(一)技術領域
本發明涉及一種賴氨酸分枝二聚多肽及其應用。
(二)
背景技術:
自20世紀90年代從酵母蛋白中發現了自組裝多肽以來,自組裝多肽領域的研究得到了快速的發展,并已成功應用于生物技術、納米材料、細胞工程、藥物控釋等領域(uspatentno.5670483,1997;no.5955343,1999;no.20020160471,2002;no.6548630,2003)。從天然蛋白衍生的自組裝多肽都是利用l型氨基酸進行分子自組裝,具有較好的生物相容性,能夠被l型生物酶降解。
公開號為cn101054409a的中國專利申請公開了一種兩親型短肽,此短肽命名為d-eak,是用d型氨基酸構建的自組裝短肽。d型氨基酸的自組裝短肽,它一般不能被常規l型酶降解,體內穩定存在的時間相對較長。實驗表明,d-eak短肽可在制備溫控型、酸堿性分子器件或者生物分子探針中應用,可在制備保濕鎖水劑中應用,可在細胞培養中應用,可在制備抑菌藥物中應用。實驗還表明,d-eak短肽形成的納米纖維較短,使其的應用范圍受到一定的限制。
公開號為cn101337985a的中國專利申請公開了另一種兩親型d自組裝多肽,命名為d-rad16。實驗表明,d-rad16自組裝多肽形成的水凝膠可在制備保濕鎖水劑中應用并對創傷有快速止血功能,可以通過添加藥學上可接受的載體或者賦形劑制備成適合于臨床使用的止血藥物。d-rad16自組裝多肽形成的納米纖維支架支持多種細胞的生長,可作為細胞的三維培養基質材料,為新藥研發提供一種可模擬體內環境的藥物篩選模式。但是d型氨基酸的自組裝短肽一般不能被常規l型酶降解,生物相容性較差,臨床應用風險大。
(三)
技術實現要素:
本發明目的是提供一種新型的兩親型自組裝多肽。通過賴氨酸分枝形成的二聚多肽,其分子間通過非共價鍵相互作用自發組合,由此而形成的自組裝結構有更多的結構靈活性和多樣性,促進自組裝多肽在納米生物醫學中的應用。
本發明采用的技術方案是:
本發明提供一種式(1)所示賴氨酸分枝二聚多肽:
式(1)中,peptide1(多肽1)和peptide2(多肽2)均為8-20個氨基酸組成的多肽。peptide1通過氨基酸序列c-端的羧基與賴氨酸ε-氨基形成酰胺鍵,peptide2通過氨基酸序列c-端的羧基與賴氨酸α-氨基形成酰胺鍵。所述peptide1,peptide2的n-端可以連接任何一種天然氨基酸,小分子修飾或者乙酰化封端。
進一步,所述peptide1和peptide2各自獨立為下列之一:(1)(aa+aanaa-aan)n;(2)(aa-aanaa+aan)n;(3)(aanaa+aanaa-)n;(4)(aanaa-aanaa+)n,其中,aa+為精氨酸或賴氨酸;aa-為天門冬氨酸或谷氨酸;aan丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸,n為2-5之間的任意正整數。
進一步,所述peptide1和peptide2的氨基酸序列相同。
進一步,所述賴氨酸分枝二聚多肽為下列之一:
(1)
氨基酸序列為:(acradaradarada)2k-nh2;
(2)
氨基酸序列為:(acakaeakaeakaea)2k-nh2;
(3)
氨基酸序列為:(aceikieikieiki)2k-nh2;
(4)
氨基酸序列為:aceikieikieiki-k(acradaradarada)-nh2;
其中ac為乙酰化封端。
本發明所述賴氨酸分枝形成的二聚多肽按如下方法制備:采用fmoc氨基樹脂和氨基酸以逐步偶聯的fmoc固相多肽合成法(fmocspps)進行合成:從fmoc氨基樹脂首先連接fmoc-lys(fmoc)-oh或者fmoc-lys(dde)-oh,然后去除保護基和相應的氨基酸逐步偶聯進行合成。經過切割反應及反相制備色譜純化,凍干得到賴氨酸分枝二聚多肽。
通過賴氨酸分枝形成的二聚多肽作為自組裝多肽,其原理是分子間通過非共價鍵相互作用自發組合形成一種結構靈活、構造穩定、具有某些理化性能的分子聚集體或超分子納米結構。由于多肽1、多肽2與賴氨酸通過共價單鍵相連,多肽1和多肽2可以形成直鍵狀的二聚多肽或者任意角度的三維立體結構。由此而形成的自組裝結構有更多的結構靈活性和多樣性。
本發明還提供一種所述賴氨酸分枝二聚多肽在制備納米纖維水凝膠中的應用。本發明通過賴氨酸分枝二聚多肽作為自組裝多肽,在鹽離子、細胞培養基等生理環境下能自組裝形成納米纖維水凝膠,可在制備納米阻隔材料中應用。
本發明提供一種所述賴氨酸分枝二聚多肽在制備鎖水保濕劑中的應用。本分明所述的賴氨酸分枝二聚多肽能形成非常優良的水凝膠,肽與水的質量比可以低于1:99,因此這種賴氨酸分枝二聚肽是一種高效的鎖水性物質,可在制備鎖水保濕劑中應用。
本發明提供一種所述賴氨酸分枝二聚多肽在制備止血藥物中的應用。本發明所述的賴氨酸分枝二聚多肽對創傷有快速止血功能,可制備成適合于臨床使用的快速止血藥物。
本發明中一些常用的縮寫及術語具有以下含義:
fmoc:芴甲氧羰基
tbu:叔丁基
hobt:1-羥基苯并三氮唑
dic:n,n'-二異丙基碳二亞胺
tfa:三氟醋酸
meoh:甲醇
spps:固相多肽合成法
本發明室溫是指20-30℃。
與現有技術相比,本發明的有益效果主要體現在:目前文獻報道的自組裝多肽均為單一直鏈的多肽分子。本發明提供了一種新型的兩親型自組裝多肽,通過賴氨酸分枝形成的二聚多肽,其分子間通過非共價鍵相互作用自發組合,由此而形成的自組裝結構有更多的結構靈活性和多樣性,促進自組裝多肽在納米生物醫學中的應用。本發明賴氨酸分枝二聚多肽在鹽離子、細胞培養基等生理環境下能自組裝形成納米纖維水凝膠,可在制備納米阻隔材料中應用,是一種高效的鎖水性物質,可在制備鎖水保濕劑中應用;對創傷有快速止血功能,可制備成適合于臨床使用的快速止血藥物。
(四)附圖說明
圖1:實施例1制備的賴氨酸分枝二聚多肽的高效液相色譜(hplc)檢測。
圖2:實施例1制備的賴氨酸分枝二聚多肽的質譜檢測。
圖3:肝臟創傷出血模型(氯化鈉注射液參照)。
圖4:肝臟創傷出血模型(1%賴氨酸分枝二聚多肽(實施例1制備)溶液供試品)。
圖5:股四頭肌出血模型(氯化鈉注射液參照)。
圖6:股四頭肌出血模型(1%賴氨酸分枝二聚多肽(實施例1制備)溶液供試品)。
(五)具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述,但本發明的保護范圍并不僅限于此:
實施例1賴氨酸分枝二聚多肽1的制備
1、材料
fmoc-rinkamidembharesin(笏甲氧羰基-rink酰胺樹脂,購自chem-impexinternational,inc.catalog#06752)
fmoc-lys(fmoc)-oh(笏甲氧羰基-ε-笏甲氧羰基-賴氨酸)
fmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸)
fmoc-asp(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-天冬氨酸)
fmoc-arg(pbf)-oh(笏甲氧羰基-γ-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基-精氨酸)
hobt(1-羥基苯并三氮唑)
dic(n,n-二異丙基碳二亞胺)
2、具體合成步驟:
所述多肽的合成采用從fmoc氨基樹脂和氨基酸以逐步偶聯的固相多肽合成法進行,工藝步驟如下:
步驟1.fmoc-rinkamidembha樹脂(8mmol,20g,取代度0.4mmol/g)置于一多肽合成反應器中,用n,n-二甲基甲酰胺(300ml)溶脹30分鐘。懸浮液過濾,去除濾液,將體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺(300ml)加入到樹脂中并攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,準備用于步驟2偶聯。
步驟2.將11.2gfmoc-lys(fmoc)-oh(笏甲氧羰基-ε-笏甲氧羰基-賴氨酸),3.67g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和3.79mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中,使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后,將溶液加入到步驟1含有肽樹脂的多肽合成反應器中,室溫下偶聯反應1-4個小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將反應液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹脂。然后肽樹脂在體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,去除洗滌液,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,并準備用于步驟3偶聯。
步驟3.將14.9gfmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸),7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中,使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后,將溶液加入到步驟2含有肽樹脂的多肽合成反應器中,室溫下偶聯反應1-4個小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將反應液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹脂。然后肽樹脂在體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,并準備用于步驟4偶聯。
步驟4.將19.7gfmoc-asp(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-天冬氨酸),7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中,使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后,將溶液加入到步驟3含有肽樹脂的反應器中,室溫下偶聯反應1-4個小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將反應液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹脂。然后肽樹脂在體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,并準備用于步驟5偶聯。
步驟5.將14.9gfmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸),7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中,使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后,將溶液加入到步驟4含有肽樹脂的反應器中,室溫下偶聯反應1-4個小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將反應液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹脂。然后肽樹脂在體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,并準備用于步驟6偶聯。
步驟6.將31.1gfmoc-arg(pbf)-oh(笏甲氧羰基-γ-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基-精氨酸),7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中,使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后,將溶液加入到步驟5含有肽樹脂的反應器中,室溫下偶聯反應1-4個小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將反應液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹脂。然后肽樹脂在體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,并準備用于步驟7偶聯。
步驟7.將14.9gfmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸),7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中,使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后,將溶液加入到步驟6含有肽樹脂的反應器中,室溫下偶聯反應1-4個小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將樹脂懸浮液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹脂。然后肽樹脂在體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,并準備用于步驟8偶聯。
步驟8.將19.7gfmoc-asp(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-天冬氨酸),7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中,使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后,將溶液加入到步驟7含有肽樹脂的反應器中,室溫下偶聯反應1-4個小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將樹脂懸浮液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹脂。然后肽樹脂在體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,并準備用于步驟9偶聯。
步驟9.將14.9gfmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸),7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中,使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后,將溶液加入到步驟8含有的肽樹脂的反應器中,室溫下偶聯反應1-4個小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將樹脂懸浮液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹脂。然后肽樹脂在體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,并準備用于步驟10偶聯。
步驟10.將31.1gfmoc-arg(pbf)-oh(笏甲氧羰基-γ-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基-精氨酸),7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中,使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后,將溶液加入到步驟9含有肽樹脂的反應器中,室溫下偶聯反應1-4個小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將樹脂懸浮液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹脂。然后肽樹脂在體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,并準備用于步驟11偶聯。
步驟11.將14.9gfmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸),7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中,使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后,將溶液加入到步驟10含有肽樹脂的反應器中,室溫下偶聯反應1-4個小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將樹脂懸浮液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹脂。然后肽樹脂在體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,并準備用于步驟12偶聯。
步驟12.將19.7gfmoc-asp(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-天冬氨酸),7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中,使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后,將溶液加入到步驟11含有肽樹脂的反應器中,室溫下偶聯反應1-4個小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將樹脂懸浮液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹脂。然后肽樹脂在體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,并準備用于步驟13偶聯。
步驟13.將14.9gfmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸),7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中,使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后,將溶液加入到步驟12含有肽樹脂的反應器中,室溫下偶聯反應1-4個小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將樹脂懸浮液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹脂。然后肽樹脂在體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,并準備用于步驟14偶聯。
步驟14.將31.1gfmoc-arg(pbf)-oh(笏甲氧羰基-γ-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基-精氨酸),7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中,使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后,將溶液加入到步驟13含有肽樹脂的反應器中,室溫下偶聯反應1-4個小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將樹脂懸浮液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹脂。然后肽樹脂在體積濃度20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護基。fmoc去保護后,將樹脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌,將洗滌后的肽樹脂置于多肽合成反應器中,并準備用于步驟15偶聯。
步驟15.將體積濃度10%醋酸酐/5%n-甲基嗎啉/85%n,n-二甲基甲酰胺溶液(300ml)加入到步驟14含有肽樹脂的反應器中進行多肽乙酰化封端,室溫下偶聯反應0.5-1小時,或直至茚三酮檢測結果為陰性。將樹脂懸浮液過濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌五次,甲醇洗滌兩次。室溫真空下干燥后,得到肽樹脂。
將所得的肽樹脂懸浮在三氟醋酸切割液中,在室溫(25℃)下攪絆反應2-5小時。過濾后,收集濾液并在乙醚中沉淀。將粗肽離心收集,用乙醚洗滌,并在室溫真空下干燥,得到多肽粗品。經高效制備液相色譜純化,冷凍干燥即得式(1)所示的賴氨酸分枝二聚多肽(acradaradarada)2k-nh2)。高效液相色譜(hplc)檢測,結果見圖1,根據圖1中的譜峰面積確定其純度達到了95%。質譜檢測結果見圖2,根據檢測結果可確定其分子量為2709.8。
高效液相色譜(hplc)檢測:美國安捷倫公司agilent1200型高效液相色譜儀。采用水和乙腈混合溶劑作流動相,c18分析色譜柱進行反相色譜檢測。
質譜檢測:美國熱電公司tsq型質譜儀,esi電噴霧電離離子源。
實施例2賴氨酸分枝二聚多肽2
實施例2多肽的合成采用和實施例1相同的固相多肽合成法方法,從fmoc氨基樹脂首先連接fmoc-lys(fmoc)-oh,然后去除fmoc保護基和相應的氨基酸逐步偶聯進行合成,經過相同的切割反應及反相制備色譜純化,凍干得到賴氨酸分枝二聚多肽2。所采用的樹脂、氨基酸原料、偶聯試劑如下:
fmoc-rinkamidembharesin(笏甲氧羰基-rink酰胺樹脂,購自chem-impexinternational,inc.catalog#06752)
fmoc-lys(fmoc)-oh(笏甲氧羰基-ε-笏甲氧羰基-賴氨酸)
fmoc-lys(boc)-oh(笏甲氧羰基-ε-叔丁氧羰基-賴氨酸)
fmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸)
fmoc-glu(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-谷氨酸)
hobt(1-羥基苯并三氮唑)
dic(n,n-二異丙基碳二亞胺)。
實施例3賴氨酸分枝二聚多肽3
實施例3多肽的合成采用和實施例1相同的固相多肽合成方法,從fmoc氨基樹脂首先連接fmoc-lys(fmoc)-oh,然后去除fmoc保護基和相應的氨基酸逐步偶聯進行合成,經過相同的切割反應及反相制備色譜純化,凍干得到賴氨酸分枝二聚多肽3。所采用的樹脂、氨基酸原料、偶聯試劑如下:
fmoc-rinkamidembharesin(笏甲氧羰基-rink酰胺樹脂,購自chem-impexinternational,inc.catalog#06752)
fmoc-lys(fmoc)-oh(笏甲氧羰基-ε-笏甲氧羰基-賴氨酸)
fmoc-lys(boc)-oh(笏甲氧羰基-ε-叔丁氧羰基-賴氨酸)
fmoc-ile-oh(笏甲氧羰基-異亮氨酸)
fmoc-glu(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-谷氨酸)
hobt(1-羥基苯并三氮唑)
dic(n,n-二異丙基碳二亞胺)。
實施例4賴氨酸分枝二聚多肽4
實施例4多肽的合成采用和實施例1相同的固相多肽合成方法,從fmoc氨基樹脂首先連接fmoc-lys(dde)-oh,然后去除fmoc保護基和相應的氨基酸的逐步偶聯進行合成。在樹脂上首先完成aceikieikieiki的連接后,用2%水合并肼的dmf溶液攪拌脫去賴氨酸側鏈氨基上的dde保護基,然后再逐個偶聯相應的氨基酸完成acradaradarada的連接。經過相同的切割反應及反相制備色譜純化,凍干得到賴氨酸分枝二聚多肽4。所采用的樹脂、氨基酸原料、偶聯試劑如下:
fmoc-rinkamidembharesin(笏甲氧羰基-rink酰胺樹脂,購自chem-impexinternational,inc.catalog#06752
fmoc-lys(dde)-oh(笏甲氧羰基-ε-dde-賴氨酸)
fmoc-lys(boc)-oh(笏甲氧羰基-ε-叔丁氧羰基-賴氨酸)
fmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸)
fmoc-ile-oh(笏甲氧羰基-異亮氨酸)
fmoc-asp(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-天冬氨酸)
fmoc-glu(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-谷氨酸)
fmoc-arg(pbf)-oh(笏甲氧羰基-γ-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基-精氨酸)
hobt(1-羥基苯并三氮唑)
dic(n,n-二異丙基碳二亞胺)。
實施例5賴氨酸分枝二聚肽不同條件下形成水凝膠及其鎖水性能
1、在不同鹽作用下形成水凝膠
(1)將實施例1所得賴氨酸分枝二聚肽1用18.2mω·cm的純凈水制備成質量濃度為1%的賴氨酸分枝二聚多肽溶液。
(2)稱取氯化鈉或氯化鉀或磷酸鈉加入到純凈水中配制成0.15mol/l鹽溶液,鹽溶液的濃度范圍在0.01-1mol/l皆可。
(3)加入等體積的鹽溶液到賴氨酸分枝二聚多肽溶液中,自組裝時間24小時。同樣條件下,將實施例2-4制備的賴氨酸分枝二聚肽替換賴氨酸分枝二聚肽1進行實驗,結果表明,實施例1-4制備的賴氨酸分枝二聚肽均能形成水凝膠,在肉眼下為透明膠體。
2、賴氨酸分枝二聚肽在細胞生長的生理環境下形成水凝膠
(1)取含10%胎牛血清的dmem培養基滴入96孔板,每孔100μl。
(2)將實施例1所得賴氨酸分枝二聚肽1用18.2mω·cm的純凈水制備成質量濃度為1%的賴氨酸分枝二聚多肽溶液,取100μl加入步驟(1)的96孔板中,并快速混勻;
(3)置于37攝氏度,5%體積比的培養箱中培養24小時。同樣條件下,將實施例2-4制備的賴氨酸分枝二聚肽替換賴氨酸分枝二聚肽1進行實驗,結果表明,實施例1-4制備的賴氨酸分枝二聚肽均能形成水凝膠,在肉眼下為透明膠體。
3、鎖水性能
取10mg實施例1制備的賴氨酸分枝二聚多肽1溶于1ml18.2mω·cm的純凈水中,可形成穩定水凝膠,其中多肽與水的質量比為1:99,因此是一種高效的鎖水性物質。
同樣條件下,實施例2-4制備的賴氨酸分枝二聚多肽替換賴氨酸分枝二聚肽1進行實驗,結果表明,實施例1-4制備的賴氨酸分枝二聚肽均能形成穩定的水凝膠。
實施例6:賴氨酸分枝二聚肽對大鼠肝創傷出血以及股四頭肌損傷出血的止血效果
1、供試品
由實施例1所得賴氨酸分枝二聚肽1
2、對照品
名稱:氯化鈉注射液
規格:250ml:2.25g
3、溶媒及供試品配制方法
溶媒名稱:超純水,現制現用
溶媒質量要求:取水時電阻率為18.2mω·cm
供試品溶液:精密稱取供試品50mg,用移液器加入5ml超純水,配制成質量濃度為1%的賴氨酸分枝二聚多肽溶液。
4、實驗動物
大鼠,crl:cd(sd),spf級
體重范圍:250-400g
周齡:約10-12周
來源:北京維通利華實驗動物技術有限公司
5、動物實驗方法
大鼠以3%戊巴比妥鈉溶液(45mg/kg)腹腔注射麻醉。
肝臟創傷出血造模:腹部近劍突部位剃毛,消毒后用剪刀在手術區域切開腹部,暴露肝臟。用10號手術刀在肝臟左葉做一字型切口,切口長約1cm,深約0.5cm,造成肝臟創傷出血模型。
股四頭肌損傷出血造模:大鼠右側股四頭肌剃毛,消毒后用剪刀在手術區域切開皮膚,分離皮膚和肌肉,暴露股四頭肌(外側頭部分)。用10號手術刀沿股骨下緣在股四頭肌上做一字型接口,切口長約2cm,深約1cm,切口以切破股靜脈為限,造成股四頭肌損傷出血模型。
給藥:切開創口后,迅速將供試品溶液或氯化鈉注射液均勻涂敷于創口處,用于創口出血控制。給藥后,計時器記錄完全止血時間。完全止血時間以靜置狀態下創口不再滲血為限。
本動物試驗選擇肝臟創傷出血模型和股四頭肌出血模型作為供試品(由實施例1所得賴氨酸分枝二聚肽1)的止血效果探索,同時選用氯化鈉注射液作為對照。試驗結果表明,質量濃度為1%的賴氨酸分枝二聚多肽溶液在肝臟創傷出血模型和股四頭肌出血模型中均有快速止血效果,完全止血時間均少于10秒,止血時間短。氯化鈉注射液參照組出血時間均大于150秒。
同樣條件下,將實施例1所得賴氨酸分枝二聚肽1分別替換為實施例2-4制備的賴氨酸分枝二聚肽,試驗結果表明,質量濃度為1%的賴氨酸分枝二聚多肽溶液在肝臟創傷出血模型和股四頭肌出血模型中均有快速止血效果,完全止血時間均少于10秒,止血時間短。氯化鈉注射液參照組出血時間均大于150秒。
因此,本發明所述的賴氨酸分枝二聚多肽對創傷有快速止血功能,可制備成適合于臨床使用的快速止血藥物。