μgrnasefreeh2oupto10μl3)使用rtase反轉錄試劑盒，將冷藏儲存的反轉錄試劑盒取出后，放置恢復至室溫(20-25℃)，將步驟2)中獲得的組織總rna反轉錄為cdna，組織總rna反應液為10μl，反轉錄的反應程序為：37℃保持15min，85℃保持5s，4℃恒溫靜置，所述反轉錄的擴增體系如下所示：表2反轉錄擴增體系試劑使用量5×primescriptbuffer2μlprimescriptrtenzymemixi0.5μloligodtprimer(50μm)0.5μlrandom6mers(100m)0.5μltotalrna2μlrnasefreeddh2o4.5μl4)構建陽性標準品質粒(1)以步驟3)中所得的cdna為模板，采用lncrnah19的擴增引物lncrnah19-f和lncrnah19-r擴增得到101bp的目標片段，其中上游引物lncrnah19-f的序列如seqidno.3所示，下游引物lncrnah19-r的序列如seqidno.4所示。pcr產物純化(qiagen,german)回收目標片段并連接到pmd18-t(購自takara)克隆載體，然后轉化到dh5α感受態細胞，篩選陽性克隆提取質粒dna，得到陽性標準品pmd18-t-lncrnah19。(2)以步驟3)中所得的cdna為模板，采用lncrnaptcsc3的擴增引物lncrnaptcsc3-f和lncrnaptcsc3-r擴增得到226bp的目標片段，其中上游引物lncrnaptcsc3-f的序列如seqidno.5所示，下游引物lncrnaptcsc3-r的序列如seqidno.6所示。pcr產物純化(qiagen,german)回收目標片段并連接到pmd18-t(購自takara)克隆載體，然后轉化到dh5α感受態細胞，篩選陽性克隆提取質粒dna，得到陽性標準品pmd18-t-lncrnaptcsc3。5)反轉錄反應后，以步驟3)中所得的cdna為模板，選擇premixextaqii試劑盒(購自takara)進行qpcr操作，檢測組織中lncrnah19和lncrnaptcsc3的表達情況，每個樣本設置至少3個平行對照組，以gapdh作為內參，同時設置ddh2o陰性對照和陽性標準品對照(pmd18-t-lncrnah19和pmd18-t-lncrnaptcsc3)；lncrnah19擴增的上游引物lncrnah19-f的序列如seqidno.3所示，下游引物lncrnah19-r的序列如seqidno.4所示。lncrnaptcsc3擴增的上游引物lncrnaptcsc3-f的序列如seqidno.5所示，下游引物lncrnaptcsc3-r的序列如seqidno.6所示；內參gapdh擴增的上游引物gapdh-f序列為5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’，gapdh擴增的下游引物gapdh-r序列為5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’。qpcr的反應體系i如下所示，為減少平行復孔間的人為誤差，試劑需同時配置每個引物所需的總量再分加至已加入相應cdna的孔中。每孔的總體積為20μl，此過程務必在三十分鐘內完成：表3qpcr反應體系i用微孔板蓋蓋好板或是用相應的封口膜封住96孔板，離心使得所加試劑均位于孔板底部，孔壁上無殘留；熒光定量pcr使用abi公司開發的實時熒光定量pcr儀進行檢測。反應程序為：95℃保持30s，(95℃保持15s，60℃保持30s)，40個循環，60℃保持5min。癌癥組織和正常組織中lncrnah19和lncrnaptcsc3的檢測結果如圖1所示，甲狀腺淋巴結轉移患者中的lncrnah19表達量高于甲狀腺淋巴結轉移非轉移的患者，而甲狀腺淋巴結轉移患者中的lncrnaptcsc3表達量低于甲狀腺淋巴結轉移非轉移的患者，表明lncrnah19和lncrnaptcsc3的表達水平與甲狀腺癌淋巴結轉移具有密切的相關性。實施例2本實施例提供一種應用檢測探針測定樣本中lncrnah19和lncrnaptcsc3表達量的方法，具體包括以下步驟：1)構建陽性標準品質粒應用實施例1中所示的陽性標準品質粒的構建方法，利用引物lncrnah19-f’和lncrnah19-r’擴增lncrnah19片段，連接至pmd18-t，得到陽性標準品質粒pmd18-t-lncrnah19-2；利用引物lncrnaptcsc3-f’和lncrnaptcsc3-r’擴增lncrnaptcsc3片段，連接至pmd18-t，得到陽性標準品質粒pmd18-t-lncrnaptcsc3-2。2)以實施例1中所得的cdna為模板，選擇premixextaqtm試劑盒(購自takara)進行qpcr操作，檢測組織中lncrnah19和lncrnaptcsc3的表達情況，每個樣本設置至少3個平行對照組，以gapdh作為內參，同時設置ddh2o陰性對照和陽性標準品對照(pmd18-t-lncrnah19-2和pmd18-t-lncrnaptcsc3-2)；lncrnah19的檢測探針lncrnah19-p的序列如seqidno.11所示，探針5’端標記fam，3’端標記tamra；lncrnah19擴增的上游引物lncrnah19-f’的序列如seqidno.7所示，下游引物lncrnah19-r’的序列如seqidno.8所示。lncrnaptcsc3的檢測探針lncrnaptcsc3-p的序列如seqidno.12所示，探針5’端標記fam，3’端標記tamra；lncrnaptcsc3擴增的上游引物lncrnaptcsc3-f’的序列如seqidno.9所示，下游引物lncrnaptcsc3-r’的序列如seqidno.10所示；內參gapdh的檢測探針gapdh-p序列為5’-gtgctaagcagttggtggtgcagga-3’，探針5’端標記fam，3’端標記tamra；gapdh擴增的上游引物gapdh-f序列為5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’，gapdh擴增的下游引物gapdh-r序列為5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’。qpcr的反應體系ii如下所示，為減少平行復孔間的人為誤差，試劑需同時配置每個引物所需的總量再分加至已加入相應cdna的孔中。每孔的總體積為20μl，此過程務必在三十分鐘內完成：表4qpcr反應體系ii試劑使用量premixextaq(2×)10μlpcrforwardprimer，10μm0.4μlpcrforwardprimer，10μm0.4μl熒光探針，10μm0.8μlroxreferencedye(50×)0.4μlcdna模板2μlddh2o6.0μltotal20μl用微孔板蓋蓋好板或是用相應的封口膜封住96孔板，離心使得所加試劑均位于孔板底部，孔壁上無殘留；熒光定量pcr使用abi公司開發的實時熒光定量pcr儀進行檢測。反應程序為：95℃保持30s，(95℃保持15s，60℃保持30s)，40個循環，60℃保持5min。癌癥組織和正常組織中lncrnah19和lncrnaptcsc3的檢測結果同實施例1中的檢測結果如圖2所示：甲狀腺淋巴結轉移患者中的lncrnah19表達量高于甲狀腺淋巴結轉移非轉移的患者，而甲狀腺淋巴結轉移患者中的lncrnaptcsc3表達量低于甲狀腺淋巴結轉移非轉移的患者，進一步驗證了lncrnah19和lncrnaptcsc3的表達水平與甲狀腺癌淋巴結轉移具有密切的相關性。實施例3本實施例提供一種聯合檢測樣本中的lncrnah19和lncrnaptcsc3，以提高樣本分類準確性的方法，具體包括以下步驟：1、用qpcr分別檢測出樣本中與甲狀腺癌淋巴結轉移具有密切相關性的lncrnah19和lncrnaptcsc3的表達量。2、用數學分析方法對步驟1中測得的樣本中lncrnah19和lncrnaptcsc3的表達情況進行統計學處理，在此基礎上獲得具有樣本分類意義的分級標準。這樣的數學方法優選由計算機完成，本實施例中用這些數據繪制roc曲線，從而對個體的樣本進行分類。roc曲線全稱為受試者工作特征曲線(receiveroperatorcharacteristiccurve)，又稱為接收者操作特性曲線，主要用于臨床生化診斷試驗。roc曲線是反映真陽性率(靈敏度，又稱敏感性，sensitivity)和假陽性率(1-特異性，specificity)連續變量的綜合指標，是用構圖法揭示靈敏度和特異性的相互關系。它通過設定一系列不同的分界值(閾值或臨界值，cut-offvalue，是劃分診斷試驗結果正常與異常的界值)作為連續變量，從而計算出一系列靈敏度和特異性，再以靈敏度為縱坐標、1-特異性為橫坐標繪制的曲線，曲線下面積(auc)越大，診斷準確性越高。在roc曲線上，最靠近坐標圖左上方的點為靈敏度和特異性均較高的臨界值。roc曲線auc值在1.0和0.5之間。在auc>0.5的情況下，auc越接近于1，說明診斷效果越好。auc在0.5～0.7時有較低準確性，auc在0.7～0.9時有一定準確性，auc在0.9以上時有較高準確性。roc曲線的評價方法與傳統的評價方法不同，根據實際情況，允許有中間狀態，可以把試驗結果分為多個有序分類，比如:正常、大致正常、可疑、大致異常和異常五個等級。上述有序分類，對于疾病的診斷而言，可分為:陰性、不確定、陽性。進一步地，對于甲狀腺癌診斷而言，可分為:轉移、不轉移。本實施例中的具體檢測步驟如下:(1)分別測定樣本中lncrnah19和lncrnaptcsc3的表達量；(2)根據所測得的lncrnah19和lncrnaptcsc3的表達量通過二分類logistic回歸計算新的聯合檢測預測值；(3)以聯合檢測預測值為變量，根據不同的閾值(也即聯合檢測預測值)對癌癥診斷的靈敏度和特異性繪制出roc曲線，并計算曲線下面積auc；(4)按照期望的靈敏度和特異性，對測定樣本進行分類(轉移或不轉移)。roc曲線的繪制可以使用現有
技術領域：
的軟件或系統，比如＝medcalc9.2.0.1醫學統計軟件、spss9.0、r0cp0wer.sas、designr0c.for、multireader_p0wer.sas,create—roc.sas>gbstatv10.0(dynamicmicrosystems,inc.silverspring,md,usa)等等。本實施例中以lncrnah19和lncrnaptcsc3的表達量所計算的聯合檢測預測值為變量，使用spss軟件繪制的roc曲線并計算曲線下面積(auc)。roc曲線如圖3所示，聯合檢測lncrnah19和lncrnaptcsc3診斷甲狀腺癌淋巴結轉移的auc＝0.79，p<0.01。當閾值為0.33(聯合檢測預測值)時，診斷甲狀腺癌淋巴結轉移的靈敏度為0.67，特異性為0.89，實際診斷甲狀腺癌淋巴結轉移的準確性好。將lncrnah19和lncrnaptcsc3作為甲狀腺癌淋巴結轉移的聯合診斷標記物，具有特異性強、靈敏度高的優點，應用其檢測甲狀腺癌淋巴結轉移，能夠顯著提高檢測結果的準確性，為甲狀腺癌患者的診斷、預后，以及治療效果的評估提供重要的參考信息，便于提供及時、針對性的治療，提高患者的存活率和生存質量，因此聯合檢測h19和ptcsc3具有很大的開發價值。實施例4本實施例提供了一種用于癌癥診斷的試劑盒，試劑盒包括：(1)分別用于檢測lncrnah19和lncrnaptcsc3的引物，具體的為實施例2中所述的用于檢測lncrnah19表達量的上游引物lncrnah19-f和下游引物lncrnah19-r，以及檢測lncrnaptcsc3表達量的上游引物lncrnaptcsc3-f和下游引物lncrnaptcsc3-r；上述的試劑盒還包括：(2)qpcr反應混合液i，qpcr反應混合液i包括實施例1中表3所示的反應體系；(3)lncrnah19標準品i，實施例1中構建的載體pmd18-t-lncrnah19或包括上述載體的基因工程菌；(4)lncrnaptcsc3標準品i，實施例1中構建的載體pmd18-t-lncrnaptcsc3或包括上述載體的基因工程菌；(5)內參gapdh以及內參的檢測引物gapdh-f、gapdh-r，gapdh-f:5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’、gapdh-r:5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’。本發明提供的試劑盒能夠應用于腫瘤組織、全血、血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、眼淚或外泌體中lncrnah19和lncrnaptcsc3表達量的檢測，進一步，由于lncrnah19和lncrnaptcsc3作為聯合診斷標記物具有檢測的靈敏度高和特異性強的優點，本實施例提供的試劑盒能夠對測定樣本是否為甲狀腺癌淋巴結轉移進行有效的判定；進而為甲狀腺癌淋巴結轉移的診斷、甲狀腺癌的預后或治療效果的監測提供可靠的信息。實施例5本實施例提供了一種用于癌癥診斷的試劑盒，試劑盒包括：(1)分別用于檢測lncrnah19和lncrnaptcsc3的檢測探針與擴增引物，具體地為實施例2中提供的檢測探針lncrnah19-p、lncrnaptcsc3-p、lncrnah19的擴增引物lncrnah19-f’和lncrnah19-r’，以及lncrnaptcsc3的擴增引物lncrnaptcsc3-f’和lncrnaptcsc3-r’；上述的試劑盒還包括：(2)qpcr反應混合液ii，qpcr反應混合液ii包括實施例2中表4所示的反應體系；(3)lncrnah19標準品ii，實施例2中構建的載體pmd18-t-lncrnah19-2或包括上述載體的基因工程菌；(4)lncrnaptcsc3標準品ii，實施例2中構建的載體pmd18-t-lncrnaptcsc3-2或包括上述載體的基因工程菌；(5)內參gapdh以及內參的檢測探針gapdh-p和擴增引物gapdh-f、gapdh-r，gapdh-p:5’-gtgctaagcagttggtggtgcagga-3’，gapdh-f:5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’、gapdh-r:5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’。本發明提供的試劑盒能夠應用于腫瘤組織、全血、血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、眼淚或外泌體中lncrnah19和lncrnaptcsc3表達量的檢測，由于lncrnah19和lncrnaptcsc3作為聯合診斷標記物具有檢測的靈敏度高和特異性強的優點，本實施例提供的試劑盒能夠對測定樣本是否為甲狀腺癌淋巴結轉移進行有效的判定；進而為甲狀腺癌淋巴結轉移的診斷、甲狀腺癌的預后或治療效果的監測提供可靠的信息。對比例1使用spss軟件分別對lncrnah19和lncrnaptcsc3測量值為變量，根據不同的閾值對淋巴結轉移診斷的靈敏度和特異性繪制出roc曲線，并計算曲線下各自面積auc；繪制出roc曲線并計算曲線下面積(auc)。如圖4所示，lncrnah19和lncrnaptcsc3診斷甲狀腺癌淋巴結轉移的auc值分別如下：lncrnah19auc＝0.56；p＝0.54和lncrnaptcsc3auc＝0.61；p＝0.27。因此，單獨以lncrnah19或lncrnaptcsc3作為標記物檢測甲狀腺癌淋巴結轉移，標記物的靈敏度和特異性低，檢測的準確性低，易出現假陽性或假陰性的檢測結果。因此，lncrnah19或lncrnaptcsc3的單獨檢測無法指示乳頭狀甲狀腺癌淋巴結轉移。對比例2以bancr單獨測量值為變量，并使用spss軟件對bancr和lncrnaptcsc3測量值進行線性回歸處理得到兩者聯合檢測的預測率，再以此預測率為變量，根據不同的閾值對淋巴結轉移診斷的靈敏度和特異性繪制出roc曲線，并計算曲線下面積auc；繪制出roc曲線并計算曲線下面積(auc)，如圖5所示，單獨檢測bancr和聯合檢測bancr和ptcsc3診斷甲狀腺癌淋巴結轉移的auc分別為：bancrauc＝0.60，p＝0.28；聯合檢測bancr和lncrnaptcsc3的auc＝0.61，p＝0.24。相比聯合檢測lncrnah19和lncrnaptcsc3，單獨檢測bancr和聯合檢測bancr和lncrnaptcsc3均不能有效地指示乳頭狀甲狀腺癌淋巴結轉移。對比例3使用spss軟件對bancr、lncrnaptcsc3和lncrnah19測量值進行線性回歸處理得到兩者聯合檢測的預測率，以此預測率為變量，根據不同的閾值對淋巴結轉移診斷的靈敏度和特異性繪制出roc曲線，并計算曲線下面積auc；繪制出roc曲線并計算曲線下面積(auc)，如圖6所示聯合檢測bancr、lncrnaptcsc3和lncrnah19診斷甲狀腺癌淋巴結轉移的auc＝0.62，p＝0.19。因此，聯合檢測lncrnaptcsc3和lncrnah19的檢測準確性優于聯合檢測bancr、lncrnaptcsc3和lncrnah19，將lncrnaptcsc3和lncrnah19作為診斷甲狀腺癌淋巴結轉移的聯合標記物，有利于甲狀腺癌淋巴結轉移的診斷、預后，以及甲狀腺癌治療效果的監測。顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明創造的保護范圍之中。sequencelisting<110>江蘇原子醫學研究所<120>一種癌癥聯合診斷標記物及其用途<130>wxha201700008<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>2362<212>dna<213>人工序列<400>1agttagaaaaagcccgggctaggaccgaggagcagggtgagggagggggtgggatgggtg60gggggtaacgggggaaactggggaagtggggaaccgaggggcaaccaggggaagatgggg120tgctggaggagagcttgtgggagccaaggagcaccttggacatctggagtctggcaggag180tgatgacgggtggaggggctagctcgaggcagggctggtggggcctgaggccagtgagga240gtgtggagtaggcgcccaggcatcgtgcagacagggcgacatcagctggggacgatgggc300ctgagctagggctggaaagaagggggagccaggcattcatcccggtcacttttggttaca360ggacgtggcagctggttggacgaggggagctggtgggcagggtttgatcccagggcctgg420gcaacggaggtgtagctggcagcagcgggcaggtgaggaccccatctgccgggcaggtga480gtcccttccctccccaggcctcgcttccccagccttctgaaagaaggaggtttaggggat540cgagggctggcggggagaagcagacaccctcccagcagaggggcaggatgggggcaggag600agttagcaaaggtgacatcttctcggggggagccgagactgcgcaaggctggggggttat660gggcccgttccaggcagaaagagcaagagggcagggagggagcacaggggtggccagcgt720agggtccagcacgtggggtggtaccccaggcctgggtcagacagggacatggcaggggac780acaggacagaggggtccccagctgccacctcacccaccgcaattcatttagtagcaggca840caggggcagctccggcacggctttctcaggcctatgccggagcctcgagggctggagagc900gggaagacaggcagtgctcggggagttgcagcaggacgtcaccaggagggcgaagcggcc960acgggaggggggccccgggacattgcgcagcaaggaggctgcaggggctcggcctgcggg1020cgccggtcccacgaggcactgcggcccagggtctggtgcggagagggcccacagtggact1080tggtgacgctgtatgccctcaccgctcagcccctggggctggcttggcagacagtacagc1140atccaggggagtcaagggcatggggcgagaccagactaggcgaggcgggcggggcggagt1200gaatgagctctcaggagggaggatggtgcaggcaggggtgaggagcgcagcgggcggcga1260gcgggaggcactggcctccagagcccgtggccaaggcgggcctcgcgggcggcgacggag1320ccgggatcggtgcctcagcgttcgggctggagacgaggccaggtctccagctggggtgga1380cgtgcccaccagctgccgaaggccaagacgccaggtccggtggacgtgacaagcaggaca1440tgacatggtccggtgtgacggcgaggacagaggaggcgcgtccggccttcctgaacacct1500taggctggtggggctgcggcaagaagcgggtctgtttctttacttcctccacggagtcgg1560cacactatggctgccctctgggctcccagaacccacaacatgaaagaaatggtgctaccc1620agctcaagcctgggcctttgaatccggacacaaaaccctctagcttggaaatgaatatgc1680tgcactttacaaccactgcactacctgactcaggaatcggctctggaaggtgaagctaga1740ggaaccagacctcatcagcccaacatcaaagacaccatcggaacagcagcgcccgcagca1800cccaccccgcaccggcgactccatcttcatggccaccccctgcggcggacggttgaccac1860cagccaccacatcatcccagagctgagctcctccagcgggatgacgccgtccccaccacc1920tccctcttcttctttttcatccttctgtctctttgtttctgagctttcctgtctttcctt1980ttttctgagagattcaaagcctccacgactctgtttcccccgtcccttctgaatttaatt2040tgcactaagtcatttgcactggttggagttgtggagacggccttgagtctcagtacgagt2100gtgcgtgagtgtgagccaccttggcaagtgcctgtgcagggcccggccgccctccatctg2160ggccgggtgactgggcgccggctgtgtgcccgaggcctcaccctgccctcgcctagtctg2220gaagctccgaccgacatcacggagcagccttcaagcattccattacgccccatctcgctc2280tgtgcccctccccaccagggcttcagcaggagccctggactcatcatcaataaacactgt2340tacagcaaaaaaaaaaaaaaaa2362<210>2<211>1152<212>dna<213>人工序列<400>2aaactccttcagacttctcagtactcaagacatctcaagtttttgaagagtaaagtataa60aatactggcaggggtgggtagggggaacaggataaattggtgatggcccagaaaaaatat120ccagggggatcgcatttttcttctccaaagcaaaacagaattcataactgaaagaggaat180agagaaagaggaaaaaagtgatctgggacctgttgtttttcttgcatcccatttctactc240tgcctgtgagtgaagactgttgtggaaaagtcaactggagagaccaggtcaaaggccaag300cagaagaggaattaggcttaagactgcactgagagggaacactagaccatggtggcaaaa360tggccgaataggagcagctccagtctacagctcccagggagattaatgcaaaagatggag420tctcgacacgttgcccaagctgttctcaaactccagggcttgaacaatcttcccaccttg480gcctcccaaggcactggaattacagagacagtgctctgcagggagtctaccactgtgatg540gttaatactgagtgtcaacttgattggattgaaggatgcaaagtattgttcctgggtgtg600tctgtgagggtgttgccaaaggagattaacatttgagtcagtgggctgggaaaggtagac660ccagccgtaatctaggtgggcaccatctaatcagctgccagcacagctagaagataaagt720aggcagaaaaacatgaaaacattagactggcctagcctctgagcctacatctttctccca780tgctggatgctccctgcccttgaacatcagactccaagtttttcagttttgggactggga840ctcactatccttgctcctcagcttgcagacagcctattgtgggaccttatgatcatgtga900gttaatacttaatacataaatatatatatatacacacacacatatacacacacacacaca960catatatatatacacacacacacacatatatatatatatctgtccctctagagaaccctg1020actaatacaactactaataaaaattggggcaaaagacattgattgggtattgtaagtagg1080ttatgctcacagtagcaatatctcttaagactttttaaaagacttcctaataaaagagat1140ttaaaatacagc1152<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3tgctgcactttacaaccactg21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4atggtgtctttgatgttgggc21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5tcaaactccagggcttgaac20<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6attacggctgggtctacct19<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7ccagccaccacatcatcccaga22<210>8<211>26<212>dna<213>人工序列<400>8ctccctcttcttctttttcatccttc26<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列<400>9tgaacatcagactccaagtttttc24<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10cagcctattgtgggaccttat21<210>11<211>13<212>dna<213>人工序列<400>11gggatgacgccgt13<210>12<211>16<212>dna<213>人工序列<400>12tcactatccttgctcc16當前第1頁12