本發明涉及精油提取技術領域，特別是涉及一種虎掌菌精油的提取方法及其應用。
背景技術：
虎掌菌，也稱為翹鱗肉齒菌，屬于菌物界，擔子菌門，傘菌綱，革菌目，坂氏菌科。野生虎掌菌因其外觀獨特、無蓋無柄、菌體表面有纖細的絨毛及黑色的花紋，酷似虎掌因而得名。虎掌菌大體可分為黑虎掌菌、黃鱗多孔菌(黃虎掌菌)、虎掌菌。在我國主要分布在四川、云南、甘肅等地。云南主要產地有楚雄、麗江等。因其采摘困難，且產量少，故較為珍貴。我國中醫認為虎掌菌是一味很好的中藥材，其性平味甘，有驅寒除濕、活血化瘀、益氣養陰、潤腸通便等功效。虎掌菌還可降低血液中膽固醇、防癌保健等。研究表明野生虎掌菌對小白鼠肉瘤180抑制率高達96.8％。同時現代醫學認為它可以提高人體免疫功能，低脂肪、低膽固醇、低熱值等優點使其成為天然減肥食品以及理想的保健食品之一。
精油，是從植物的花、葉、莖、根或果實中，通過水蒸氣蒸餾法、擠壓法、冷浸法或溶劑提取法提煉萃取的揮發性芳香物質。精油具有親脂性，很容易溶在油脂中。精油由萜烯類、醛類、酯類、醇類等化學分子組成。
超臨界流體萃取技術，是一項發展很快、應用很廣的實用性新技術，尤其是從天然動植物中提取一些有價值的生物活性物質，顯示出了巨大的優勢。即易于和產物分離，安全無毒，操作溫和不破壞有效成分。該技術現已成功用于啤酒花萃取，植物中香精油等風味物質的萃取，從動物油中萃取各種脂肪酸，從天然產物中萃取藥用成分，從土壤里面提取總烴，從土壤里面提取有機物等等。用超臨界流體萃取法萃取香料不僅可以有效地提取芳香組分，而且還可以提高產品純度，能保持其天然香味，如從桂花、茉莉花、菊花、梅花、米蘭花、玫瑰花中提取花香精，從胡椒、肉桂、薄荷中提取香辛料，從芹菜籽、生姜、莞姜籽、苗香、砂仁、八角、孜然等原料中提取精油，不僅可以用作調味香料，而且一些精油還具有較高的藥用價值。
目前，國內外還沒有公開任何關于利用虎掌菌進行精油提取的技術、以及開發一種具有抗氧化、清除亞硝、天然無污染的精油產品及應用的相關報道。
技術實現要素：
為解決上述技術問題，本發明提供一種風味獨特、萃取得率高、純度高無污染，而且具有抗氧化等功能的純天然虎掌菌精油的提取方法及其應用。
一種虎掌菌精油的提取方法，包括以下步驟：
(1)原料的制備：挑選無霉爛的干虎掌菌，將虎掌菌中的灰塵及其他雜志顆粒除去，選用高速萬能粉碎機進行粉碎，過40目篩，即得到虎掌菌粉，用電子天平進行稱重，真空包裝后備用；
(2)采用超臨界流體萃取法對虎掌菌粉進行萃取：
(3)萃取產物的接收：用50ml的棕色取樣品進行接收萃取產物，即得到虎掌菌精油，通過封口膜進行密封以防揮發。
優選的，步驟(2)中的萃取流程如下：
a、稱取虎掌菌粉裝入到設備的萃取釜中；
b、接通電源，依次設置萃取參數，萃取壓力25-35mpa、萃取溫度50-60℃、分離壓力5-10mpa及分離溫度20-30℃時，按照流程，打開萃取釜、各級分離器的加熱開關，同時打開制冷開關，調節各自溫控儀到指定值；
c、當冷凍機溫度將至5-8℃，且萃取釜、各級分離器的溫度接近設定值且穩定時，打開主泵，去除萃取分離系統內的空氣然后升壓至萃取壓力，通過調節萃取釜和分離器的高壓氣體節流閥，使各個釜達到設定值壓力且co2流量達接近設定值；
d、機器開始自動運行，一定時間后，得到萃取產物即虎掌菌精油；
e、關機，先將主泵關閉，再將萃取釜的進氣閥關閉，同時關閉各種加熱循環開關，再關閉總電源開關，待萃取釜內壓力與各級分離器等壓力平衡后，關閉分離器回路閥，打開放氣閥進行放氣卸壓。
優選的，所述的虎掌菌精油可以應用于火腿或者風味丸子。
優選的，所述的虎掌菌精油應用于火腿的方法，包括以下步驟：虎掌菌精油濃度為6-8％，均勻涂抹于肉制品表面，使其充分吸收，然后進行腌制風干晾曬，即可。
優選的，所述的虎掌菌精油應用于風味丸子的方法，包括以下步驟：將豬肉切丁放入斬拌機中斬拌，在斬拌過程中加入含有虎掌菌精油的輔料和斬拌助劑，將原料混勻并靜置后，放入模具定型，沸水中煮制，即可。
與現有技術相比本發明的有益效果為：本發明首次公開了一種食用菌即虎掌菌精油提取方法，包括原料的處理，采用超臨界流體萃取法對虎掌菌粉進行萃取，以及萃取產物的接收，最終得到一種香氣濃郁，顏色明亮，具有抗氧化和降低亞硝酸鈉活性功能的虎掌菌風味的精油。通過超臨界流體萃取技術得到的虎掌菌精油不同于傳統方法如溶劑提取法提取的精油，不含溶劑殘留，純度較高且品質好，香氣更加濃郁，可以作為新的防腐劑和天然調味劑，加入到肉制品或制成丸子，開發出新的產品。同時，因為虎掌菌具有抗氧化、提高免疫力等功效，虎掌菌精油也可作為保健品進行推廣。符合現代人所追求的綠色健康食品觀念，達到了有限資源高值利用。
具體實施方式
下面結合實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例1
一種虎掌菌精油的提取方法，包括以下步驟：
(1)原料的制備：挑選無霉爛的干虎掌菌，將虎掌菌中的灰塵及其他雜志顆粒除去，選用高速萬能粉碎機進行粉碎，過40目篩，即得到虎掌菌粉，用電子天平進行稱重，真空包裝后備用；
(2)超臨界流體萃取機器的萃取：
a、稱取800g的虎掌菌粉裝入到設備的萃取釜中
b、接通電源，依次設置萃取參數，萃取壓力30mpa、萃取溫度55℃、分離壓力8mpa及分離溫度25℃時，按照流程，打開萃取釜、各級分離器的加熱開關，同時打開制冷開關，調節各自溫控儀到指定值。
c、當冷凍機溫度將至6℃左右，且萃取釜、各級分離器的溫度接近設定值且穩定時，打開主泵，去除萃取分離系統內的空氣然后升壓至萃取壓力，通過調節萃取釜和分離器的高壓氣體節流閥，使各個釜達到設定值壓力且co2流量達接近設定值。
d、機器開始自動運行，一定時間后，得到萃取產物即虎掌菌精油。
e、關機，先將主泵關閉，再將萃取釜的進氣閥關閉，同時關閉各種加熱循環開關，再關閉總電源開關，待萃取釜內壓力與各級分離器等壓力平衡后，關閉分離器回路閥，打開放氣閥進行放氣卸壓。
(3)萃取產物的接收
用50ml的棕色取樣品進行接收萃取產物，即虎掌菌精油。通過封口膜進行密封以防揮發。
實施例2
一種虎掌菌精油的提取方法，包括以下步驟：
(1)原料的制備：挑選無霉爛的干虎掌菌，將虎掌菌中的灰塵及其他雜志顆粒除去，選用高速萬能粉碎機進行粉碎，過40目篩，即得到虎掌菌粉，用電子天平進行稱重，真空包裝后備用；
(2)超臨界流體萃取機器的萃取：
a、稱取800g的虎掌菌粉裝入到設備的萃取釜中
b、接通電源，依次設置萃取參數，萃取壓力35mpa、萃取溫度50℃、分離壓力10mpa及分離溫度20℃時，按照流程，打開萃取釜、各級分離器的加熱開關，同時打開制冷開關，調節各自溫控儀到指定值。
c、當冷凍機溫度將至8℃左右，且萃取釜、各級分離器的溫度接近設定值且穩定時，打開主泵，去除萃取分離系統內的空氣然后升壓至萃取壓力，通過調節萃取釜和分離器的高壓氣體節流閥，使各個釜達到設定值壓力且co2流量達接近設定值。
d、機器開始自動運行，一定時間后，得到萃取產物即虎掌菌精油。
e、關機，先將主泵關閉，再將萃取釜的進氣閥關閉，同時關閉各種加熱循環開關，再關閉總電源開關，待萃取釜內壓力與各級分離器等壓力平衡后，關閉分離器回路閥，打開放氣閥進行放氣卸壓。
(3)萃取產物的接收
用50ml的棕色取樣品進行接收萃取產物，即虎掌菌精油。通過封口膜進行密封以防揮發。
實施例3
一種虎掌菌精油的提取方法，包括以下步驟：
(1)原料的制備：挑選無霉爛的干虎掌菌，將虎掌菌中的灰塵及其他雜志顆粒除去，選用高速萬能粉碎機進行粉碎，過40目篩，即得到虎掌菌粉，用電子天平進行稱重，真空包裝后備用；
(2)超臨界流體萃取機器的萃取：
a、稱取800g的虎掌菌粉裝入到設備的萃取釜中
b、接通電源，依次設置萃取參數，萃取壓力25mpa、萃取溫度60℃、分離壓力6mpa及分離溫度30℃時，按照流程，打開萃取釜、各級分離器的加熱開關，同時打開制冷開關，調節各自溫控儀到指定值。
c、當冷凍機溫度將至5℃左右，且萃取釜、各級分離器的溫度接近設定值且穩定時，打開主泵，去除萃取分離系統內的空氣然后升壓至萃取壓力，通過調節萃取釜和分離器的高壓氣體節流閥，使各個釜達到設定值壓力且co2流量達接近設定值。
d、機器開始自動運行，一定時間后，得到萃取產物即虎掌菌精油。
e、關機，先將主泵關閉，再將萃取釜的進氣閥關閉，同時關閉各種加熱循環開關，再關閉總電源開關，待萃取釜內壓力與各級分離器等壓力平衡后，關閉分離器回路閥，打開放氣閥進行放氣卸壓。
(3)萃取產物的接收
用50ml的棕色取樣品進行接收萃取產物，即虎掌菌精油。通過封口膜進行密封以防揮發。
以下對實施例1的樣品進行檢測：
1、虎掌菌精油理化性質的測定
(1)色澤：以肉眼進行的感官色澤描述；
(2)相對密度：參照gb/t5526-1985比重瓶法測定；
(3)折光指數：參照gb/t5527-2010測定；
(4)酸值：參照gb/t5509.229-2016測定；
(5)過氧化值：參照gb/t5534-2008測定；
(6)皂化值：參照gb/t5509.227-2016測定；
實驗測得虎掌菌精油呈淺黃色，相對密度和折光指數均在國家食用油標準范圍之內，酸值3.2mgkoh/g，過氧化值為0.25meq/kg，皂化值高達185.5mgkoh/g，表明超臨界流體萃取條件適宜，各項理化指標均良好，得到的虎掌菌精油純度較高、品質好。
2、抗氧化能力指標測定
(1)清除dpph自由基：用無水乙醇配制質量濃度分別為20、50、100、150、200μg/ml的虎掌菌精油溶液，配制同樣質量濃度的vc溶液、bht溶液作為對照樣品溶液。取2ml樣品溶液和2ml濃度為0.2mmol/l的dpph溶液，混勻后室溫暗反應30min，以95％乙醇調零，測定517nm波長處的吸光度a樣品，同樣測定2ml樣品溶液與2ml95％乙醇混合后517nm波長處的吸光度a對照，再測定2mldpph溶液與2ml60％乙醇混合液在517nm波長處的吸光度a空白。
dpph清除率＝[1-(a樣品-a對照)/a空白]×100％
虎掌菌精油對dpph自由基具有一定的清除能力，vc、bht和虎掌菌精油清除dpph自由基的ic50分別為36、52、47μg/ml，可見樣品虎掌菌精油對dpph自由基清除能力總體強于bht，沒有vc清楚能力強，當虎掌菌精油質量濃度為0.012g/ml時對dpph自由基清除率達到81.13％。
(2)清除羥基自由基：用無水乙醇配制質量濃度分別為20、50、100、150、200μg/ml的虎掌菌精油溶液，配制同樣質量濃度的vc溶液、bht溶液作為對照樣品溶液。取樣品溶液2ml，依次加入1ml0.01mol/lfeso4、1.5ml10％h2o2溶液,混勻靜置10min，再加入2ml0.01mol/l水楊酸溶液，混勻后37℃的恒溫水浴鍋中反應30min，510nm波長處測其吸光度。分別以1.5ml蒸餾水代替雙氧水、2ml無水乙醇代替樣品同法測得的吸光度(重復3次)。
清除率＝a0-(a樣品-a1)/ao×100％
a0為空白對照液中的吸光度
a1為未加過氧化氫溶液樣品的吸光度
虎掌菌精油、vc、bht對羥自由基的清除能力均呈現明顯的量效關系，隨著質量濃度的增加清除羥自由基的清除能力增大；vc、bht和虎掌菌精油清除羥自由基的ic50分別為54、82、71μg/ml，可見虎掌菌精油對羥自由基的清除效果要明顯強于vc。當虎掌菌精油質量濃度為200μg/ml時對羥自由基的清除率達到了76％，要強于同質量濃度的bht，低于vc
(3)abts+清除能力測定：配制2mmol/labts溶液，吸取50mlabts溶液與200ml70mmol/lk2s2o8溶液混合，室溫避光放置12-16h后得到abts+溶液。用磷酸緩沖液ph7.0-7.2將abts+溶液稀釋至在734nm波長處吸光度為0.70±0.02。用無水乙醇配制質量濃度分別為20、50、100、150、200μg/ml的虎掌菌精油溶液，配制同樣質量濃度的vc溶液、bht溶液作為對照樣品溶液。取0.1ml樣品溶液，加入1.9mlabts+溶液，在734nm測其吸光度(重復3次)。
清除率＝(a0-a)/a0×100％
式中：a0為abts+溶液的吸光度；a為加虎掌菌精油溶液后的吸光度。
虎掌菌精油對abts+的清除作用與其質量濃度呈正相關，當虎掌菌精油質量濃度為200μg/ml時清除率達到83％，高于同質量濃度的bht(66％)，低于同質量濃度的vc(91％)；虎掌菌精油、bht和vc清除abts+的ic50分別為61、72、49μg/ml，可見虎掌菌精油對abts+的清除作用要強于bht低于vc。
虎掌菌精油體外抗氧化活性實驗表明虎掌菌精油對dpph自由基、abts+和羥自由基的ic50均高于bht低于vc，說明虎掌菌精油具有較強的體外抗氧化能力，雖然抗氧化作用效果不及vc，但可以添加到肉制品中在抗氧化的同時增加特殊的風味。
以下為應用實例：
應用例1
將本發明實施例1制備的虎掌菌精油加入到火腿中，其生產方法，按火腿重量計，用食鹽3.5％-5％，虎掌菌精油濃度為6％-8％組成佐料，步驟如下：
(1)火腿的腌制：先將備好的虎掌菌精油和食鹽按以上比例混合均勻成佐料，依據腌制的火腿重量取對應量的佐料，首先觀察，肉質厚的火腿按重量的8％取佐料，肉質薄的火腿按重量的5.5％取佐料，肉質相對處于中等厚度的火腿按重量，在5.5％-8％之間的適合數據取佐料；
(2)上佐料方法：分3次涂抹配好的佐料，每次均勻涂在火腿表面，立即揉搓，至佐料浸入火腿肉質中，再二次上佐料揉搓，之后上三次佐料揉搓，至直火腿肉質中浸出的水溢出在表面；
(3)堆疊腌制：堆疊腌制至少30天，期間五天翻堆一次，將堆疊中的火腿按上面的火腿翻堆在下層，中部的逐次往上移，使其中的水分擠壓外溢；
(4)吊掛風干：將堆疊30天以上的拆堆，逐只吊掛在通風的車間內風干，待風干至火腿,重量至少降低到鮮火腿重量的70％時，轉入發酵車間；
(5)發酵：上述步驟得到的風干火腿在發酵車間，按常規的火腿腌制工藝，要求相對濕度不超過72％，溫度13℃-16℃條件下發酵3個月后成為虎掌菌風味火腿。
將火腿與虎掌菌精油結合，利用虎掌菌特有的風味和防腐的功效，減少用鹽量，同時可以改善火腿的口感問題，突破傳統的火腿加工工藝，開發具有云南特色、野生菌和火腿相結合的產品，延長產業鏈條，促進火腿的發展。
應用例2
將本發明實施例1制備的虎掌菌精油應用于風味丸子，其加工方法，與實施例1基本相同，其區別在于：
(1)原料的選擇：選擇去除結締組織的豬后腿瘦肉、肥肉切成2×2×2厘米的肉丁待用；
(2)輔料的制備：將虎掌菌精油8％、50ml，壞血酸鈉0.2kg，甘草0.25kg，大蒜500g，料酒20g、五香粉20g、胡椒粉150g、鹽500g、糖少量、耗油制成輔料混合；
(3)斬拌助劑的制備：淀粉10kg，單硬脂酸甘油酯40g、蔗糖脂酸酯120g、改性大豆磷脂200g、硬脂酰乳酸鈉200g；
(4)將切好的瘦肉塊放入斬拌機內進行剁制，斬碎、5min后邊斬邊加入肥肉丁和斬拌助劑，2min后加入輔料，總共斬拌10min左右，將各種原料混勻，在4℃下靜置2h得到肉餡；
(5)模具上模：將斬拌后的肉泥放入丸子篩盤上，大小均勻一致，在沸水100℃時放入煮制，即可得到虎掌菌風味丸子。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護范圍。