一種5?羰基?2?戊烯酰基輔酶A還原酶突變體的制作方法

本發明涉及一種5-羰基-2-戊烯酰基輔酶a還原酶突變體，屬于生物工程領域。

背景技術：

己二酸(adipicacid)又稱肥酸，是一種重要的平臺化合物，當前己二酸最重要的應用領域是合成尼龍類纖維(比如尼龍6,6)。預計到2018年，己二酸全球的市場價值將達到63億美元。

工業上己二酸的生產路線主要通過硝酸對環己醇—環己酮的混合物(醇酮油，也稱ka油)進行氧化制取。但是該方法具有工藝流程長、副產物多、產品收率低、工業“三廢”排放嚴重等問題，特別是溫室氣體的排放量十分大。因此，人們迫切需要尋找一種能替代傳統化學合成己二酸的方法。隨著生物技術的發展，全生物合成法生產有機酸具有生產成本低，生產工藝簡單，污染小，產品純度高等優勢，所以該方法越來越受人們青睞。近年來，許多國內外的研究機構投入了大量的資源對上述方法進行了深入的研究。總部位于美國genomatica公司和verdezyne公司是該研究領域的領跑者。

verdezyne公司通過研究發現，有些酵母在降解甘油三酯的程中能夠積累己二酸。比如該公司利用椰子油(coconutoil)作為底物，利用酵母，將皂化后的脂肪酸經過一系列β氧化和ω氧化，成功積累了己二酸。由于該方法僅能以椰子油做底物，所并不適合在我國推廣。

genomatica公司通過生物信息學和系統的方法，尋找到了多種可能利用糖質原料全生物合成己二酸的途徑，并對其中兩個代謝途徑的可行性進了探討，其中一個途徑是3-氧代己二酸途徑(3-oxoadipatepathway)，另一個是3-氧代己二酰輔酶a途徑(3-oxoadipyl-coapathway)。經過計算，該公司認為以上兩種途徑在大腸桿菌中表達后都能達到92％的理論產率(以葡萄糖為底物)。

上海交通大學的鐘建江教授研究團隊發現了與3-氧代己二酰輔酶a途徑類似的途徑(如圖1)，然后將不同來源的5種酶的基因，連接到質粒后導入大腸桿菌進行表達，從而獲得己二酸的積累。本人所在團隊對一株褐色嗜熱裂孢菌(thermobifidafusca)進行代謝改造后，發現該工程菌株b6能夠生產己二酸。本團隊發現該菌生產己二酸的途徑為3-氧代己二酰輔酶a途徑(如圖1)，包括：tfu_0875(β-酮硫解酶，β-ketothiolase)，tfu_2399(3-羥酰基-輔酶a脫氫酶，3-hydroxyacyl-coadehydrogenase)tfu_0067(3-羥基己二酰脫氫酶，3-hydroxyadipyl-coadehydrogenase)，tfu_1647(5-羧基-2-戊烯酰輔酶a還原酶，5-carboxy-2-pentenoyl-coareductase)以及tfu_2577和tfu_2576(succinyl-coasynthase，琥珀酰輔酶a合成酶)。將該途徑的六種基因導入到大腸桿菌中，同樣也獲得了己二酸的積累。但是這兩個途徑都不能高效積累己二酸。

技術實現要素：

為解決上述問題，本發明以表達5-羰基-2-戊烯酰基輔酶a還原酶的基因tfu_1647為研究對象，通過discoverystudio(ds)對tfu-1647理性預測并進行定點突變，以提高目的產物己二酸的產量。

本發明的第一個目的是提供一種5-羰基-2-戊烯酰基輔酶a還原酶突變體，所述突變體相對于5-羰基-2-戊烯酰基輔酶a還原酶親本，將第334位的谷氨酸突變為精氨酸。

在本發明的一種實施方式中，所述5-羰基-2-戊烯酰基輔酶a還原酶親本的氨基酸序列如seqidno.1所示。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本發明的第二個目的是提供一種編碼上述突變體的基因。

本發明的第三個目的是提供一種含有編碼上述突變體核苷酸序列的重組質粒載體。

本發明的第四個目的是提供一種表達上述突變體的重組細胞。

在本發明的一種實施方式中，所述重組細胞還表達了氨基酸序列如seqidno.5所示的β-酮硫解酶，氨基酸序列如seqidno.6所示的3-羥酰基-輔酶a脫氫酶，氨基酸序列如seqidno.7所示的3-羥基己二酰脫氫酶，氨基酸序列如seqidno.8所示的琥珀酰輔酶a合成酶，以及氨基酸序列如seqidno.9所示的琥珀酰輔酶a合成酶。

在本發明的一種實施方式中，所述重組細胞為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母或畢赤酵母細胞。

在本發明的一種實施方式中，所述重組細胞的構建方法是：

(1)設計定點突變所用引物，以攜帶5-羰基-2-戊烯酰基輔酶a還原酶親本基因的載體為模板進行突變并構建含有突變體的質粒載體ptrc99a-0067-1647；其中質粒載體ptrc99a-0067-1647是指在質粒ptrc99a上連接氨基酸序列如seqidno.7所示的3-羥基己二酰脫氫酶的基因和氨基酸序列如seqidno.2所示的5-羰基-2-戊烯酰基輔酶a還原酶基因；

(2)將突變質粒轉化進宿主細胞；

(3)將連接了氨基酸序列如seqidno.5所示的β-酮硫解酶基因和氨基酸序列如seqidno.6所示的3-羥酰基-輔酶a脫氫酶基因的質粒prsf-0875-2399轉化進宿主細胞；

(4)將連接了氨基酸序列如seqidno.8所示的琥珀酰輔酶a合成酶基因和氨基酸序列如seqidno.9所示的琥珀酰輔酶a合成酶基因的質粒pcd-2576-2577轉化進宿主細胞，最終得到重組細胞。

在本發明的一種實施方式中，所述宿主細胞為大腸桿菌bl21(de3)。

本發明的第五個目的是提供一種上述突變體在生產己二酸中的應用。

在本發明的一種實施方式中，所述應用是將含有權利要求1所述突變株的單菌落接入含有kan，amp，str三種抗生素的lb培養基中，35-38℃，200-250r/min搖床培養過夜，將該種子液以2-5％接種量接入到發酵培養基中，待菌體生長至od＝0.7左右，加入iptg誘導，然后轉入28-32℃培養。

本發明有益效果

本發明對產己二酸代謝途徑3-氧代己二酰輔酶a途徑中的限速基因tfu_1647進行定點突變，得到一株己二酸產量提高的突變菌株。采用本發明的突變菌株發酵24h，己二酸產量由對照菌株的0.24g/l提高到1.01g/l，提高了近5倍。采用本發明的突變體，大大提高了己二酸產量，降低生產成本，促進己二酸在工業上的推廣應用。

附圖說明

圖1：己二酸積累途徑；

圖2：model-1647的活性口袋；

圖3：ptrc99a-0067-1647的質粒圖譜；

圖4：突變菌株的己二酸產量結果。

具體實施方式

實施例1：突變位點選擇

同源建模

以5-羰基-2-戊烯酰基輔酶a還原酶(對應的基因為tfu-1647)的氨基酸序列seqidno.1為基礎，利用swiss-model對5-羰基-2-戊烯酰基輔酶a還原酶進行同源建模，得到模型model-1647。

活性口袋及活性位點的預測

利用discoverystudio3.0對模型model-1647進行模擬，尋找活性口袋，如圖2所示。

實施例2：突變體的構建

利用定點突變成功構建一個突變體e334r。

具體步驟如下：

(1)定點突變

以突變點為中心，突變點的前后各擴展15-20bp，設計序列如seqidno.3/seqidno.4所示的引物對6號-f:agtgatgtcgctatgaggattactactgatgccgtgca/6號-r:ggcatcagtagtaatcctcatagcgacatcactggcg。

以突變點為中心，以連接有親本基因的質粒ptrc99a-0067-1647為模版(質粒圖譜見圖3)進行全質粒pcr(pcr的體系見表1)。其中連接有親本基因的質粒ptrc99a-0067-1647是指在質粒ptrc99a上連接氨基酸序列如seqidno.7所示的3-羥基己二酰脫氫酶的基因和氨基酸序列如seqidno.1所示的5-羰基-2-戊烯酰基輔酶a還原酶親本基因。

表1：質粒ptrc99a-0067-1647全質粒pcr的體系

其反應程序為：95℃預變性5min，95℃變性10s，55℃退火5s，72℃延伸2min，反應進行28個循環之后，72℃再延伸10min。

(2)pcr產物的純化

用pcr純化試劑盒(購自生工生物工程(上海)股份有限公司)對pcr產物進行純化。首先，將pcr產物轉移至干凈的1.5ml的離心管中再用ddh2o補充至100μl，然后向里面加入5倍體積(500μl)的bufferb3，充分混勻，將混合液轉移至全部轉移至吸附柱，8000g離心30sec，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。向吸附柱中加入500μlwashsolution，9000g離心30sec，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中，該步驟重復兩次。然后將空吸附柱和收集管放入離心機，10000g離心2min，以除盡殘余的乙醇。最后，在吸附膜的中央加入50℃預熱的ddh2o40μl，室溫靜置2min，9000g離心1min。將得到的dna溶液于-20℃保存或直接用于后續實驗。

(3)dpni酶消化pcr純化產物

將純化產物用dpni進行消化，其消化的體系見表2。

表2：消化pcr產物的體系

將該混合液加入200μl的離心管中，在渦旋器上震蕩混勻，然后瞬時離心一下，置于37℃水浴鍋中，保溫2h。然后于-20℃保存或直接用于后續實驗。

(4)質粒轉化入jm109感受態細胞

將步驟(3)所得消化產物20μl加入到感受態jm109細胞中，混勻，置于冰上，冰浴30min以上后，42℃熱激90sec，熱激后迅速將其轉移至冰上，繼續冰浴3-5min，然后向其中加入800μl的lb培養基后置于37℃，220r/min的搖床上孵育。1h后3500g離心2min，棄去800μl上清，用剩余的液體將菌體懸浮起來，均勻地涂布在含50μg/mlamp的固體lb平板上，置37℃培養箱里培育過夜。

(5)突變質粒的提取

從上步中的平板上挑取單菌落，放入含50μg/mlamp的lb培養基里，37℃，220r/min的搖床上孵育10-16h，取菌液5ml，8000g離心2min，收集菌體，倒盡培養基，加入250μl的bufferp1，吹打懸浮菌體，然后加入250μl的bufferp2，立即溫和地顛倒離心管10次混勻，靜置2-4min，最后向離心管中再加入350μl的bufferp3，溫和地顛倒離心管10次混勻。于離心機中12000g離心10min，將上清小心的轉移至吸附柱，9000g離心30s，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。然后向吸附柱中加入500μl的去蛋白液bufferdw1，9000g離心30s，倒掉收集管中的液體，繼續將吸附柱放入同一收集管中，向其中加入500μlwashsolution，9000g離心30s，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中，該步驟重復兩次。然后將空吸附柱和收集管放入離心機，10000g離心2min，以除盡殘余的乙醇。最后，在吸附膜的中央加入50℃預熱的ddh2o60μl，室溫靜置2min，9000g離心1min。將得到的dna溶液于-20℃保存或直接用于后續實驗。

(6)導入大腸桿菌bl21(de3)的感受態細胞中

將突變質粒ptrc99a-0067-1647與該己二酸合成途徑中的另外兩個質粒prsf-0875-2399，pcd-2576-2577(質粒prsf-0875-2399是指在質粒prsf上連接了氨基酸序列如seqidno.5所示的β-酮硫解酶基因和氨基酸序列如seqidno.6所示的3-羥酰基-輔酶a脫氫酶基因；質粒pcd-2576-2577是指在質粒pcd上連接了氨基酸序列如seqidno.8所示的琥珀酰輔酶a合成酶基因和氨基酸序列如seqidno.9所示的琥珀酰輔酶a合成酶基因)各5μl加入到100μl的bl21(de3)感受態細胞中，混勻，置于冰上，冰浴30min以上后，42℃熱激90sec，熱激后迅速將其轉移至冰上，繼續冰浴3-5min，然后向其中加入800μl的lb培養基后置于37℃，220r/min的搖床上孵育。1h后3500g離心2min，棄去800μl上清，用剩余的液體將菌體懸浮起來，均勻地涂布在含kan，amp，str(濃度都為50μg/ml)的固體lb平板上，置37℃培養箱里培育過夜，得到表達突變體e334r的突變菌株，命名為突變菌株6號。

實施例3：突變體對己二酸積累的影響

發酵培養突變的重組菌

挑取實施例2中得到的表達突變體e334r的突變菌株6號的單菌落接入含有kan，amp，str(濃度都為50μg/ml)三種抗生素的lb培養基中，37℃，220r/min搖床培養過夜(種子液)，將該種子液以2％的比例接入到發酵培養基m9中(除m9中必含的鹽外還包含1.5～2.5mmmgso4、0.08～0.12mmcacl2、50g/ml的kan，amp，str三種抗生素和4g/l的葡萄糖)，待菌體生長至od＝0.7左右，加入1m的iptg30ul誘導，然后轉入30℃搖床培養。分別在誘導后10h，14h，18h，22h，26h，30h，34h，38h，42h，46h取樣1.5ml，置于2ml的離心管中，-20℃保存或直接用于后續實驗。

高效液相色譜檢測發酵液

將發酵液于12000g離心5min，取上清，用0.22μm的濾膜過濾入液相瓶中，以5mm的硫酸為流動相，柱溫為30℃，流速為0.6ml/min，檢測己二酸的積累量。其中未進行突變的重組菌bl21(de3)prsf-0875-2399，ptrc99a-0067-1647，pcd-2576-2577按同樣的方法處理，作為對照。

突變株與對照相比，發酵24小時，己二酸產量提高近5倍，對照的產量是0.24g/l，而突變菌株6號的產量為1.01g/l。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

序列表

<110>江南大學

<120>一種5-羰基-2-戊烯酰基輔酶a還原酶突變體

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