HER2/neu?特異性抗體和其使用方法與流程
本申請是pct申請號為pct/us2009/038201，發明名稱為“her2/neu-特異性抗體和其使用方法”的pct申請進入中國國家階段后申請號為200980119403.5的中國國家階段申請的分案申請。
相關申請的交叉引用
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序列表的引用：
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發明背景
發明領域
本申請涉及特異性結合her2/neu的新穎4d5抗體，尤其是her2/neu的新穎嵌合4d5抗體，所述新穎4d5抗體與已知的4d5抗體相比具有減少的糖基化和改變的效應子功能。本發明還涉及抗體和包含它們的組合物用于下列疾病的診斷、預后和治療的方法：例如，癌癥、自身免疫疾病、炎性疾患和傳染病。
相關技術說明
her2/neu和her2/neu受體
細胞生長和分化過程涉及生長因子，生長因子通過特異性受體如酪氨酸激酶發揮它們的作用。配體與酪氨酸激酶受體的結合觸發最終導致細胞增殖和分化的事件級聯。(carpenter等人(1979)biochem.48:193-216；sachs等人(1987)cancerres.47:1981-8196)。酪氨酸激酶受體根據它們的序列相似性和不同特征可以分為幾組。一種這類家族是erbb或表皮生長因子受體家族，該家族包括多種受體，它們稱為her-1(也稱為erbb-1或egfr)、her-2或her2/neu(也稱為erbb-2、c-neu或p185)、her-3(也稱為erbb-3)和her-4(也稱為erbb-4)。(參見，例如，carpenter等人,如上；semba等人(1985)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)82:6497-6501；coussens等人(1985)science,230:1130-1139,bargmann等人(1986)cell45:649-657；kraus等人(1989)pnas86:9193-9197；carraway等人(1994)j.biol.chem.269:14303-14306；和plowman等人(1993)nature366:473-475；tzahar等人(1994)biol.chem.269:25226-25233)。
在正常發育過程和人腫瘤發生二者中erbb受體在傳播調節細胞增殖、分化、遷移和凋亡的信號中起重要作用。(slamon等人(1989)science244:707-712)。例如，erbb受體的激活偶聯并刺激下游mapk-erk1/2和磷酸肌醇-3-激酶(pi3k)/akt生長和存活途徑。在癌癥中這些途徑的失調與疾病進展和治療不應性相聯系。(fukazawa等人(1996)j.biol.chem.271:14554-14559；tzahar等人(1996)mol.cell.biol.16:5276-5287；lange等人(1998)j.biol.chem.273:31308-31316；olayioye等人(1998)mol.cell.biol.18:5042-5051；hackel等人(1999)curr.opin.cellbiol.11:184-189)。pi3k/akt的激活促進細胞存活和腫瘤侵襲性增強，并且據報道在過表達her2/neu的乳癌中akt2被激活并過表達。(shak(1999)semin.oncol.suppl12:71-77；huang等人(2000)clinicalcancerres.7:2166-2174；bacus等人(2002)oncogene21:3532-3540)。
受體erbb家族的信號傳導由配體結合啟動，配體結合觸發同源或異源受體二聚化、胞質尾部的相互酪氨酸磷酸化和胞內信號轉導途徑的激活。(citri等人(2003)exp.cellres.284:54)。結合并激活erbb受體的配體的有效性是由多種金屬蛋白酶介導的，如催化特異性蛋白的細胞表面胞外域脫落的adam(解聯蛋白和金屬蛋白酶)家族的鋅依賴性金屬蛋白酶。(參見chang和werb(2001)trendsincellbiology11:537-543；moss和lambert(2002)essaysinbiochemistry38:141-153；seals和courtneidge(2003)genesanddevelopment17:7-30)。具體地，據顯示adam家族切割負責激活erbb受體的配體，例如app和notch。(blobel(2005)nat.rev.mol.cell.biol.6:32-43)。
erbb家族的一個重要成員her2/neu是185kda的受體蛋白，它最初是作為來自化學處理的大鼠的神經母細胞瘤的轉化基因的產物鑒定的。her2/neu由于其在幾種人的癌中和在哺乳動物發育中的作用而被廣泛地研究。(hynes和stern(1994)biochim.etbiophys.acta1198:165-184；和dougall等人(1994)oncogene9:2109-2123；lee等人(1995)nature378:394-398)。人her2/neu基因和her2/neu蛋白描述于semba等人(1985)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)82:6497-6501和yamamoto等人(1986)nature319:230-234中并且其序列可以在genbank中以登錄號x03363獲得。her2/neu包含四個結構域：配體結合的胞外結構域；親脂的跨膜結構域；保守的胞內酪氨酸激酶結構域；和羧基端信號傳導結構域，該結構域具有可以被磷酸化的幾個酪氨酸殘基。(plowman等人(1993)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)90:1746-1750)。her2/neu胞外(ecd)結構域的序列由franklin等人(2004)cancercell.5(4):317-328描述，并且可以在蛋白數據庫記錄(proteindatabankrecord)1s78(2004)中獲得。
her2/neu充當生長因子受體并且通常由諸如乳癌、卵巢癌和肺癌等腫瘤表達。her2/neu在25-30％的人乳癌和卵巢癌中過表達，并且與這些患者中的侵襲性臨床進展或弱的預后相關。(slamon等人(1987)science235；177-182；slamon等人(1989)science244:707-712)。已在其他癌中觀察到her2/neu的過表達，所述其他癌癥包括：胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌和膀胱癌。(參見，例如king等人(1985)science229:974；mccann等人(1990)cancer65:88-92；yonemura等人(1991)cancerresearch51:1034)。
her2/neu的激活與在乳癌患者中對激素治療的臨床反應性降低相關。(wright等人(1989)cancerres.49:2087-2090；kurokawa&arteaga(2001)clin.cancerres.7:4436s-42s,4411s-4412s)。實際上，her2/neu表達足以傳達抗雌激素抗性。(benz等人(1993)breastcancerres.treat.24:85-95)。her2/neu和her-3似乎還參與了前列腺癌患者中激素抗性的發病。大約三分之一的前列腺癌患者接受以破壞睪丸和腎上腺雄激素為目的的激素治療。對于乳癌，抗性是不可避免的。最近的數據表明，由her2/neu和her-3所發出的信號誘導“激素-不應”狀態。(mellinghoff等人(2004)cancercell6:517-527)。
已經知道幾種截斷和剪接形式的her2/neu。例如，位于一些胃癌細胞的核周胞質的截斷ecd是通過使用內含子中的多聚腺苷酸化信號產生的替代性轉錄物來制備的。(yamamoto等人(1986)nature319:230-234；和scott等人(1993)mol.cell.biol.13:2247-2257)。還沒有可歸因于這種截短ecd多肽的具體治療、診斷或研究效用。her2/neu的ecd還可以以蛋白水解的方式從培養的乳癌細胞脫落，并且它出現在一些癌癥患者的血清中，此時它可以是轉移性乳癌的和總體差預后的血清標記物。(petch等人(1990)mol.cell.biol.10:2973-2982；leitzel等人(1992)j.clin.oncol.10:1436-1443；scott等人(1993)mol.cell.biol.13:2247-2257；和lee和maihle(1998)oncogene16:3243-3252)。在一些過表達her2/neu的腫瘤細胞中，熟知的金屬蛋白酶激活劑乙酸4-氨基苯汞(apma)激活諸如adam10和adam15等金屬蛋白酶以將her2/neu受體切割成兩部分：截斷的膜結合受體，稱為p95；和可溶性ecd，稱為p105或ecd105。(參見，例如，molina等人(2001)cancerres.61:4744-4749；美國專利公布第2004/0247602號)。ecd的丟失使得p95受體成為組成型活性的酪氨酸激酶，該組成型活性的酪氨酸激酶可以遞送生長和存活信號給癌細胞。(參見，例如，美國專利第6,541,214號)。
研究已顯示在過表達her2/neu的乳癌細胞中，用her2/neu特異性抗體與化療劑(例如，順鉑、阿霉素(doxoubicin)、紫杉醇)組合治療引發了比用單獨的化療劑治療更高的細胞毒性反應。(hancock等人(1991)cancerres.51:4575-4580；arteaga等人(1994)cancer54:3758-3765；pietras等人(1994)oncogene9:1829-1838)。her2/neu抗體可以增強對化療劑的反應的一個可能機制是通過her2/neu蛋白表達的調控或通過dna修復的干擾。(stancovski等人(1991)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)88:8691-8695；bacus等人(1992)cellgrowth&diff.3:401-411；bacus等人(1993)cancerres.53:5251-5261；klapper等人(1997)oncogene14:2099-2109；klapper等人(2000)cancerres.60:3384-3388；arteaga等人(2001)jclinicaloncology19(18s):32s-40s)。
已經開發了靶向her-1或her2/neu的大量單克隆抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑。例如，稱為4d5的鼠單克隆抗體識別與跨膜區極為接近的her2/neu富半胱氨酸結構域ii中的胞外表位(氨基酸529至627)。如通過受體磷酸化測定所測量的，用4d5進行的乳癌細胞治療部分阻斷her2/neu-her-3復合體的ndf/heregulin激活。(carter等人(1992)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)89:4285-4289；sliwkowski等人(1999)sem.inoncol.26:60-70；ye等人(1999)oncogene18:731-738；vogel等人(2001)oncology61(增刊2):37-42；vogel等人(2002)journalofclinicaloncology20(3):719-726；fujimoto-ouchi等人(2002)cancerchemother.pharmacol.49:211-216)。然而，給人施用4d5是臨床上失敗的，因為患者會迅速地出現hama反應，因此開發了人源化形式。人源化抗體4d5的序列和晶體結構已在美國專利第6,054,297號；carter等人，如上；和eigenbrot等人(1993)j.mol.biol.229:969-95中描述。
開發了稱為曲妥單抗(由genentech,inc.以
因此，仍然存在對于用于癌癥治療的新的或改進形式的her2/neu抗體的需求，例如具有增加的親和力或特異性、降低的hama或haha反應的可能、改變的效應子功能和類似特征的4d5抗體。
fc受體
抗體-抗原復合體與免疫系統的細胞的相互作用導致了廣泛的一系列的反應，其范圍從效應子功能如抗體依賴性細胞毒性、肥大細胞脫顆粒和吞噬作用到免疫調節信號，如調節淋巴細胞增殖和抗體分泌。所有這些相互作用均是通過抗體的fc結構域或免疫復合體與fc受體的結合啟動的，fc受體是造血細胞上的特化的細胞表面受體。由抗體和免疫復合體所觸發的細胞反應的多樣性是由fc受體的結構不均一性產生的。fc受體共同擁有結構上相關的配體結合結構域，該結構域大概介導細胞內信號傳導。
免疫球蛋白基因超家族的蛋白成員fc受體是可以結合免疫球蛋白分子的fc部分的表面糖蛋白。該家族的每個成員通過fc受體的α鏈上的識別結構域識別一種或多種同種型的免疫球蛋白。fc受體是由他們對免疫球蛋白亞型的特異性定義的。igg的fc受體稱為“fcγr”，ige的fc受體稱為“fεr”并且iga的fc受體稱為“fcαr”。不同的佐細胞擁有不同同種型抗體的fc受體，并且抗體的同種型決定了哪些佐細胞將參與給定的反應(billadeau等人(2002)j.clin.investigat.2(109):161-81；gerber等人(2001)microbesinfection3:131-139；ravetch等人(2001)annu.rev.immunol.19:275-90；ravetch等人(2000)science290:84-89；ravetch(1994)cell78(4):553-560；ravetch等人(1991)annu.rev.immunol.9:457-492；還參見，immunobiology:theimmunesysteminhealthanddisease(免疫生物學：健康與疾病中的免疫系統)(第4版，1999年),elsevierscienceltd/garlandpublishing,newyork)。各種受體的總括呈現在表1中。
每個fcγ受體(“fcγr”)是整合膜糖蛋白，具有與c2-set免疫球蛋白相關結構域相關的胞外結構域、單個跨膜結構域和長度可變的胞質內結構域。有四種已知的fcγr，它們稱為fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)、fcγriii(cd16)和fcγriv。受體由不同的基因編碼；然而，家族成員之間的廣泛同源性表明它們可能通過基因復制由共同的祖先產生。
激活和抑制信號二者都是在接合之后通過fcγr轉導的。這些完全相反的功能是由不同受體亞型之間的結構差異引起的。受體的胞質信號傳導結構域內的兩種不同的結構域負責不同的反應，這兩種不同的結構域稱為基于免疫受體酪氨酸的激活基序(itam)或基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(itim)。不同的胞質酶向這些結構的募集指示fcγr-介導的細胞反應的結果。含itam的fcγr復合體包括fcγri、fcγriia、fcγriiia和fcγriv，而含itim的復合體僅包括fcγriib。
fcγri表現出對抗體恒定區的高親和力和有限的同種型特異性(hulett和hogarth(1994)advimmunol57:1-127)。fcγrii蛋白是40kda的整合膜糖蛋白，它由于對單體ig的低親和力(106m-1)而只結合復合的igg。這種受體是表達最廣泛的fcγr，它存在于所有造血細胞上，包括單核細胞、巨噬細胞、b細胞、nk細胞、嗜中性粒細胞、肥大細胞和血小板。fcγrii在其免疫球蛋白結合鏈上僅具有兩個免疫球蛋白樣區，因此與fcγri相比，它對igg的親和力低得多。有三種已知的人fcγrii基因(fcγrii-a、fcγrii-b、fcγrii-c)，它們全部都與igg結合成igg聚集體或免疫復合體。人嗜中性粒細胞表達fcγriia基因。fcγriib基因在b淋巴細胞上表達；它的胞外結構域與fcγriia96％相同并且以不能辨別的方式結合igg復合體。
fcγrii-a與fcγrii-b的胞質結構域內的明顯不同產生了對受體接合的兩種功能上不均一的反應。fcγrii-a亞型啟動導致細胞激活的細胞內信號傳導，如吞噬作用和呼吸爆發，而fcγrii-b亞型啟動抑制性信號，例如，抑制b細胞激活。經由免疫復合體或特異性抗體交聯的fcγriia群集用于將itam與促進itam磷酸化的受體相關激酶聚集在一起。itam磷酸化充當syk激酶的停靠位點，syk激酶的激活導致下游底物(例如，pi3k)的激活。細胞激活導致促炎性介質的釋放。當與具有itam的激活性fcγr如fcγriia或fcεri一起共接合或共聚集時，fcγriib中的itim被磷酸化并且募集含src同源2的肌醇磷酸酶(ship)的sh2結構域，肌醇磷酸酶繼而被磷酸化并與shc締合(ott(2002)j.immunol.162(9):4430-4439；yamanshi等人(1997)cell88:205；carpino等人(1997)cell88:197)。ship水解作為含itam的fcγr-介導的激酶激活的結果而釋放的磷酸肌醇信使，從而阻止胞內ca++的流入，并且減緩對fcγr接合的細胞反應。因此，b細胞激活、b細胞增殖和抗體分泌被中止并且fcγr-介導的吞噬作用被下調(tridandapani等人(2002)j.biol.chem.277(7):5082-89)。
具體地，fcγriia與fcγriib的共聚集導致了akt磷酸化的下調，akt是參與細胞調節并用于抑制凋亡的絲氨酸-蘇氨酸激酶，并且肥大細胞中fcγriib與高親和力ige受體fcεri的共聚集導致抗原誘導的脫粒、鈣動員和細胞因子產生的抑制(long(1999)annurev.immunol17:875；metcalfe等人(1997)physiol.rev.77:1033)。fcγriib和b細胞受體(bcr)的共聚集導致bcr介導的信號傳導的抑制以及細胞周期進展和細胞存活的抑制。盡管fcγriib介導的抑制bcr信號傳導的大量效應子功能是通過ship介導的，最近已證明來自ship缺陷型小鼠的脂多糖(lps)激活的b細胞表現出顯著的fcγriib介導的鈣動員、ins(1,4,5)p3產生以及erk和akt磷酸化的抑制(brauweiler等人(2001)journalofimmunology167(1):204-211)。
在小鼠和人中，fcγriii的大小由于此類別中的不均一性而介于40與80kda之間。兩種人基因編碼兩種轉錄物，整合膜糖蛋白fcγriiia和糖基磷脂酰肌醇(gpi)連接的形式fcγriiib。一種鼠基因編碼與跨膜的人fcγriiia同源的fcγriii。fcγriii具有與其他兩種fcγr的每一種相同的結構特征。如同fcγrii一樣，fcγriii以低親和力結合igg并且含有相應的兩個胞外ig樣結構域。fcγriiia在巨噬細胞、肥大細胞中表達，并且是nk細胞中唯一的fcγr。目前已知gpi-連接的fcγriiib僅在人嗜中性粒細胞中表達。
fcγriv(也稱為mfcriv)需要fcrγ-鏈的締合以便最佳地表達并對髓樣細胞起作用；它的信號傳導潛能還被募集銜接子分子crk-l和磷脂酰肌醇-3-oh激酶的胞質“yeep”基序增強。fcγriv優先結合b同種異型的免疫球蛋白e抗體(igeb)以及igg2a和igg2b抗體。抗原-igeb免疫復合體對fcγriv的接合促進巨噬細胞介導的吞噬作用、抗原呈遞至t細胞、促炎性細胞因子的產生和晚期的皮膚過敏反應(hirano等人(2007)natureimmunology8:762-771)。fcγriv是最近鑒定的受體，它在所有的哺乳動物物種中是保守的，具有居中的親和力和有限的亞類特異性(nimmerjahn等人(2005)immunity23:41-51；mechetina等人(2002)immunogenetics54:463-468；davis等人(2002)immunolrev190:23-36)。fcriii和fcriv是用于介導細胞毒性抗體或病原免疫復合體所觸發的炎性疾病的生理上重要的激活fcr。fcriv存在于樹突細胞、巨噬細胞、單核細胞和嗜中性粒細胞上。
除了所有的這些進展之外，仍然需要在自身免疫病、癌癥、炎性疾病和/或移植的治療中具有治療用途并且表現出介導fc受體的效應子功能的改善的能力的抗her2/neu抗體。本發明針對于這種和其他的需要。
發明概述
本發明的實施方案提供了多種多肽，例如包含具有seqidno:4的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變結構域的多肽、包含具有seqidno:2的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈的多肽、和包含含有n65s取代的嵌合4d5免疫球蛋白輕鏈的多肽。其他實施方案提供了包含具有seqidno:7的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈的多肽；包含具有選自由seqidno:9、seqidno:11和seqidno:13組成的組的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈的多肽；和包含含有多個取代的4d5免疫球蛋白重鏈的多肽。
多肽可以是抗體，并且可以特異性地結合人her2/neu。多肽和抗體可以包含含有一種或多種修飾的變體fc結構域，所述修飾可以賦予多肽或抗體表型改變，包括改變的效應子功能、增加或降低的與fcγr的結合等。本發明的實施方案還提供了編碼所述多肽和抗體的多核苷酸、包含所述多核苷酸的載體和包含所述載體的宿主細胞。還提供了制備所述多肽和抗體的方法以及治療各種疾病和疾患的方法。
詳細地，本發明提供了包含含有n65s取代的嵌合4d5免疫球蛋白輕鏈的多肽，并且具體地，提供了其中所述多肽包含具有seqidno:4或seqidno:2的氨基酸序列的輕鏈可變結構域的這種多肽的實施方案。
本發明具體地涉及其中所述多肽是抗體的這種多肽的實施方案，并且更具體地，包含在fc結構域中具有至少一種修飾的變體fc結構域的抗體。本發明具體地涉及其中所述修飾包含選自由下列組成的組的至少一個取代的實施方案：l235v、f243l、r292p、y300l、v305i和p396l。
本發明還涉及其中fc結構域中的修飾包含下列的這種抗體的實施方案：
(a)選自由下列組成的組的至少一個取代：f243l、d270e、r292p、s298n、y300l、v305i、a330v和p396l；
(b)選自由下列組成的組的至少兩個取代：f243l和p396l；f243l和r292p；以及r292p和v305i；
(c)選自由下列組成的組的至少三個取代：f243l、r292p和y300l；f243l、r292p和v305i；f243l、r292p和p396l；以及r292p、v305i和p396l；或
(d)選自由下列組成的組的至少四個取代：f243l、r292p、y300l和p396l；以及f243l、r292p、v305i和p396l；
并且更具體地涉及其中fc結構域中的修飾包含下列的抗體：
(1)f243l、r292p和y300l；
(2)l235v、f243l、r292p、y300l和p396l；或
(3)f243l、r292p、y300l、v305i和p396l。
本發明還涉及其中變體fc結構域與野生型fc結構域相比表現出下列特征的這種抗體的實施方案：
(a)增強的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)；
(b)增加的與fcγriia或與fcγriiia的結合；
(c)降低的與fcγriib的結合；或
(d)增加的與fcγriib的結合。
本發明還涉及包含免疫球蛋白重鏈的多肽，所述免疫球蛋白重鏈包含具有選自由seqidno:9、seqidno:11和seqidno:13組成的組的氨基酸序列的可變結構域。
本發明還涉及包含4d5免疫球蛋白重鏈的多肽，所述4d5免疫球蛋白重鏈包含：
(a)選自由下列組成的組的至少一個取代：f243l、d270e、r292p、s298n、y300l、v305i、a330v和p396l；
(b)選自由下列組成的組的至少兩個取代：
(1)f243l和p396l；
(2)f243l和r292p；以及
(3)r292p和v305i；
(c)選自由下列組成的組的至少三個取代：
(1)f243l、r292p和y300l；
(2)f243l、r292p和v305i；
(3)f243l、r292p和p396l；以及
(4)r292p、v305i和p396l；
(d)選自由下列組成的組的至少四個取代：
(1)f243l、r292p、y300l和p396l；以及
(2)f243l、r292p、v305i和p396l；
或
(e)至少f243l、r292p、y300l、v305i和p396取代。
本發明還涉及其中所述多肽是抗體的這種多肽的實施方案。
本發明還涉及上述抗體的實施方案，其中所述抗體還包含含有具有下列氨基酸序列的可變結構域的免疫球蛋白重鏈：seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11或seqidno:13。
本發明還涉及上述抗體的實施方案，其中抗體包含：
(a)選自由下列組成的組的至少一個取代：f243l、d270e、r292p、s298n、y300l、v305i、a330v和p396l；
(b)選自由下列組成的組的至少兩個取代：
(1)f243l和p396l；
(2)f243l和r292p；以及
(3)r292p和v305i；
(c)選自由下列組成的組的至少三個取代：
(1)f243l、r292p和y300l；
(2)f243l、r292p和v305i；
(3)f243l、r292p和p396l；以及
(4)r292p、v305i和p396l；
(d)選自由下列組成的組的至少四個取代：
(1)f243l、r292p、y300l和p396l；以及
(2)f243l、r292p、v305i和p396l；
或
(e)至少f243l、r292p、y300l、v305i和p396取代。
本發明還涉及上述抗體的實施方案，其中所述免疫球蛋白輕鏈包含具有seqidno:4的氨基酸序列的可變結構域，并且所述免疫球蛋白重鏈包含seqidno:9、seqidno:11或seqidno:13的氨基酸序列。
本發明還涉及其中所述抗體是f(ab')2片段、f(ab)片段、單鏈抗體、單克隆抗體或雙抗體(diabody)的上述抗體的實施方案。
本發明還涉及上述抗體在制備用于治療患者的癌癥的藥物中的用途，并且具體地，其中所述癌癥是表達her2/neu的癌癥并且其中所述抗體結合人her2/neu。
本發明還涉及治療癌癥的方法，所述方法包括：為需要其的患者提供有效量的上述抗體，并且具體地，其中所述癌癥是表達her2/neu的癌癥并且其中所述抗體結合人her2/neu。
本發明還涉及這種抗體的用途，其中所述治療還包括與所述抗體同時或順序施用第二治療劑的步驟，其中所述第二治療劑選自由下列組成的組：抗血管發生劑、抗腫瘤劑(anti-neoplasticagent)、化療劑和細胞毒性劑。
本發明的其他優點和特征將通過下列詳細說明、附圖和說明本發明的優選實施方案的實施例而明顯可見。
附圖簡述：
圖1描繪比較優選實施方案(seqidno:4)的嵌合4d5抗體與鼠(seqidno:3)和人源化(seqidno:5)4d5抗體的輕鏈可變區序列的序列比對。
圖2描繪ch4d5-野生型fc(“wt”)(seqidno:7)、ch4d5-fcmt1(“mt1”)(seqidno:9)、ch4d5-fcmt2(“mt2”)(seqidno:11)與ch4d5-fcmt3(“mt3”)(seqidno:13)的重鏈序列之間的比較。cdr用在相關殘基下面所顯示的黑線表示。
圖3描繪ch4d5-野生型fc(圖a)、ch4d5(圖b)和曲妥單抗(圖c)結合的biacore分析。
圖4描繪在體外ch4d5對skbr3細胞增殖的影響。
圖5描繪本發明實施方案的多種抗體在非轉基因小鼠中的增強的抗腫瘤活性。
圖6描繪本發明實施方案的多種抗體在hcd16a轉基因小鼠中的增強的抗腫瘤活性。
圖7描繪通過在非轉基因小鼠和轉基因小鼠中本發明實施方案的多種抗體表現的腫瘤生長抑制中mfcriv和hcd16a的作用。
圖8描繪本發明實施方案的多種抗體在hcd16a轉基因小鼠中的增強的抗腫瘤活性。
圖9圖解來自多種癌癥細胞系的細胞的代表性her2/neu免疫組織化學染色。各圖代表不同的細胞系，即，圖a：mda-mb-435；圖b：mda-mb-231；圖c：a549；圖d：ovcar-8；圖e：mcf-7；圖f：bt-20；圖g：ht-29；圖h：zr75-1；圖i：jimt-1；圖j：mda-mb-453；圖k：bt-474；圖l：skbr-3；和圖m：mskov-3。
圖10描繪adcc測定的結果，該測定是為測試本發明實施方案的各ch4d5抗體在具有極低或沒有her2/neu表達水平(dako評分為0)的癌癥細胞系(圖a中的mda-mb-435；圖b中的mda-mb-231)中介導adcc的能力而進行的。
圖11描繪adcc測定的結果，該測定是為測試本發明實施方案的各ch4d5抗體在具有低her2/neu表達水平(dako評分為1+)的癌癥細胞系(圖a中的a549；圖b中的ovcar-8；圖c中的mcf-7；圖d中的bt-20；圖e中的ht-29)中介導adcc的能力而進行的。
圖12描繪adcc測定的結果，該測定是為測試本發明實施方案的各ch4d5抗體在具有中等her2/neu表達水平(dako評分為2+)的癌癥細胞系(圖a中的zr75-1；圖b中的jimt-1)中介導adcc的能力而進行的。
圖13描繪adcc測定的結果，該測定是為測試本發明實施方案的各ch4d5抗體在具有高her2/neu表達水平(dako評分為3+)的癌癥細胞系(圖a中的mda-mb-453；圖b中的bt-474；圖c中的skbr-3；圖d中的mskov-3)中介導adcc的能力而進行的。
發明詳述
本發明提供了新穎的抗體和使用抗her2/neu的抗體治療、診斷和預后某些癌癥的方法。具體地，本發明提供特別可用作過表達her2/neu的細胞的選擇性細胞毒性劑的抗-her2/neu抗體，例如，her2/neu的嵌合4d5抗體，它與已知的4d5抗體相比具有減少的糖基化和改變的效應子功能。本發明還提供所述抗體和包含它們的組合物用于下列疾病的診斷、預測和治療的方法：例如，癌癥、自身免疫疾病、炎性疾患和傳染病。
下面將詳細地參考本發明目前的優選實施方案，它們與附圖和下列實施例一起用于解釋本發明的原理。這些實施方案描述得足夠詳細以使本領域技術人員能夠實施本發明，并且應理解可以采用其他的實施方案，并且可以在不背離本發明的主旨和范圍的情況下進行結構的、生物的和化學的改變。除非另外定義，否則本文使用的所有技術術語和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解相同的意思。本領域技術人員可以參考一般參考教科書對本文所討論的技術的這些定義或詳細說明。這些教科書包括：例如currentprotocolsinmolecularbiology(現代分子生物學實驗技術)(ausubel等人,編輯,johnwiley&sons以及到2008年3月的補充材料)、molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆：實驗室手冊)(sambrook和russell,第三版,2001)；single-moleculetechniques:alaboratorymanual(單分子技術：實驗室手冊)(selvin&ha,編輯,coldspringharborpress,2008)；currentprotocolsinnucleicacidchemistry(現代核酸化學實驗方案)(beaucage等人,編輯,johnwiley&sons,inc.,2000)；currentprotocolsinimmunology(現代免疫學實驗方案)(coligan等人,編輯,johnwiley&sons,n.y.,以及到2008年3月的補充材料)、makingandusingantibodies:apracticalhandbook(制備和使用抗體：實用手冊)(howard&kaser,編輯,crc,2006)；usingantibodies:alaboratorymanual(使用抗體：實驗室手冊)(harlow&lane,coldspringharborpress,1999)；bindingandkineticsformolecularbiologists(用于分子生物學家的結合和動力學)(goodrich&kugel,coldspringharborpress,2007)；currentprotocolsinpharmacology(現代藥理學實驗方案)(enna等人,編輯,johnwiley&sons,n.y.,以及到2008年3月的補充材料),thepharmacologicalbasisoftherapeutics(治療學的藥理學基礎)(goodman&gilman,第11版,2006),和remington:thescienceandpracticeofpharmacy(雷明頓：藥學科學和實踐)(lippincottwilliams&wilkins,第21版(2005)。
a.定義
如本文所用術語“adcc”是指抗體依賴性細胞毒性，它是體外細胞介導的反應，其中表達fcγr的非特異性細胞毒性細胞(例如，單核細胞，如自然殺傷(nk)細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體并隨后引起靶細胞裂解。
如本文所用術語“抗體”是指單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝源化抗體(camelizedantibodies)、單鏈fv(scfv)、單鏈抗體、免疫活性抗體片段(例如，能夠結合表位的抗體片段，例如，fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、fv片段、含有vl或vh結構域或免疫特異性結合抗原的互補決定區(cdr)的片段等)、雙功能或多功能抗體、二硫鍵連接的雙特異性fv(sdfv)、胞內抗體(intrabodies)和雙抗體，以及上述任一種的表位結合片段。具體地，術語抗體旨在涵蓋免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類型的(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、任何種類的(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或任何亞類的(參見美國專利公布第20040185045號；20050037000號；20050064514號；20050215767號；20070004909號；20070036799號；20070077246號；和20070244303號)。
“b細胞抗原受體”或“bcr”的含義旨在指b細胞抗原受體，它包括膜免疫球蛋白(mlg)抗原結合組分或其生物活性部分(即，能夠結合配體和/或能夠與轉導蛋白組分締合的部分)、和轉導蛋白cd79a和cd79b組分或其生物活性部分(即，能夠轉導胞內信號和/或能夠與胞外配體結合部分締合的部分)。
如本文所用術語“癌癥”是指由細胞的異常的不受控制的生長引起的贅生物或腫瘤。如本文所用，癌癥明確地包括白血病和淋巴瘤。在一些實施方案中，癌癥是指良性腫瘤，它仍然是局部性的。在其他實施方案中，癌癥是指惡性腫瘤，它已經侵入和破壞鄰近的身體結構并向遠的部位擴散。在一些實施方案中，癌癥與特異性癌抗原相關。
術語“細胞增殖性疾患”和“增殖性疾患”是指與某種程度的異常細胞增殖相關的疾患。在一個實施方案中，細胞增殖性疾患是癌癥。
術語“嵌合的”在指抗體時是指其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自一個物種(例如，小鼠)或抗體種類或亞類的抗體相同或同源，而剩余部分與另一物種(例如，人)或抗體種類或亞類的抗體相同或同源的抗體，只要他們表現出期望的生物活性即可。本文感興趣的嵌合抗體包括“靈長源化的(primatized)”嵌合抗體，其包含源自非人的靈長類(例如，舊大陸猴(oldworldmonkey)、猿等)的可變結構域抗原結合序列和人恒定區序列。
如本文所用術語“互補決定區”或“cdr”是指抗原結合所必需的抗體可變結構域的氨基酸殘基。每個可變結構域通常具有三個cdr區，它們被標為cdr1、cdr2和cdr3。
如本文所用術語“雙抗體分子”是指兩種或更多種多肽鏈或蛋白的復合體，所述兩種或更多種多肽鏈或蛋白各自包含至少一個vl結構域和一個vh結構域或它們的片段，其中兩種結構域均包含在單個多肽鏈中。在某些實施方案中，“雙抗體分子”包括包含fc或鉸鏈-fc結構域的分子。復合體中的所述多肽鏈可以是相同的或不同的，即，雙抗體分子可以是同源多聚體或異源多聚體。在具體的方面，“雙抗體分子”包括二聚體或四聚體或所述多肽鏈含有vl和vh結構域二者。構成多聚體蛋白的各多肽鏈可以通過鏈間二硫鍵共價地連接到多聚體的至少一個其他肽上。
如本文所用術語“疾患”和“疾病”可互換使用，是指受治療者的病癥。具體地，術語“自身免疫疾病”與術語“自身免疫疾患”可互換使用，是指由受治療者對其自身的細胞、組織和/或器官的免疫反應引起的細胞、組織和/或器官損傷表征的受治療者的病癥。術語“炎性疾病”與術語“炎性疾患”可互換使用，是指由炎癥，優選慢性炎癥表征的受治療者的病癥。自身免疫疾患可以伴隨或不伴隨有炎癥。此外，炎癥可以是或不是由自身免疫疾患引起的。因此，某些疾患可以表征為自身免疫疾患和炎性疾患二者。
如本文所用的“效應子細胞”是指表達一種或多種fc受體并介導一種或多種效應子功能的免疫系統的細胞。效應子細胞包括但不限于單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、血小板、b細胞、大顆粒淋巴細胞、朗格漢斯細胞、自然殺傷(nk)細胞，并且可以來自任何生物體，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。
術語“效應子細胞”是指可歸因于抗體fc區與fc受體或配體的相互作用的生物活性。抗體可以具有一種或多種效應子功能。抗體效應子功能的非限制性實例包括抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)、c1q結合、補體依賴性細胞毒性(cdc)、細胞表面受體(例如，b-細胞受體；bcr)的下調、調理作用、調理吞噬作用(opsonophagocytosis)、細胞結合和花結形成(rosetting)。效應子功能包括在抗原結合之后起作用的那些和不依賴于抗原結合的那些。
如本文所用術語“表位”是指多肽或蛋白或非蛋白分子被抗體免疫特異性結合的那部分。表位可以具有免疫原活性，以使其在動物中引發抗體產生反應。表位免疫特異性結合抗體的能力可以通過例如免疫測定來確定。表位不需要必須是免疫原性的。
術語“fc受體”或“fcr”用于本文以描述結合抗體fc區的受體。示例的fcr是天然序列的人fcr。fcr可以是結合igg抗體的fcr(γ受體)，并且包括fcγri、fcγrii、fcγriii和fcγriv亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和替代地剪接的形式，例如至少有兩種已知的fcγrii受體，fcγriia和fcγriib。術語fcr還包括新生兒受體fcrn，它負責將母體的igg轉移給胎兒。
如本文所用術語“fc區”用于定義igg重鏈的c-末端區。盡管界限可能輕微變化，但人igg重鏈fc區被定義為從羧基末端的cys226延伸。igg的fc區包含兩個恒定結構域ch2和ch3。人iggfc區的ch2結構域(也稱為“cγ2”結構域)通常從氨基酸231延伸至氨基酸338，并且人iggfc區的ch3結構域通常由氨基酸342延伸至氨基酸447。
術語“糖基化位點”是指被哺乳動物細胞識別為糖殘基的附連位置的氨基酸殘基。碳水化合物如寡糖所附連的氨基酸殘基通常是天冬酰胺(n-連接)、絲氨酸(o-連接)和蘇氨酸(o-連接)殘基。附連的特異性位點具有特征氨基酸序列，稱為“糖基化位點序列”。n-連接的糖基化的糖基化位點序列是：asn-x-ser/thr，其中x可以是除脯氨酸以外的任何常見氨基酸。人igg的fc區具有兩個n-連接的糖基化位點，在每個ch2結構域上各一個，位于位置297的天冬酰胺(asn297)處。
如本文所用術語“hama反應”是指人抗小鼠抗體反應，這是當人免疫系統識別鼠抗體為外來物并攻擊它時發生的一種有害的免疫原性反應。hama可能引起中毒性休克或死亡。嵌合抗體和人源化抗體通過減少施用抗體的非人部分而降低hama反應的可能，但是仍存在對這種抗體的人抗人抗體反應(“haha反應”)免疫反應的可能。
術語“重鏈”、“輕鏈”(“cl”)、“輕鏈可變區”(“vl”)、“重鏈可變區”(“vh”)、“框架區”(“fr”)、“重鏈恒定結構域”(“ch”)、“輕鏈恒定結構域”(“cl”)是指天然存在的免疫球蛋白的結構域和合成的(例如，重組體)結合蛋白(例如，人源化抗體)的相應結構域。天然存在的免疫球蛋白(例如，igg)的基本結構單位是具有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體。天然存在的免疫球蛋白通常表達為約150kda的糖蛋白，盡管igg也可以以非糖基化形式產生。各鏈的氨基末端(“n”)部分包括約100至110個或更多個氨基酸的可變區，該可變區主要負責抗原識別。各鏈的羧基末端(“c”)部分定義了恒定區，其中輕鏈具有單個恒定結構域并且重鏈通常具有三個恒定結構域和一個鉸鏈區。因此，天然存在的igg分子的輕鏈結構是n-vl-cl-c，并且igg重鏈的結構是n-vh-ch1-h-ch2-ch3-c(其中h是鉸鏈區)。igg分子的可變區由互補決定區(cdr)構成，互補決定區含有與抗原接觸的殘基和稱為框架區段的非cdr區段，非cdr區段保持結構并決定cdr環的定位。因此，vl和vh結構域具有結構n-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4-c。
如本文所用術語“異源的”核酸表示被引入宿主細胞的dna、rna等。核酸可以源自多種來源的任一種，包括基因組dna、mrna、cdna、合成的dna和融合體或這些的組合。核酸可以包括來自與宿主或受者細胞相同的細胞或細胞類型的多核苷酸或來自不同細胞類型的多核苷酸，例如，來自哺乳動物或植物，并且可以任選地包括標記基因或選擇基因，例如抗生素抗性基因、耐溫度基因等。
術語“鉸鏈區”一般被定義為從人igg1的glu216延伸至pro230。其他igg同種型的鉸鏈區可以通過將形成重鏈間s-s鍵的第一個和最后一個半胱氨酸殘基放置在同一位置而與igg1序列比對。
如本文所用術語“人源化”具有其在本領域內的常用意思。一般地，非人抗體的人源化包括將來自非人免疫球蛋白vl和vh區的cdr序列取代到人框架區中。此外，如本文所用“人源化”抗體可以包括cdr和/或框架區中被引入來增加親和力或用于其他目的的其他取代和突變。例如，人序列中非人框架殘基的取代可以增加親和力。所得的可變結構域具有非人cdr序列和源自人抗體框架序列或人共有序列的框架序列。多種不同的人框架區可以單獨或組合使用作為人源化抗體的基礎。
如本文所用術語“免疫調節劑”及其變化形式是指調節宿主免疫系統的藥劑。在某些實施方案中，免疫調節劑是免疫抑制劑。在某些其他實施方案中，免疫調節劑是免疫刺激劑。免疫調節劑包括但不限于：小分子、肽、多肽、融合蛋白、抗體、無機分子、模擬藥劑和有機分子。
如本文所用術語“免疫特異性結合”是指在抗體與其所識別的表位之間表現出的特異性結合。這種結合將通常表現出至少約0.1mm，更通常至少約1μm，優選至少約0.1μm或更低，并且最優選0.01μm或更低的kd。優選地，本發明的抗體以高親和力(例如，低kd)免疫特異性地結合蛋白。
如通過例如免疫測定、biacore或本領域內已知的其他測定所測定的，免疫特異性結合抗原的抗體可以以較低的親和力結合其他肽或多肽。優選地，特異性結合抗原的分子不與其他蛋白交叉反應。可以通過免疫測定、biacore或本領域技術人員已知的其他技術鑒定特異性結合抗原的分子。
如本文所用的術語“抗體工程化技術領域(antibodyengineeringtechnologyart)”是指在下列專利中公開的技術：美國臨時專利申請第60/781,564號；60/945,523號；2007年12月19日提交的61/015,106號；和2008年1月4日提交的61/019,051號；us20040185045號；us20040197347號；us20040197866號；us20050037000號；us20050064514號；us20050215767號；us20060134709號；us20060177439號；us20070004909號；us20070036799號；us20070037216號；us20070077246號；us20070244303號；us20080044429號；us20080050371號；11/869,410號；11/952,568號；美國專利第7,112,439號；wo04/063351；wo06/088494；wo07/024249；wo06/113665；wo07/021841；wo07/106707；或pct/us07/86793。
如本文所用的術語“單克隆抗體”是指由基本上均一的抗體群獲得的抗體，即除了可能少量存在的天然存在的突變外，構成群的單個抗體是相同的，并且如本文所用的術語“多克隆抗體”是指由不均一的抗體群獲得的抗體。單克隆抗體是高度特異的，針對單個表位。除了它們的特異性外，單克隆抗體的優勢在于它們可以被合成而不受其他抗體污染。術語“單克隆”表示由基本上均勻的抗體群獲得的抗體的特征，并且不應解釋為需要通過任何特定的方法制備抗體。
如本文所用術語“核酸”和“核苷酸序列”包括dna分子(例如，cdna或基因組dna)、rna分子(例如，mrna)、dna和rna分子的組合或雜交dna/rna分子，和dna或rna分子的類似物。這種類似物可以使用例如核苷酸類似物產生，所述核苷酸類似物包括但不限于肌苷或三苯甲基化堿基。這種類似物還可以包含含有修飾的骨架的dna或rna分子，所述修飾的骨架給分子帶來有益的屬性，例如核酸酶抗性或增加的跨細胞膜的能力。核酸或核苷酸序列可以是單鏈的、雙鏈的，可以含有單鏈部分和雙鏈部分二者，并且可以含有三鏈部分，但優選是雙鏈dna。
如本文所用的“基本的序列同一性”是指兩個或更多個序列或亞序列(例如，結構域)在最大對應性的比較和比對時具有至少約80％的氨基酸殘基同一性，優選至少約90％、或至少約95％的同一性。兩個相似序列(例如，抗體可變區)之間的序列同一性可以通過如下的算法測量：例如smith&waterman,1981,adv.appl.math.2:482[localhomologyalgorithm(局部同源性算法)]、needleman&wunsch,1970,j.mol.biol.48:443[homologyalignmentalgorithm(同源性比對算法)]、pearson&lipman,1988,proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)85:2444[searchforsimilaritymethod(相似性方法的檢索)]或altschul等人,1990,j.mol.biol.215:403-10[blastalgorithm(blast算法)]。當使用上述算法的任一種時，使用缺省參數(如單位比對長度(windowlength)、空位罰分(gappenalty)等)。當序列同一性的程度為至少約70％相同、優選至少約80％或至少約90％或甚至至少約95％相同時，認為氨基酸序列“基本上類似于”第二序列。在下列任一種情況時認為核酸序列“基本上類似于”第二核酸序列：(1)序列同一性的程度是至少約70％相同，優選至少約80％或至少約90％或甚至至少約95％相同，或核酸序列編碼與第二序列所編碼的多肽至少約70％相同，優選至少約80％或至少約90％或甚至至少約95％相同的多肽。基本上相同的序列也是基本上相似的。
當提到抗體時，各結構域的氨基酸的分配是根據kabat,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(免疫學上重要蛋白的序列)(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1987和1991)，其以引用方式清楚地并入本文。遍及本說明書，igg重鏈中殘基的編號是kabat中eu索引的編號，并且是指人igg1eu抗體的編號。
b.抗體
本發明具體涵蓋特異性結合her2/neu，優選人her2/neu的嵌合抗體和多肽。由于在輕鏈可變區中的糖基化位點的移除，所述抗體與諸如鼠4d5和曲妥單抗等已知的4d5抗體相比具有減少的糖基化。具體地，抗體缺乏在輕鏈可變區中的糖基化位點，該糖基化位點在天然鼠4d5中包含位置65、66、67處的n-r-s序列。優選地，抗體對her2/neu具有增強的結合親和力，并且更優選地，抗體具有增強的效應子功能，兩者都是與天然4d5抗體相比的。
抗體包含在輕鏈可變區的位置65、66、67處缺乏n-連接的糖基化位點的嵌合4d5免疫球蛋白輕鏈。在具體的實施方案中，抗體包含輕鏈可變區(vl)的位置65處的修飾，優選取代。在優選的實施方案中，抗體包含由seqidno:1的核酸序列編碼的輕鏈，或包含seqidno:2的氨基酸序列。本發明的優選輕鏈的核酸和氨基酸序列呈現如下：
嵌合的輕鏈核酸序列(seqidno:1)：
嵌合的輕鏈氨基酸序列(seqidno:2)：
如可在圖1中看到的，在vl區的位置65處具有修飾的這些抗體缺乏在天然鼠4d5抗體中所發現的n-連接的糖基化位點，圖1描繪具有n65s修飾(seqidno:4)的嵌合4d5抗體與天然鼠(seqidno:3)和人源化(seqidno:5)4d5抗體的vl區氨基酸序列之間的示例性比較。在另一優選的實施方案中，抗體在vl區包含n65s修飾，并且優選地具有seqidno:4的vl區氨基酸序列。這些序列呈現如下：
天然鼠vl區氨基酸序列(seqidno:3)：
嵌合的vl區氨基酸序列(seqidno:4)：
人源化的vl區氨基酸序列(seqidno:5)：
在一個實施方案中，重鏈具有鼠4d5野生型fc區，其優選是由seqidno:6的核酸序列編碼的，或具有seqidno:7的氨基酸序列。這些序列呈現如下：
具有野生型fc區的重鏈核酸序列(seqidno:6)：
具有野生型fc區的重鏈氨基酸序列(seqidno:7)：
在其他實施方案中，重鏈是鼠4d5抗體重鏈的變體，優選包含變體fc區，并且更優選包含諸如fcmt1、fcmt2或fcmt3等變體fc區。這些序列呈現如下：
具有fcmt1變體fc區的重鏈核酸序列(seqidno:8)：
具有fcmt1變體fc區的重鏈氨基酸序列(seqidno:9)：
具有fcmt2變體fc區的重鏈核酸序列(seqidno:10)：
具有fcmt2變體fc區的重鏈氨基酸序列(seqidno:11)：
具有fcmt3變體fc區的重鏈核酸序列(seqidno:12)：
具有fcmt3變體fc區的重鏈氨基酸序列(seqidno:13)：
在一個實施方案中，變體4d5重鏈在fc區中具有修飾，并且是由seqidno:8的核酸序列編碼的或包含seqidno:9的氨基酸序列，或是由seqidno:10的核酸序列編碼的或包含seqidno:11的氨基酸序列，或是由seqidno:12的核酸序列編碼的或包含seqidno:13的氨基酸序列。優選地，抗體包含由選自由下列組成的組的核酸序列編碼的重鏈：seqidno:6、seqidno:8、seqidno:10和seqidno:12；或包含選自由下列組成的組的氨基酸序列：seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11和seqidno:13。
在一個實施方案中，抗-her2/neu抗體包含在vl區具有n65s修飾的免疫球蛋白輕鏈和具有修飾的fc區的免疫球蛋白重鏈。優選地，抗-her2/neu抗體包含具有seqidno:2的氨基酸序列的輕鏈和具有選自由下列組成的組的氨基酸序列的重鏈：seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11和seqidno:13。在一些實施方案中，本發明的多肽還包含與輕鏈可變結構域融合的輕鏈恒定結構域，所述輕鏈可變結構域在一些實施方案中至少包含seqidno:4。在一些實施方案中，抗體是被修飾的片段、片段或被修飾的片段。
嵌合4d5抗體是根據本發明的多個實施方案構建的以增強對激活性低親和力fc受體的結合，并不改變或僅最小程度的增加對低親和力抑制受體cd32b(fcγrii-b)的結合。抗體包括下列野生型和fc-優化的抗體：
●ch4d5-野生型fc，它具有含seqidno:2的氨基酸序列的輕鏈和具有seqidno:7的氨基酸序列的重鏈。ch4d5-野生型fc在輕鏈上具有n65s取代，這產生了去糖基化的輕鏈。
●ch4d5-fcmt1，它具有含seqidno:2的氨基酸序列的輕鏈和具有seqidno:9的氨基酸序列的重鏈。ch4d5-fcmt1在輕鏈上具有n65s取代，這產生了去糖基化的輕鏈，并且在重鏈上具有f243l、r292p、y300l、v305i和p396l取代(全部根據kabat編號)。ch4d5-fcmt1在與人cd16a(fcγriii-a)結合方面表現出10倍增加，并且與cd16-158phe的結合以與cd16-158val的結合相比以成比例增加的方式增強。
●ch4d5-fcmt2，它具有含seqidno:2的氨基酸序列的輕鏈和具有seqidno:11的氨基酸序列的重鏈。ch4d5-fcmt2在輕鏈上具有n65s取代，這產生了去糖基化的輕鏈，并且在重鏈上具有l235v、f243l、r292p、y300l和p396l取代(全部根據kabat編號)。這種抗體是ch4d5-fcmt1抗體的進一步精簡形式并且具有相似的cd16a結合特性，但是其還具有更加有利的與cd32b(fcγrii-b)結合的降低。
●ch4d5-fcmt3，它具有含seqidno:2的氨基酸序列的輕鏈和具有seqidno:13的氨基酸序列的重鏈。ch4d5-fcmt3在輕鏈上具有n65s取代，這產生了去糖基化的輕鏈，并且在重鏈上具有f243l、r292p和y300l取代(全部根據kabat編號)。這種抗體是ch4d5-fcmt1抗體的進一步精簡形式并且具有相似的cd16a結合特性，但是其還具有更加有利的與cd32b(fcγrii-b)結合的降低。
●ch4d5-ag
●ch4d5-n297q，它具有含seqidno:2的氨基酸序列的輕鏈和具有n297q取代的重鏈(根據kabat編號)。
ch4d5-野生型fc與fc-優化的變體ch4d5-fcmt1、ch4d5-fcmt2和ch4d5-fcmt3的重鏈序列的比較顯示在圖2中。cdr用在相關殘基下面所顯示的黑線表示。
本發明所設想的多肽(尤其是抗體)可以包含本發明的任何氨基酸序列的全部或部分。例如，在一個實施方案中，多肽包含具有n65s取代的鼠4d5免疫球蛋白輕鏈，并且在另一實施方案中，多肽包含鼠4d5免疫球蛋白重鏈變體。在另一實施方案中，多肽包含具有seqidno:4的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變結構域或具有seqidno:2的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在另一實施方案中，多肽包含變體fc結構域，或具有seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11或seqidno:13的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈或包含f243l、r292p和y300l取代的4d5免疫球蛋白重鏈。
本發明所設想的多肽(尤其是抗體)可以與彼此形成復合體或與其他非免疫球蛋白多肽(例如，酶、激素、結構蛋白等)形成復合體。例如，一種實施方案可以提供包含兩種多肽的多肽復合體，其中所述多肽之一包含重鏈并且另一多肽包含變體輕鏈，或其中兩種多肽均含有相同的序列。復合體形成可以通過任何合適的技術介導，包括通過在如本文所述的那些的二聚化/多聚化結構域的二聚化/多聚化或共價相互作用(例如通過二硫鍵)(它在一些背景下是二聚化結構域的一部分，例如二聚化結構域可以含有亮氨酸拉鏈序列和半胱氨酸)。在另一實施方案中，組合物可以包含本發明的多肽和/或多核苷酸，例如，組合物可以包含多個本文所述的任一多肽。包含多核苷酸或多肽的組合物可以是藥盒或制品的形式(任選地與說明書、緩沖液等一起包裝)。
還設想可以制備多肽變體(并且尤其是抗體變體)。多肽變體與天然氨基酸序列相比可以在它們的氨基酸序列內的期望位置具有序列修飾(例如，取代、缺失和/或添加)。本領域技術人員將了解，氨基酸改變可以改變抗體或多肽的翻譯后過程，如改變糖基化位點的數目或位置或改變膜錨定特征。在優選的實施方案中，抗體和多肽變體是fc區變體。
變體與天然抗體或多肽相比可以具有相同的或改變的活性。例如，可能期望的是變體具有相同的活性但是以使得其更穩定或具有更長的體內半衰期的方式被修飾，例如，通過將抗體與白蛋白或補救受體結合表位軛合，如在例如美國專利第5,739,277中描述的。或者，例如，可能期望的是抗體對抗原具有增加的結合親和力，但是具有與天然抗體相同的效應子功能，或者可能期望的是抗體對抗原具有相同的結合親和力但是具有降低的效應子功能。可以通過例如使用體外測定如elisa測定、表面等離子體共振測定、放射性標記的蛋白結合測定(ria)或免疫沉淀測定來測試活性。
在功能或免疫同一性上的實質修飾可以通過選擇在維持下列方面的作用方面顯著不同的修飾來完成：(a)修飾區域的多肽骨架的結構，例如，為片層或螺旋構象；(b)在靶位點的分子的電荷或疏水性；或(c)側鏈堆積。還可以采用掃描氨基酸分析來鑒定沿著連續序列的一個或多個氨基酸，例如cunningham和wells(1989)science244:1081-1085所述的。優選的掃描氨基酸是相對較小的中性氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。丙氨酸在這個組中通常是優選的掃描氨基酸，因為它是最常見的氨基酸，并且常見于隱藏的和暴露的位置二者中，并且因為它消除了β-碳以外的側鏈并且不太可能改變變體的主鏈構象。如果丙氨酸取代沒有產生足夠量的變體，則可以使用等構(isoteric)氨基酸。此外，可以取代不參與維持抗體或多肽的正確構象的任何半胱氨酸殘基，一般用絲氨酸進行，以改善分子的氧化穩定性并阻止異常的交聯。然而，在某些情況下，尤其在抗體是諸如fv片段等抗體片段時，可以添加半胱氨酸鍵至抗體或多肽以改善其穩定性。
b1.fc結構域變體
本發明的多肽可以具有變體fc結構域。fc結構域的修飾通常導致改變的表型，例如改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的敏感性或改變的效應子功能。可能期望的是在關于效應子功能方面修飾本發明的抗體以便增強抗體在例如治療癌癥中的效力。降低或消除效應子功能在某些情況下是期望的，例如在抗體的作用機制包括阻斷或拮抗作用但是不殺傷具有靶抗原的細胞的情況下。增加的效應子功能在針對不期望的細胞時一般是期望的，例如針對其中低水平表達fcγr的腫瘤細胞和外來細胞，例如具有低水平的fcγriib的腫瘤特異性b細胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、cll和伯基特淋巴瘤)時。在所述實施方案中，具有被賦予的或改變的效應子功能活性的本發明的分子可用于治療和/或預防其中期望效應子功能活性功效增強的疾病、疾患或感染。
在某些實施方案中，本發明的分子包含對fc結構域的氨基酸的一種或多種修飾，該修飾降低fc區對一種或多種fcγr受體的親和力和親抗原性(avidity)并且，因此降低本發明的分子對一種或多種fcγr受體的親和力和親抗原性。在其他實施方案中，本發明的分子包含對fc區的氨基酸的一種或多種修飾，該修飾增加fc區對一種或多種fcγr受體的親和力和親抗原性并且，因此增加本發明的分子對一種或多種fcγr受體的親和力和親抗原性。在其他實施方案中，分子包含變體fc結構域，其中所述變體賦予或介導與不包含fc結構域或包含野生型fc結構域的分子相比增加的adcc活性和/或增加的與fcγriia的結合。在可選的實施方案中，分子包含變體fc結構域，其中所述變體賦予或介導與不包含fc結構域或包含野生型fc結構域的分子相比減少的adcc活性(或其他效應子功能)和/或增加的與fcγriib的結合。
在一些實施方案中，本發明涵蓋包含變體fc區的分子，該變體fc區與包含野生型fc區的相應分子相比不顯示與任何fcγr的可檢測的結合。在其他實施方案中，本發明涵蓋包含變體fc區的分子，該變體fc區僅結合單個fcγr，優選fcγriia、fcγriib或fcγriiia之一。
本發明的多肽可以包含對激活性和/或抑制性fcγ受體的改變的親和力。在一個實施方案中，抗體或多肽包含具有與具有野生型fc區的相應分子相比增加的fcγriib親和力和降低的fcγriiia和/或fcγriia親和力的變體fc區。在另一實施方案中，本發明的多肽包含具有與具有野生型fc區的相應分子相比降低的fcγriib親和力和增加的fcγriiia和/或fcγriia親和力的變體fc區。在又一個實施方案中，本發明的多肽包含具有與具有野生型fc區的相應分子相比降低的fcγriib親和力和降低的fcγriiia和/或fcγriia親和力的變體fc區。在再一個實施方案中，本發明的多肽包含具有與具有野生型fc區的相應分子相比未改變的fcγriib親和力和降低(或增加)的fcγriiia和/或fcγriia親和力的變體fc區。
在某些實施方案中，本發明涵蓋包含具有改變的fcγriiia和/或fcγriia親和力的變體fc區的免疫球蛋白，以便使免疫球蛋白具有增強的效應子功能，例如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。效應子細胞功能的非限制性實例包括：抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)、抗體依賴性吞噬作用、吞噬作用、調理作用、調理吞噬作用、細胞結合、花結形成、c1q結合和補體依賴性細胞介導的細胞毒性。
在優選的實施方案中，與包含野生型fc區的相應分子相比，親和力或效應子功能的改變為至少2-倍，優選至少4-倍、至少5-倍、至少6-倍、至少7-倍、至少8-倍、至少9-倍、至少10-倍、至少50-倍或至少100-倍。在本發明的其他實施方案中，變體fc區與包含野生型fc區的分子相比以增加至少65％，優選至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％或250％的親和力免疫特異性結合一個或多個fcr。這種測量可以是體內或體外測定，并且在優選的實施方案中是體外測定，如elisa或表面等離子體共振測定。
在不同的實施方案中，分子包含變體fc結構域，其中所述變體激動fcγr受體的至少一種活性或拮抗fcγr受體的至少一種活性。在優選的實施方案中，分子包含激動(或拮抗)fcγriib的一種或多種活性的變體，例如，b細胞受體介導的信號傳導、b細胞的激活、b細胞增殖、抗體產生、b細胞的細胞內鈣流入、細胞周期進展、fcγriib-介導的fcεri信號傳導的抑制、fcγriib的磷酸化、ship募集、ship磷酸化和與shc締合，或fcγriib信號轉導途徑中的一種或多種下游分子(例如，map激酶、jnk、p38或akt)的活性。在另一實施方案中，分子包含激動(或拮抗)fcεri的一種或多種活性的變體，例如肥大細胞激活、鈣動員、脫粒、細胞因子產生或血清素釋放。
在某些實施方案中，分子包含具有來自兩種或更多種igg同種型(例如，igg1、igg2、igg3和igg4)的結構域或區的fc結構域。多種igg同種型表現出不同的物理和功能特性，包括血清半衰期、補體結合、fcγr結合親和力和效應子功能活性(例如，adcc、cdc等)，這是由于他們的鉸鏈和/或fc結構域的氨基酸序列的不同所致的，例如如下列文獻中所述的：flesch和neppert(1999)j.clin.lab.anal.14:141-156；chappel等人(1993)j.biol.chem.33:25124-25131；chappel等人(1991)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)88:9036-9040；brüggemann等人(1987)j.exp.med166:1351-1361。這種類型的變體fc結構域可以單獨使用或與氨基酸修飾組合使用以影響fc介導的效應子功能和/或結合活性。在組合時，氨基酸修飾和igg鉸鏈/fc區可以表現相似的功能(例如，增加的fcγriia親和力)，并且與包含野生型fc區的本發明分子相比可以加和地或更優選地協同地作用以修改本發明分子的效應子功能。在其他實施方案中，氨基酸修飾和iggfc區可以表現相反的功能(例如，分別增加的和降低的fcγriia親和力)，并且可以用于選擇性地升高或減少本發明分子與不包含fc區或包含相同同種型的野生型fc區的本發明分子相比的特定功能。
在優選的具體實施方案中，分子包含變體fc區，其中所述變體fc區包含與野生型fc區相比的至少一個氨基酸修飾，以便使所述分子具有改變的fcr親和力，前提條件是根據fc-fcr相互作用的結晶學分析和結構分析，所述變體fc區在直接接觸fcγr的位置不具有取代，如sondermann等人(2000)nature406:267-273中所公開的那些。在fc區內與fcγr直接接觸的位置的實例是氨基酸殘基234-239(鉸鏈區)、氨基酸殘基265-269(b/c環)、氨基酸殘基297-299(c’/e環)和氨基酸殘基327-332(f/g環)。在一些實施方案中，本發明的分子包含具有至少一個殘基的修飾的變體fc區，根據結構分析和結晶學分析，該至少一個殘基不直接接觸fcγr，即，不在fc-fcγr結合位點之內。
變體fc結構域是本領域中所熟知的，并且任何已知的fc變體可用于本發明以賦予或修飾包含fc結構域(或其片段)的本發明分子所表現的效應子功能，如在例如nk依賴性或巨噬細胞依賴性測定中功能測定的。例如，鑒定為改變效應子功能的fc結構域變體公開于抗體工程化技術領域中，并且本文所公開的任何合適的變體均可用于本發明的分子。
在某些實施方案中，分子包含在一個或多個區內具有一個或多個氨基酸修飾的變體fc區，所述修飾改變(與野生型fc區相比)變體fc區對激活性fcγr(例如fcγriia或fcγriiia)的親和力與對抑制性fcγr(例如fcγriib)的親和力的親和力比率：
在fc變體具有大于1的親和力比率時，本發明的方法特別可用于提供其中期望增強fcγr介導的效應子細胞功能(例如，adcc)的功效的疾病、疾患或感染(例如，癌癥或傳染病)的治療性或預防性治療或其癥狀改善。在fc變體具有小于1的親和力比率時，本發明的方法特別可用于提供其中期望降低fcγr介導的效應子細胞功能的功效的疾病或疾患(例如自身免疫疾患或炎性疾患)的治療性或預防性治療或其癥狀改善。表2列出了親和力比率大于1或小于1的示例性單突變、雙突變、三突變、四突變和五突變。各突變的特異性結合數據列在表3中，并且關于這些突變的更多信息可見于抗體工程化技術領域中。
在其他實施方案中，分子包含具有一個或多個氨基酸取代的變體fc區，該取代改變(與野生型fc區相比)變體fc區的結合，例如，增強與激活性fcγr(例如fcγriia或fcγriiia)的結合和/或降低與抑制性fcγr(例如fcγriib)的結合。工程化了具有一個或多個氨基酸改變的多種fc突變，并通過表面等離子體共振分析了它們的koff，如表4中所示。結合各種fcγr的解離速率常數通過biacore分析測定，并且直接與野生型fc的解離速率常數相比，關于所測試的各fcγr的比率(x＝野生型koff/突變體koff)顯示在表4右欄中。
在抗體工程化技術領域內也具有關于期望的修飾的廣泛指南。在某些情況下可能期望的示例性修飾在下面列出：
在具體的實施方案中，在變體fc區中，具有在下列任何位置處的任何氨基酸修飾(例如，取代)：235、240、241、243、244、247、262、263、269、298、328或330，并且優選具有下列殘基的一個或多個：a240、i240、l241、l243、h244、n298、i328或v330。在不同的具體實施方案中，在變體fc區中具有在下列任何位置處的任何氨基酸修飾(例如，取代)：268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439，并且優選具有下列殘基的一個或多個：h280、q280、y280、g290、s290、t290、y290、n294、k295、p296、d298、n298、p298、v298、i300或l300。
在優選的實施方案中，在以改變的親和力結合fcγr的變體fc區，具有在下列任何位置處的任何氨基酸修飾(例如，取代)：255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439。優選地，變體fc區具有下列殘基的任一種：a256、n268、q272、d286、q286、s286、a290、s290、a298、m301、a312、e320、m320、q320、r320、e322、a326、d326、e326、n326、s326、k330、t339、a333、a334、e334、h334、l334、m334、q334、v334、k335、q335、a359、a360或a430。
在不同的實施方案中，在以降低的親和力結合fcγr(經由其fc區)的變體fc區中，具有在下列任何位置處的任何氨基酸修飾(例如，取代)：252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439。
在不同的實施方案中，在以增強的親和力結合fcγr(經由其fc區)的變體fc區中，具有在下列任何位置處的任何氨基酸修飾(例如，取代)：280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398或430。在不同的實施方案中，在以增強的親和力結合fcγriia的變體fc區中，具有下列殘基的任一種：a255、a256、a258、a267、a268、n268、a272、q272、a276、a280、a283、a285、a286、d286、q286、s286、a290、s290、m301、e320、m320、q320、r320、e322、a326、d326、e326、s326、k330、a331、q335、a337或a430。
在其他實施方案中，本發明涵蓋本領域中已知的任何fc變體的使用，例如在下列文獻中公開的那些：jefferis等人(2002)immunollett82:57-65；presta等人(2002)biochemsoctrans30:487-90；idusogie等人(2001)jimmunol166:2571-75；shields等人(2001)jbiolchem276:6591-6604；idusogie等人(2000)jimmunol164:4178-84；reddy等人(2000)jimmunol164:1925-33；xu等人(2000)cellimmunol200:16-26；armour等人(1999)eurjimmunol29:2613-24；jefferis等人(1996)immunollett54:101-04；lund等人(1996)jimmunol157:4963-69；hutchins等人(1995)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)92:11980-84；jefferis等人(1995)immunollett.44:111-17；lund等人(1995)fasebj9:115-19；alegre等人(1994)transplantation57:1537-43；lund等人(1992)molimmunol29:53-59；lund等人(1991)j.immunol147:2657-62；duncan等人(1988)nature332:563-64；美國專利第5,624,821號；5,885,573號；6,194,551號；7,276,586號；和7,317,091號；以及pct公布wo00/42072和pctwo99/58572。
優選的變體包括在下列任何位置處的一種或多種修飾：228、230、231、232、233、234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、271、273、275、281、284、291、296、297、298、299、302、304、305、313、323、325、326、328、330或332。
尤其優選的變體包括選自組a-ai的一種或多種修飾：
a.228e、228k、228y或228g；
b.230a、230e、230y或230g；
c.231e、231k、231y、231p或231g；
d.232e、232k、232y、232g；
e.233d；
f.234i或234f；
g.235d、235q、235p、235i或235v；
h.239d、239e、239n或239q；
i.240a、240i、240m或240t；
j.243r、243、243y、243l、243q、243w、243h或243i；
k.244h；
l.245a；
m.247g、247v或247l；
n.262a、262e、262i、262t、262e或262f；
o.263a、263i、263m或263t；
p.264f、264e、264r、264i、264a、264t或264w；
q.265f、265y、265h、265i、265l、265t、265v、265n或265q；
r.266a、266i、266m或266t；
s.271d、271e、271n、271q、271k、271r、271s、271t、271h、271a、271v、271l、271i、271f、271m、271y、271w或271g；
t.273i；
u.275l或275w；
v.281d、281k、281y或281p；
w.284e、284n、284t、284l、284y或284m；
x.291d、291e、291q、291t、291h、291i或291g；
y.299a、299d、299e、299f、299g、299h、299i、299k、299l、299m、299n、299p、299q、299r、299s、299v、299w或299y；
z.302i；
aa.304d、304n、304t、304h或304l
ab.305i；
ac.313f；
ad.323i；
ae.325a、325d、325e、325g、325h、325i、325l、325k、325r、325s、325f、325m、325t、325v、325y、325w或325p；
af.328d、328q、328k、328r、328s、328t、328v、328i、328y、328w、328p、328g、328a、328e、328f、328h、328m或328n；
ag.330l、330y、330i或330v；
ah.332a、332d、332e、332h、332n、332q、332t、332k、332r、332s、332v、332l、332f、332m、332w、332p、332g或332y；以及
ai.336e、336k或336y。
仍然更尤其優選的變體包括選自組1-105的一種或多種修飾：
效應子功能可以通過諸如抗體工程化技術領域中所述的那些技術或通過其他方法來修飾。例如，可以將半胱氨酸殘基引入fc區，從而容許此區中鏈間二硫鍵形成，導致可能具有改善的內化能力和/或增加的補體介導的細胞殺傷以及adcc的同源二聚體抗體產生。參見caron等人(1992)j.expmed.176:1191-1195；和b.shopes(1992)j.immunol.148:2918-2922。具有增強的抗腫瘤活性的同源二聚體抗體還可以使用如wolff等人(1993)cancerresearch53:2560-2565中所述的異雙功能(heterobifunctional)交聯劑制備。可選擇地，抗體可以被工程化為具有雙fc區，并且因此可以具有增強的補體裂解和adcc能力。stevenson等人(1989)anti-cancerdrugdesign3:219-230。
b2.序列修飾
一般地，序列修飾可以是抗體或多肽中一個或多個殘基的取代、缺失或添加，該取代、缺失或添加導致了與天然序列相比的氨基酸序列改變。決定哪個氨基酸殘基可以被插入、取代或缺失而不會不利地影響期望的活性的指南可以通過比較抗體或多肽的序列與同源已知的蛋白分子的序列并將在高同源性區域中進行的氨基酸序列改變數目最小化來發現。所容許的變化可以通過在序列中系統地制造氨基酸插入、缺失或取代并對所得變體測試全長或成熟的天然序列所表現的活性來確定。
氨基酸取代可以包括一個或多個殘基的保守取代或非保守取代。這種取代是本領域中熟知的，例如，保守取代需要用具有相似的結構特性和/或化學特性的另一氨基酸取代氨基酸，例如用絲氨酸取代亮氨酸。非保守取代一般需要用具有不同的結構特性和/或化學特性的另一氨基酸取代氨基酸，例如用堿性氨基酸(例如，lys或asn)取代酸性氨基酸(例如，glu或asp)。
取代變體的尤其優選的類型包括取代親本抗體(例如，人源化抗體或人抗體)的一個或多個高變區殘基以獲得與親本抗體相比具有改善的生物特性的變體抗體。產生這種取代的變體的方便方法包括使用噬菌體展示的親和力成熟。簡言之，突變幾個高變區位點以產生在各位點的所有可能的氨基酸取代，將由此產生的抗體變體在噬菌體上展示，并然后篩選噬菌體展示的變體的生物活性(例如，結合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區位點，可以進行丙氨酸掃描誘變來鑒定顯著促進抗原結合的高變區殘基。可選擇地或另外地，可能有利的是分析抗原-抗體復合體的晶體結構以鑒定抗體與其抗原之間的接觸點。這種接觸殘基和相鄰殘基是用于根據本文所闡述的技術取代的候選物。產生了這種變體后，便如本文所述將變體組進行篩選，并且選擇在一個或多個相關測定中具有優異特性的抗體用于進一步的開發。
修飾還可以包括摻入(例如，通過取代或添加)非天然氨基酸，例如通過諸如在下列文獻中描述的那些方法：例如，wang等人(2002)chem.comm.1:1-11；wang等人(2001)science292:498-500；和vanhest等人(2001)chem.comm.19:1897-1904。替代的策略關注的是負責氨酰基-trna生物合成的酶，如在例如tang等人(2001)j.am.chem.123(44):11089-11090；和kiick等人(2001)febslett.505(3):465中所描述的。
在優選的實施方案中，修飾至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50個氨基酸殘基。另外地或可選地，這種修飾可以表征為具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50個修飾的氨基酸殘基。在具體的優選實施方案中，修飾了至少1個但是不超過10個殘基。另外地或可選地，這種修飾可以表征為具有不超過15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個修飾的氨基酸殘基。修飾可以為全部取代、全部缺失、全部添加或取代、缺失或添加的任何組合。
可以通過本領域中已知的多種方法來制備編碼氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然存在的氨基酸序列變體的情況下)，或通過對較早期制備的變體或非變體形式的抗體進行寡核苷酸介導的(或定點的)誘變、限制性選擇誘變、pcr誘變和盒式誘變來制備。
b3.其他修飾
本發明的多肽變體(特別是抗體變體)包括經過通過例如任何類型的分子的共價附連而修飾的類似物和衍生物，只要這種共價附連允許抗體保留其表位結合免疫特異性即可。例如但是絕不旨在限制，抗體的衍生物和類似物包括被進一步修飾的那些，例如，通過糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、被已知保護基團/阻斷基團衍生化、蛋白水解裂解、與細胞抗體單元或其他蛋白連接等。大量化學修飾的任一種均可通過已知的技術實施，包括但不限于：特異性化學裂解、乙酰化、甲酰化、在衣霉素存在下的代謝合成等。另外，類似物或衍生物可以含有一種或多種非天然氨基酸。
抗體和多肽可以通過下列過程來修飾：將一個或多個糖基化位點引入抗體中、從抗體中缺失一個或多個糖基化位點或轉移抗體上現有的糖基化位點，所述修飾優選不改變抗體的期望功能，例如結合活性。可以通過本領域內已知的方法將糖基化位點引入抗體的可變區和/或恒定區，或從抗體的可變區/恒定區缺失。例如，可以通過修飾或突變抗體的氨基酸序列來將糖基化位點引入本發明的抗體中以便獲得期望的序列(例如，asn-x-thr/ser)，并且可以通過修飾fc區的位置296來轉移糖基化位點，使得位置296而不是位置297被糖基化。修改蛋白的碳水化合物含量(糖基化)的方法是本領域中熟知的，例如，在美國專利第6,472,511號和6,218,149號；美國專利公布第20030115614號和20020028486號；ep0359096b1；以及wo03/035835中所描述的。
在一些實施方案中，將本發明的分子工程化為包含改變的糖基化模式或改變的糖形。工程化糖形可用于多種目的，包括但不限于增強效應子功能。工程化糖形可以通過本領域技術人員已知的任何方法產生，例如通過使用工程化或變體表達菌株、通過與諸如n-乙酰葡糖氨基轉移酶iii(gnt-iii)等一種或多種酶共表達、通過在多種生物體或來自多種生物體的細胞系中表達本發明的抗體、或通過在抗體表達和純化之后修飾碳水化合物。用于產生工程化糖形的方法是本領域中已知的，并且包括但不限于在下列文獻中所述的那些：例如，okazaki等人(2004)jmb336:1239-1249；shinkawa等人(2003)jbiolchem278:3466-3473；shields等人(2002)jbiolchem277:26733-26740；davies等人(2001)biotechnolbioeng74:288-294；umana等人(1999)nat.biotechnol17:176-180；美國專利第6,602,684號；美國專利公布第20030157108號、20030115614號和20030003097號；wo02/311140；wo02/30954；wo01/292246；wo00/61739；可得自biowa,inc.(princeton,nj)的potillegenttm技術；和可得自glycartbiotechnologyag(zurich,switzerland)的glycomabtm糖基化工程技術。
b4.多肽軛合物
本發明的多肽可以與異源多肽或其部分重組融合或化學軛合(包括共價軛合和非共價軛合二者)以產生融合蛋白。優選地，本發明的多肽(尤其是抗體)與異源多肽的至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90或至少100個氨基酸融合以產生期望的融合蛋白。融合不是必須需要直接的，而是可以通過連接子序列產生。本發明的多肽還可以附連到固體支撐體或半固體基質上，固體支撐體或半固體基質特別可用于靶抗原的免疫測定或純化。這種支撐體和基質包括但不限于：玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖珠子、丙烯酰胺珠子、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。可以通過例如在methodsinenzymology(酶學中的方法),44(1976)中所描述的方法來完成附連。
可以將抗體和多肽與治療劑軛合以便修飾給定的生物反應、影響(例如，增加)治療劑的血清半衰期或將治療劑靶向特定亞類的細胞。還可以將它們與標記序列(例如，六-組氨酸肽或“flag”標簽)融合以利于純化。用于將這種治療部分與抗體軛合的技術是熟知的；參見，例如hellstrom等人,“antibodiesfordrugdelivery(用于藥物遞送的抗體)”,在controlleddrugdelivery(受控的藥物遞送)(第2版,robinson等人(編輯),1987,第623-53,marceldekker,inc.)中。
另外的融合蛋白可以通過下列技術產生：基因改組、基序改組、外顯子改組和/或密碼子改組(統稱為“dna改組”)。可以采用dna改組來改變本發明的分子的活性(例如，具有更高的親和力和更低的解離速率的抗體)。在本發明的抗體和多肽或它們的編碼核酸重組之前，可以通過易錯pcr、隨機核苷酸插入或其他方法對本發明的抗體和多肽或它們的編碼核酸重組進行隨機誘變以進一步改變它們。可以將編碼本發明的分子的多核苷酸的一個或多個部分與一種或多種異源分子的一種或多種組分、基序、區段(section)、部分、結構域、片段等重組。
b5.片段
本發明另外提供了抗體片段和其他多肽片段。這種片段在例如與全長的天然抗體或蛋白比較時可以在n-末端或c-末端被截斷或者可以缺乏內部殘基。某些片段可以缺乏對期望的生物活性不必需的氨基酸殘基。這些片段可以通過大量常規技術的任一種制備。可以化學合成期望的肽片段。可選的方法包括：通過酶促消化產生抗體或多肽片段，例如通過用已知在特定氨基酸殘基限定的位點裂解蛋白的酶處理蛋白，或通過用合適的限制性酶消化dna；并分離期望的片段。又一合適的技術包括通過聚合酶鏈式反應(pcr)分離和擴增編碼期望抗體或多肽片段的dna片段。在pcr中的5'和3'引物中采用限定dna片段的期望末端的寡核苷酸。優選地，抗體和多肽片段與本文所公開的天然抗體或多肽共同擁有至少一種生物活性和/或免疫活性。
在一些實施方案中，本發明的多肽還包含二聚化結構域，該二聚化結構域可以包含二聚化序列和/或包含一個或多個半胱氨酸殘基的序列。在一些實施方案中，二聚化結構域位于抗體重鏈或輕鏈可變結構域與病毒包膜蛋白的至少一部分之間，并且在二聚化結構域中可以存在一個或多個二硫鍵和/或單個二聚化序列以提供二價展示。在一些實施方案中，f(ab)2的重鏈將在不包括鉸鏈區的二聚化結構域二聚化。二聚化結構域可以包含亮氨酸拉鏈序列。
在另一實施方案中，本發明的多肽片段包含：另一多肽的氨基酸序列的至少5個連續氨基酸殘基、至少10個連續氨基酸殘基、至少15個連續氨基酸殘基、至少20個連續氨基酸殘基、至少25個連續氨基酸殘基、至少30個連續氨基酸殘基、至少40個連續氨基酸殘基、至少50個連續氨基酸殘基、至少60個連續氨基酸殘基、至少70個連續氨基酸殘基、至少連續的80個氨基酸殘基、至少連續的90個氨基酸殘基、至少連續的100個氨基酸殘基、至少連續的125個氨基酸殘基、至少150個連續氨基酸殘基、至少連續的175個氨基酸殘基、至少連續的200個氨基酸殘基或至少連續的250個氨基酸殘基的氨基酸序列。在具體的實施方案中，多肽的片段保留多肽的至少一種功能。
b6.雙抗體和dart
本發明還提供了雙抗體和雙親和性再導向(retargeting)劑(“dart”)。雙抗體和dart包含一般源自本發明的抗體和多肽的抗原結合結構域。雙抗體和dart的設計和構建描述于：例如2008年1月4日提交的美國臨時專利申請第61/019,051號和2007年6月21日提交的美國臨時專利申請第第60/945,523號；2006年4月17日提交的美國專利申請第11/409,339號；marvin等人(2005)actapharmacol.sin.26:649-658；olafsen等人(2004)prot.engr.des.sel.17:21-27；holliger等人(1993)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)90:6444-6448。雙抗體分子的各多肽鏈包含來自相同或不同抗體的vl結構域和vh結構域，它們共價連接以便結構域不能自組裝。兩條多肽鏈的相互作用將產生兩個vl-vh配對，從而形成兩個表位結合位點，即，二價分子。vh或vl結構域并不限定在多肽鏈內的任何位置，這兩種結構域也不限制在它們相對于彼此的位置上；僅有的限制是可得到互補的多肽鏈以形成功能雙抗體。這兩種結構域可以被肽連接子分隔，并且可以將多肽鏈功能化為在各鏈上包含至少一個半胱氨酸殘基以便可以形成鏈間二硫鍵來穩定雙抗體。
在vl和vh結構域源自相同的抗體時，兩條互補的多肽鏈可以是相同的，從而產生二價單特異性抗體；或者兩條互補的多肽鏈可以是不同的，從而產生二價雙特異性抗體(例如，結合同一抗原的兩種不同表位的抗體)。當vl和vh結構域源自對不同抗原特異性的抗體時，功能性雙特異性雙抗體的形成需要兩條不同多肽鏈之間的相互作用，即，異源二聚體的形成。在具體的實施方案中，雙抗體的至少一個表位結合位點對下列特定細胞上的抗原是特異性的：例如b細胞或t細胞、吞噬細胞、自然殺傷(nk)細胞或樹突細胞。
在多個實施方案中，雙抗體的一條或多條多肽鏈包含fc結構域。雙抗體分子的多肽鏈中的fc結構域優先地二聚化，從而導致表現出免疫球蛋白樣特性如fc-fcγr相互作用的雙抗體分子的形成。包含fc的雙抗體可以是二聚體，例如由兩條多肽鏈構成，每條包含vh結構域、vl結構域和fc結構域。在多個實施方案中，雙抗體的一條或多條多肽鏈包含鉸鏈結構域，該鉸鏈結構域可以源自任何免疫球蛋白同種型或同種異型，包括iga、igd、igg、ige和igm。在優選的實施方案中，鉸鏈結構域來源于igg，其中該igg同種型是igg1、igg2、igg3或igg4或其同種異型。可以在相對于鏈的其他結構域或部分的任何位置處將鉸鏈結構域工程化到多肽鏈中，并且在某些情況下，可以與fc結構域一起被工程化以便使雙抗體包含鉸鏈-fc結構域。
在其他實施方案中，包含fc結構域的雙抗體分子可以是四聚體，該四聚體可以包含兩條“較重”多肽鏈(即，包含vl、vh和fc結構域的多肽鏈)和兩條“較輕”多肽鏈(即，包含vl和vh的多肽鏈)。這種較輕鏈和較重鏈可以相互作用以形成單體，并且經由它們未配對的fc結構域相互作用以形成ig樣分子，該分子可以是dart分子。這種ig樣雙抗體是四價的并且可以是單特異性的、雙特異性的或四特異性的。ig樣dart物質具有獨特的特性，因為其結構域可以被設計成結合相同表位(以便形成能夠結合四個相同抗原分子的四價單表位特異性ig樣dart)或者結合不同的表位或抗原。例如，其結構域可以被設計成結合同一抗原的兩個表位(以便形成四價的單抗原特異性雙表位特異性ig樣dart)，或者結合不同的抗原分子的表位以便形成一對結合位點對第一抗原具有特異性并且第二對結合位點對第二抗原具有特異性的四價ig樣dart)。可以容易地制備具有這些屬性的組合的雜交分子。
盡管不旨在受具體作用機制的限制，但是本發明的雙抗體分子表現出與本領域中已知的治療抗體相比增強的治療功效部分是由于雙抗體免疫特異性結合以降低的水平表達特定抗原(例如，fcγr)的靶細胞的能力所致，例如，憑借雙抗體由于其雙抗體-表位相互作用的改善的親抗原性而較長時間保留在靶細胞上的能力。因此，本發明的雙抗體在治療、預防或管控其中靶抗原在靶細胞群中低水平表達的亞群體的疾病或疾患如癌癥中具有特別效用。
由于它們增加的效價、低解離速率和從循環中快速清除(對于在約50kda或低于約50kda的小尺寸雙抗體)，本領域中已知的雙抗體分子還在腫瘤成像的領域中顯示了特別用途。(fitzgerald等人(1997)proteineng.10:1221)。尤其重要的是不同細胞的交聯，例如細胞毒性t細胞與腫瘤細胞的交聯。(staerz等人(1985)nature314:628-631；holliger等人(1996)proteineng.9:299-305)。雙抗體表位結合結構域還可以指向任何免疫效應子細胞的表面決定簇，例如在t淋巴細胞、自然殺傷(nk)細胞或其他單核細胞上表達的cd3、cd16、cd32或cd64。在許多研究中，發現與效應子細胞決定簇如fcγ受體(fcγr)結合的雙抗體激活效應子細胞。(holliger等人(1996)proteineng.9:299-305；holliger等人(1999)cancerres.59:2909-2916)。通常，效應子細胞激活是由結合抗原的抗體經由fc-fcγr相互作用與效應子細胞結合而觸發的；在這個方面，本發明的雙抗體分子可以表現ig樣功能而不依賴于它們是否包含fc結構域。通過交聯腫瘤細胞與效應子細胞，雙抗體不僅將效應子細胞帶入腫瘤細胞鄰近而且還導致有效的腫瘤殺傷。cao和lam(2003)adv.drug.deliv.rev.55:171-97。
本發明的雙抗體分子可以使用多種方法來制備，包括從頭的蛋白質合成和編碼結合蛋白的核酸的重組表達。可以通過重組方法(例如，較早制備的期望多核苷酸的變體的pcr誘變)或通過固相dna合成來制備期望的核酸序列。優選使用重組表達方法。在一個方面，本發明提供包含編碼cd16avh和/或vl的序列的多核苷酸；在另一方面，本發明提供包含編碼cd32bvh和/或vl的序列的多核苷酸。由于遺傳密碼的簡并性，多種核酸序列編碼每種免疫球蛋白氨基酸序列，并且本發明包括編碼本文所述的結合蛋白的所有核酸。
b7.抗體的制備
可以通過多種方法的任一種制備或獲得本發明的優選實施方案的抗體。例如，這種抗體可以從血漿獲得、合成獲得、重組或轉基因獲得、經由細胞(例如，雜交瘤培養物)獲得等。合成蛋白的制備已經描述于：例如dawson等人(2000)ann.revbiochem.69:923-960；wilken等人(1998)curr.opin.biotechnol.9(4):412-426；和kochendoerfer等人(1999)curr.opin.chem.biol.3(6):665-671中。
重組抗體和轉基因抗體的制備已經描述于：例如，wang等人(2007)idrugs10(8):562-565；hagemeyer等人(2007)semin.thromb.hemost.33(2):185-195；rasmussen等人(2007)biotechnol.lett.29(6):845-852；gasser等人(2007)biotechnol.lett.29(2):201-212；aubrey等人(2006)j.soc.biol.200(4):345-354；laffly等人(2006)j.soc.biol.200(4):325-343；jefferis(2005)biotechnolprog.21(1):11-16；smith等人(2004)j.clin.pathol.57(9):912-917；kipriyanov等人(2004)molbiotechnol.26(1):39-60；fischer等人(2003)vaccine21(7-8):820-825；maynard等人(2000)ann.rev.biomed.eng.2:339-376；young等人(1998)res.immunol.149(6):609-610；和hudson(1998)curr.opin.biotechnol.9(4):395-402中。
經由細胞(例如，雜交瘤)培養物的抗體制備已經描述于：例如，laffly等人(2006),如上；aldington等人(2007)j.chromatogr.banalyt.technol.biomed.lifesci.848(1):64-78；s.s.farid(2006)j.chromatogr.banalyt.technol.biomed.lifesci.848(1):8-18；birch等人(2006)adv.drugdeliv.rev.58(5-6):671-685；even等人(2006)trendsbiotechnol.24(3):105-108；graumann等人(2006)biotechnol.j.1(2):164-86；美國專利第7,112,439號；以及美國專利公布第20070037216號和20040197866號中。
抗體可以經由噬菌體展示方法制備，諸如在下列文獻中公開的那些方法：例如brinkman等人(1995)j.immunol.methods182:41-50；ames等人(1995)j.immunol.methods184:177-86；kettleborough等人(1994)eur.j.immunol.24:952-58；persic等人(1997)gene187:9-18；burton等人(1994)advancesinimmunology57:191-280；pct公布wo90/02809；wo91/10737；wo92/01047；wo92/18619；wo93/11236；wo95/15982；wo95/20401；以及美國專利第5,698,426號；5,223,409號；5,403,484號；5,580,717號；5,427,908號；5,750,753號；5,821,047號；5,571,698號；5,427,908號；5,516,637號；5,780,225號；5,658,727號；5,733,743號以及5,969,108號。還可以使用噬菌體展示技術來增加抗體對其抗原的親和力。該技術稱為親和力成熟，其采用了誘變或cdr步移(cdrwalking)和再選擇，該再選擇使用關聯抗原(cognateantigen)來鑒定與初始抗體或親本抗體相比以更高的親和力結合抗原的抗體。參見，例如，glaser等人(1992)j.immunology149:3903；wu等人(1998)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)95:6037；yelton等人(1995)j.immunology155:1994；schier等人(1996)j.mol.bio.263:551。
單克隆抗體可以通過本領域技術人員已知的多種方法制備，例如下列文獻中所述的雜交瘤方法：例如kohler等人(1975)nature256:495、kozbor等人(1983)immunologytoday4:72或cole等人(1985)monoclonalantibodiesandcancertherapy(單克隆抗體和癌癥治療),alanr.liss,inc.,第77-96頁，或美國專利第4,816,567號中所述的重組dna方法；或者抗體可以使用下列文獻中所述的技術從噬菌體抗體文庫分離：例如clackson等人(1991)nature352:624-628和marks等人(1991)j.mol.biol.222:581-597。可以使用本領域中熟知的多種方法來制備所感興趣的抗原的多克隆抗體。例如，可以通過用感興趣的抗原或其衍生物注射來免疫多種宿主動物，包括但不限于：兔、綿羊、山羊、狗、小鼠、大鼠和豚鼠，并且在容許進行免疫反應之后，可以從被免疫的動物的血清中鑒定抗體。
雙特異性抗體還可以如下制備：通過例如兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達來制備，其中所述的兩對鏈具有不同的特異性，隨后使用親和色譜純化期望的分子，如milstein等人(1983)nature305:537-39、wo93/08829、traunecker等人(1991)emboj.10:3655-59中所描述的。在不同的方法中，將具有期望的結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變結構域與免疫球蛋白恒定結構域序列融合，例如與包含鉸鏈區、ch2區和ch3區的至少一部分的重鏈恒定結構域融合。可以將編碼這些融合體的核酸插入到相同的或不同的表達載體中，并在合適的宿主生物體中表達。
可以使用不能夠表達內源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因但是可以表達人重鏈和輕鏈基因的轉基因小鼠來制備全長人抗體(也稱為完全人抗體)。用所選抗原如本發明多肽的全部或一部分以正常方式免疫轉基因小鼠。轉基因小鼠所含有的人免疫球蛋白轉基因在b細胞分化期間重排，并且隨后進行類別轉換和體細胞突變。因此，使用這種技術制造治療上可用的igg、iga、igm和ige抗體是可能的。制備人抗體的這種技術的綜述描述于：例如lonberg和huszar(1995)int.rev.immunol.13:65-93和美國專利第5,633,425號中。全長人抗體還可以使用本領域中已知的其他技術來制備，包括噬菌體展示文庫，如hoogenboom和winter(1991)j.mol.biol.227:381和marks等人(1991)j.mol.biol.222:581-95中所描述的。全長人抗體還可以從例如abgenix,inc.(freemont,calif.)和genpharm(sanjose,calif.)商購獲得。可以使用被稱為“導向選擇(guidedselection)”的技術來產生識別所選表位的全長人抗體。在此方法中，使用所選的非人單克隆抗體如小鼠抗體來指導識別同一表位的完全人抗體的選擇，諸如jespers等人(1994)biotechnology12:899-903所描述的。
本發明還包括編碼包括多肽和抗體的本發明分子的多核苷酸、以及包含所述多核苷酸的載體和包含所述載體的宿主細胞。編碼本發明分子的多核苷酸的獲得和所述多核苷酸的核苷酸序列的確定可以通過本領域中已知的任何方法進行，例如，重組dna技術、定點誘變、pcr等。在一個實施方案中，可以通過本領域中已知的標準技術來篩選本領域中可用的人文庫或任何其他文庫以克隆編碼本發明分子的核酸。
b8.抗體的表征
本發明的抗體可以用多種方法表征。具體地，可以測定本發明的抗體免疫特異性結合抗原如her2/neu的能力，或者在分子包含fc結構域(或其部分)時測定表現fc-fcγr相互作用的能力，即，fc結構域(或其部分)與fcγr的特異性結合。這種測定可以在溶液中(例如，houghten(1992)bio/techniques13:412-421)、珠子上(lam(1991)nature354:82-84)、芯片上(fodor(1993)nature364:555-556)、細菌上(美國專利第5,223,409號)、孢子上(美國專利第5,571,698號；5,403,484號；和5,223,409號)、質粒上(cull等人(1992)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)89:1865-1869)或噬菌體上(scott和smith(1990)science249:386-390；devlin(1990)science249:404-406；cwirla等人(1990)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)87:6378-6382；和felici(1991)j.mol.biol.222:301-310)進行。然后可以對被鑒定為免疫特異性結合抗原的分子進行其對抗原的特異性和親和力的測定。
可用于分析免疫特異性結合、交叉反應性和fc-fcγr相互作用的免疫測定包括但不限于使用下列技術的競爭性和非競爭性測定系統：例如蛋白質印跡、放射免疫測定、elisa(酶聯免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫沉淀測定、沉淀(precipitin)反應、凝膠擴散沉淀(precipitin)反應、免疫色譜測定、免疫擴散測定、凝集測定、補體結合測定、免疫放射測定、熒光免疫測定和蛋白a免疫測定等(參見，例如ausubel等人,2008,currentprotocolsinmolecularbiology(現代分子生物學實驗方案))。
對靶抗原的結合親和力通常通過標準抗體-抗原測定來測量或確定，例如biacore競爭性測定、飽和測定或諸如elisa或ria等免疫測定。
優選地，使用采用本領域技術人員已知的任何技術的熒光激活細胞分選(facs)進行基于免疫或功能的測定以表征本發明的分子。流式分選儀能夠快速檢測被本發明的分子結合(例如調理)的大量單個細胞(例如，1千萬-1億個細胞/小時)。另外，用于優化抗體行為的特定參數包括但不限于：抗原濃度、動力學競爭時間或facs嚴緊性，可以改變它們的每一個以便選擇表現出特異性結合特性的抗體分子。用于分選和檢測生物細胞的流式細胞儀是本領域中熟知的。已知的流式細胞儀描述于：例如美國專利第4,347,935號；5,464,581號；5,483,469號；5,602,039號；5,643,796號；和6,211,477號中。其他已知的流式細胞儀是bectondickinsonandcompany出售的facsvantagetm和unionbiometrica出售的copastm系統。
可以使用基于表面等離子體共振的測定來表征抗原結合結構域或fc-fcγr結合的動力學參數。可以使用本領域技術人員已知的任何方法，例如，在下列文獻中所描述的：例如dong等人(2002)reviewinmol.biotech.82:303-323；mullet等人(2000)methods22:77-91；rich等人(2000)currentopinioninbiotechnology11:54-61；fivash等人(1998)currentopinioninbiotechnology9:97-101；以及美國專利第6,373,577號；6,289,286號；5,322,798號；5,341,215號；和6,268,125號。使用數據繪制結合曲線并確定速率常數，例如，kon、koff和表觀平衡結合常數kd，例如在下列文獻中所描述的，例如myszka(1997)currentopinioninbiotechnology8:50-57；o’shannessy等人(1996)analyticalbiochemistry236:275-283；morton等人(1995)analyticalbiochemistry227:176-185；fisher等人(1994)currentopinioninbiotechnology5:389-95；o’shannessy(1994)currentopinioninbiotechnology5:65-71；和chaiken等人(1992)analyticalbiochemistry201:197-210。在優選的實施方案中，使用spr分析確定的動力學參數可以用作分子如何在功能測定(如adcc)中起作用的預測性量度。
包含fc結構域(或其部分)和/或包含對fcγr特異性的表位結合結構域的分子與fcγr結合的表征可以根據抗體工程化技術領域中所描述的方法進行。用于效應子細胞功能的測定是熟知的，例如在下列文獻中所描述的：abdul-majid等人(2002)scand.j.immunol.55:70-81；perussia等人(2000)methodsmol.biol.121:179-192；lehmann等人(2000)j.immunol.methods243(1-2):229-242；ding等人(1998)immunity8:403-411；baggiolini等人(1998)experientia44(10):841-848；brown(1994)methodscellbiol.45:147-164；和munn等人(1990)j.exp.med.172:231-237。
例如，可以如下進行fcγr介導的吞噬作用的測定：使用人單核細胞，通過先前在tridandapani等人(2000)j.biol.chem.275:20480-20487中所描述的方法測量thp-1細胞吞噬熒光素化的igg調理的綿羊紅細胞(srbc)的能力；或使用抗體依賴性調理吞噬測定(adcp)，如bedzyk等人(1989)j.biol.chem.264(3):1565-1569所描述的。可以使用本領域技術人員已知的標準方法來表征包含fc結構域(或其部分)的本發明分子與c1q的結合和對補體依賴性細胞毒性(cdc)的介導。例如，為確定c1q結合，可以進行結合c1q的elisa；為估計補體激活，可以進行補體依賴性細胞毒性(cdc)測定，例如在gazzano-santoro等人(1996)j.immunol.methods202:163中所描述的。
在另一實施方案中，可以使用本領域技術人員已知的任何標準方法來測定本發明的分子在效應子細胞如自然殺傷細胞中的fcγr-介導的adcc活性，并且這些方法描述于：例如weng等人(2003)j.clin.oncol.21:3940-3947；perussia等人(2000)methodsmol.biol.121:179-192；ding等人(1998)immunity8:403-411中。在具體的優選實施方案中，使用時間分辨熒光測定來測量對熒光標記的靶細胞的adcc活性，如在例如blomberg等人(1996)journalofimmunologicalmethods193:199-206中所描述的。用于本發明的adcc測定的靶細胞包括但不限于：乳癌細胞系，例如atcc登錄號為htb-30的sk-br-3(tremp等人(1976)cancerres.33-41)；b淋巴細胞；來源于伯基特淋巴瘤的細胞，例如atcc登錄號為ccl-86的raji細胞(epstein等人(1965)j.natl.cancerinst.34:231-240)；和atcc登錄號為ccl-213的daudi細胞(klein等人(1968)cancerres.28:1300-1310)。靶細胞必須被待測定的分子的抗原結合位點識別。優選地，用于本發明的adcc測定的效應子細胞是外周血單核細胞(pbmc)，其優選是使用本領域技術人員已知的標準方法從正常的人血純化的，例如使用ficoll-paque密度梯度離心。
c.治療方法&藥物組合物
本發明組合物(例如，抗體和多肽)的施用可以用于“預防性”或“治療性”目的，或者可選擇地可用于診斷目的。如果施用的量對于提供對實際表現的疾病的治療是生理上顯著的，則認為本發明的組合物是為“治療性”目的施用的。當治療性提供時，化合物優選在鑒定實際疾病癥狀時(或其后不久)提供。化合物的治療性施用用于減輕這種疾病的嚴重程度或逆轉其進展。如果施用的量對于提供對可能疾病或病癥的治療是生理上顯著的，則認為本發明的組合物是為“預防性”目的施用的。當預防性提供時，化合物優選在其任何癥狀之前提供。化合物的預防性施用用于防止或減輕疾病的任何后續進展或復發。
提供治療(therapy)或“治療(treating)”是指在損傷、病理或病癥的治療或改善方面的任何成功跡象，包括任何客觀參數或主觀參數，例如癥狀的減輕、減緩、減少；或使患者對損傷、病理或病癥更加耐受；減緩退化或衰弱的速率；使退化的終點不太衰弱；或改善患者的身體或精神健康。癥狀的治療或改善可以基于客觀參數或主觀參數，包括身體檢查、神經精神檢測和/或精神病學評定的結果。
治療的優選受治療者包括經受疾病和其他病理狀態的動物，最優選哺乳動物物種例如人或其他靈長類；和家畜，例如狗、貓以及類似動物。“患者”是指受治療者，優選哺乳動物(包括人)。
本發明的某些實施方案涉及包含一種或多種治療劑的藥物組合物和施用治療有效量的一種或多種治療劑的方法，所述一種或多種治療劑能夠預防性和/或治療性地治療疾患。術語“治療劑”是指對預防性或治療性治療疾患具有治療作用的任何藥劑。示例性治療劑包括本發明的抗體和多肽以及可以與抗體或多肽組合施用或軛合的其他治療劑。在優選的實施方案中，治療劑是本發明的抗體，并且優選是抗體片段、雙抗體、ig樣dart或融合蛋白。
本發明的分子尤其可用于治療和/或預防其中期望fcγr介導的效應子細胞功能(例如，adcc)的疾病、疾患或感染(例如，癌癥、傳染病)。例如，本發明的分子可以結合免疫效應子細胞(例如，nk細胞)上的細胞表面抗原和fcγr(例如，fcγriiia)，刺激針對所述細胞的效應子功能(例如，adcc、cdc、吞噬作用、調理作用等)。在一些實施方案中，本發明的抗體和多肽特別適于治療癌癥。標準單克隆抗體治療的功效取決于受治療者的fcγr多態性。carton等人(2002)blood99:754-758；weng等人(2003)jclinoncol.21(21):3940-3947。這些受體在效應子細胞表面上表達并介導adcc。高親和力等位基因改善效應子細胞介導adcc的能力。本發明的抗體和多肽可以包含表現出對效應子細胞上的fcγr親和力增強(相對于野生型fc結構域)的變體fc結構域，因此為患者提供了更好的免疫治療劑而與他們的fcγr多態性無關。
對于診斷目的，抗體或多肽可以與可檢測物質偶聯以便使它們可用于例如監測疾病、疾患或感染的發展或進展。可檢測物質的實例包括多種酶(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶等)、輔基(例如，抗生物素蛋白/生物素)、熒光材料(例如，傘形酮、熒光素或藻紅蛋白)、發光材料(例如，魯米諾)、生物發光材料(例如，螢光素酶或水母發光蛋白)、放射活性材料(例如，碳-14、錳-54、鍶-85或鋅-65)、正電子發射金屬和非放射活性的順磁性金屬離子。可檢測物質可以使用本領域中已知的技術直接與本發明的分子偶聯或軛合或通過中間物(例如，連接子)間接偶聯或軛合。
c1.可治療的疾患
可以通過本發明的多個實施方案治療的示例性疾患包括但不限于增殖性疾患、細胞增殖性疾患和癌癥、自身免疫疾病、炎性疾患以及傳染病。在多個實施方案中，本發明涵蓋用于治療、預防或管控受治療者的疾病或疾患的方法和組合物，包括向受治療者施用治療有效量的結合疾病抗原的一種或多種分子(抗體或多肽)。例如，本發明的分子尤其可用于預防、抑制、減輕原發性腫瘤的生長或退化、癌細胞的轉移和傳染病。盡管不旨在受具體作用機制限制，但是本發明的分子介導導致腫瘤清除、腫瘤減小或其組合的效應子功能。在可選的實施方案中，本發明的雙抗體通過細胞表面抗原和/或受體的交聯和增強的凋亡或負生長調節信號傳導而介導治療活性。
對fcγriib具有降低的親和力并且對fcγriiia和/或fcγriia具有增加的親和力的抗體可以導致在fcγr結合后增強的激活反應，并且因此對治療和/或預防癌癥具有治療功效。可以通過本文的方法治療的癌癥的非限制性實例包括：急性髓細胞性淋巴瘤、腎上腺癌、腺癌、基底癌、膀胱癌、骨癌、骨和結締組織肉瘤、腦癌、乳癌、支氣管癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病(chronicmyelogenousleukemia)、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、眼癌、輸卵管癌、膽囊癌、胃腸癌、膠質瘤、毛細胞性白血病、肝細胞瘤、霍奇金病、肝內膽管癌、關節癌、卡波濟氏肉瘤、腎癌、喉癌、肝癌、白血病、肺癌、成淋巴細胞白血病、淋巴瘤、惡性間皮瘤、成神經管細胞瘤(medullobastoma)、黑素瘤、間皮瘤、中耳癌、多發性骨髓瘤、骨髓瘤、粘液肉瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、成神經細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、鼻癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、陰莖癌(penalcancer)、腹膜癌、咽癌、垂體腺癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、唾液腺癌、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、泌尿系癌、子宮癌、陰道癌、前庭癌(vesticularcancer)、外陰癌和維爾姆斯瘤。
在一些實施方案中，癌癥是造血性癌癥或血液相關的癌癥，例如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、惡性淋巴瘤、脾臟癌癥和淋巴結癌癥。在優選的實施方案中，癌癥是b細胞相關的癌癥，諸如高、中或低級淋巴瘤(包括b細胞淋巴瘤，例如伯基特淋巴瘤、彌散性大細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、粘膜相關淋巴組織b細胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤；和t細胞淋巴瘤)和白血病(包括諸如b細胞白血病(cd5+b淋巴細胞)等慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病、諸如急性成淋巴細胞白血病等淋巴性白血病、脊髓發育不良、諸如急性髓細胞性白血病等髓細胞性白血病和繼發性白血病)；多發性骨髓瘤，例如漿細胞惡性腫瘤；以及其他造血性癌癥或者b細胞或t細胞相關的癌癥。其他示例性癌癥是包括下列的其他造血細胞的癌癥：多形核白細胞，例如嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞；以及單核細胞；樹突細胞；血小板；紅細胞和自然殺傷細胞。
在一些實施方案中，待治療的癌癥是乳癌、前列腺癌、子宮癌、卵巢癌、結腸癌、子宮內膜癌、腎上腺癌或非小細胞肺癌。在一些實施方案中，癌癥是乳癌或前列腺癌。在一些實施方案中，癌癥是其中her2/neu過表達的癌癥。在特定的實施方案中，與不存在本發明的抗體或多肽時的癌細胞的生長相比，本發明的抗體或多肽將癌細胞生長抑制或減少至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％。
對fcγriib具有增加的親和力并且對fcγriiia和/或fcγriia具有降低的親和力的抗體可以導致在fcγr結合后減少的激活反應并且因此對治療和/或預防炎癥和自身免疫疾病具有治療功效。可以通過本文的方法制備的自身免疫疾患的實例包括但不限于：斑禿(alopeciaareata)、強直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性阿狄森病、腎上腺自身免疫疾病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、自身免疫性血小板減少癥、貝切特氏病、大皰性類天皰瘡、心肌病、口炎性腹瀉-皮炎、慢性疲勞性免疫功能障礙綜合征(cfids)、慢性炎性脫髓鞘性多神經病、丘-施二氏綜合征、疤痕性類天皰瘡、crest綜合征、冷凝集素疾病、克羅恩病、盤狀狼瘡、特發性混合性冷球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、腎小球腎炎、格雷夫斯氏病、格林-巴利病、橋本氏甲狀腺炎、特發性肺纖維化、特發性血小板減少性紫癜(itp)、iga腎病(neuropathy)、幼年型關節炎、扁平苔蘚(lichenplanus)、紅斑狼瘡(lupuserthematosus)、梅尼埃病、混合性結締組織病、多發性硬化、重癥肌無力、尋常型天皰瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎(polychrondritis)、多腺性綜合征、風濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原發性無丙種球蛋白血癥、原發性膽汁性肝硬化、銀屑病、銀屑病關節炎、雷諾氏現象(raynauld'sphenomenon)、萊特爾氏綜合征、類風濕性關節炎、結節病、硬皮病、舍格倫綜合征、僵人綜合征、系統性紅斑狼瘡、大動脈炎、顳動脈炎(temporalarteristis)/巨細胞動脈炎、1型或免疫介導的糖尿病、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、血管炎如皰疹樣皮炎性血管炎(dermatitisherpetiformisvasculitis)、白癜風和韋格納氏肉芽腫病。
可以通過本文的方法治療的炎性疾患的非限制性實例包括免疫介導的炎性疾患(imid)，它是由抗原特異性病理免疫反應引起和維持的炎性病癥。在這些疾患中尤其是多種類型的變應性疾病，如哮喘、枯草熱和蕁麻疹；關節炎，如骨關節炎和類風濕性關節炎；慢性炎癥；慢性阻塞性肺疾患(copd)；結締組織疾患；纖維化；移植排斥和移植物抗宿主疾病；炎性腸病(例如，克羅恩病和潰瘍性結腸炎)；炎性骨質溶解；胰島素依賴性糖尿病；肺纖維化；視網膜炎；未分化關節病；未分化脊椎關節病和葡萄膜炎。包含對fcγriib特異性的至少一個表位結合結構域和/或對fcγriib的親和力增強并且對fcγriiia的親和力降低的變體fc結構域的本發明分子還可以用于預防移植排斥。
與不接受本發明的抗炎性多肽的動物的炎癥相比，本發明的抗炎性多肽將優選將動物的炎癥降低至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、或至少10％。
在某些實施方案中，本發明的多肽對傳染原是有毒的，與不存在所述分子時的免疫反應相比，其增強抗所述傳染原的免疫反應或增強抗所述傳染原的效應子功能。可以通過本發明的分子治療或預防的傳染病是由傳染原引起的，所述傳染原包括但不限于：細菌、真菌、原生動物和病毒。非限制性的示例性細菌疾病包括由下列細菌引起的那些：炭疽芽孢桿菌(bacillusantracis)(炭疽)、博氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)(萊姆病)、念珠菌屬(candida)、衣原體、霍亂、白喉、大腸桿菌(e.coli)、糞腸球菌(enterococcusfaecials)、幽門螺旋菌(heliobacterpylori)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)、軍團桿菌屬(legionella)、分支桿菌屬(mycobacterium)、支原體、奈瑟氏菌屬(neisseria)、百日咳、鼠疫、普通變型桿菌(proteusvulgaris)、綠膿假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、肺炎球菌(s.pneumonia)、沙門氏菌屬(salmonella)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)和破傷風。非限制性原生動物疾病包括由kokzidioa、利什曼原蟲、瘧疾(malaria)或錐蟲引起的那些。
病毒性疾病的非限制性實例包括由下列病毒引起的那些：腺病毒、蟲媒病毒、冠狀病毒、柯薩奇病毒、巨細胞病毒、埃博拉、棘狀病毒、艾柯病毒、內毒素(lps)、腸道病毒、埃巴病毒、肝炎病毒(例如，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、鼠肝炎)、皰疹病毒(例如，i型單純皰疹病毒(hsv-i)、ii型單純皰疹病毒(hsv-ii)、鼠γ皰疹病毒)、i型人免疫缺陷病毒(hiv-i)、ii型人免疫缺陷病毒(hiv-ii)、漢坦病毒(huntavirus)、流感病毒、白血病病毒(例如，鼠白血病、貓白血病等)；麻疹病毒、腮腺炎病毒、乳頭瘤病毒、乳多泡病毒、脊髓灰質炎病毒、呼吸道合胞病毒、反轉錄病毒、鼻病毒、牛疫病毒、輪狀病毒、風疹病毒、天花、t細胞親淋巴病毒1、牛痘(vaccinia)、水痘(varicella)和諸如病毒性腦膜炎、腦炎或登革熱等病毒性疾病的傳染原。
c2.制劑
藥物組合物可以根據用于制備藥學上可用的組合物的已知方法配制，并且可以包含藥學上可接受的載體和/或賦形劑。組合物可以為任何合適的形式，例如，片劑、丸劑、粉劑、錠劑、囊劑、扁囊劑、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、氣霧劑(作為固體或在液體介質中)、含有例如最多按重量計10％的活性化合物的軟膏、軟明膠和硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射溶液以及無菌包裝粉末，僅列出了幾種非限制性的可選項。這種組合物可以通過任何已知的方法制備，例如通過在無菌條件下將活性成分與載體或賦形劑混合。
還可以通過采用本領域中已知的方案配制活性成分以便施用給患者之后提供活性成分的快速釋放、持續釋放或緩慢釋放。本發明組合物的物理特征和化學特征可以依據施用模式和待治療的具體疾病或疾患根據本領域的技術修飾或優化。組合物可以以單位劑型、密封容器或作為藥盒的一部分提供，藥盒可以包含使用說明書和/或多個單位劑型。
在具體的實施方案中，可以通過下列方法將治療劑摻入到組合物中：例如，在脂質體、微粒、微膠囊中封裝、能夠表達抗體或融合蛋白的重組細胞、受體介導的內吞作用(參見，例如wu和wu(1987)j.biol.chem.262:4429-4432)、構建作為反轉錄病毒或其他載體的一部分的核酸等。在另一具體實施方案中，治療劑以干燥的無菌凍干粉末或無水濃縮物在緊密密封的容器中提供，并且可以用水或鹽水將其重構成施用給受治療者的適當濃度。
優選地，治療劑作為干燥的無菌凍干粉末在緊密密封的容器中以下列單位劑量提供：至少5mg，更優選至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg或至少75mg。凍干粉末應在2℃與8℃之間儲存在其原始容器中，并且分子應在重構之后的12小時內，優選6小時內、5小時內、3小時內或1小時內腸胃外地施用。在可選的實施方案中，治療劑以在緊密密封的容器中的液體形式提供，該緊密密封的容器標出了治療劑的量和濃度。優選地，液體形式在緊密密封的容器中以至少1mg/ml，更優選至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少150mg/ml、至少200mg/ml分子提供。
c3.藥盒
組合物還可以包含在藥盒中。藥盒可以在非限制性方面包含：包含治療劑的藥物組合物、施用說明書和/或其他組分。在優選的實施方案中，藥盒可以包含即刻施用的組合物。藥盒的容器可以包括瓶、分配器、包裝、隔室或組分可放置于其中的其他類型的容器。容器可以在其表面包括標記。標記可以是例如字、短語、縮寫、圖片或符號。容器可以分配預定量的組分(例如，本發明的組合物)。組合物可以以噴霧、氣溶膠或以液體形式或半固體形式分配。容器可以具有噴霧、泵和擠壓機構。在某些方面，藥盒可以包含用于施用本發明組合物的注射器。
在藥盒中具有不止一種組分(它們可以包裝在一起)時，藥盒一般還將含有額外的組分可以單獨放置于其中的第二、第三或其他額外的容器。本發明的藥盒還可以包含嚴緊密封的容納組分的容器外殼以供商業銷售。這種容器可以包括注塑成型或吹塑成型的塑料容器，在該塑料容器中保存期望的瓶、分配器或包裝。藥盒還可以包括應用藥盒組件以及使用任何其他組合物、化合物、藥劑、活性成分或藥盒中未包含的物品的說明書。說明書可以包括可以實施的變型。說明書可以包括例如如何應用、使用和維持產品或組合物的解釋。
c4.施用和劑量
本發明組合物的多種施用途徑是可用的。所選的具體模式當然將取決于所選的具體治療劑、施用是用于疾病的預防、診斷還是治療、被治療的醫學疾患的嚴重程度以及治療功效所需的劑量。可以使用醫學上可接受的并且產生有效水平的活性化合物而不引起臨床上不可接受的不利影響的任何施用模式來實踐本發明的方法。這種施用模式包括但不限于：口服、含服、舌下、吸入、經粘膜、直腸、鼻內、局部、眼部、眼周、眼內、經皮、皮下、動脈內、靜脈內、肌內、腸胃外或輸注方法。在具體的實施方案中，可能期望的是將本發明的藥物組合物局部施用于需要治療的區域；這可以通過例如但絕不限于通過注射或借助于植入物的局部輸注達成，所述植入物是多孔的、非多孔的或凝膠狀的材料，包括膜，如硅橡膠(sialastic)膜或纖維。
如本文所用的術語“治療有效量”意指藥物組合物或方法足以顯示出有意義的患者有益效果的各活性組分的總量，所述有益效果即，慢性病癥的治愈或改善、癥狀的減少、這種病癥治愈速率的增加或在治療組織或周圍組織中某種物質水平的可檢測的改變。當應用于單獨施用的單個活性成分時，該術語是指該單獨的成分。當組合應用時，該術語是指組合施用、連續施用或同時施用導致治療效果的各活性成分的組合量。
對治療和預防用途有效的劑量日程和量即“給藥方案”將取決于多種因素，包括疾病或病癥的階段、疾病或病癥的嚴重程度、患者的總體健康狀態和患者的身體狀況、年齡和類似因素。可以通過標準的藥物、藥理和毒理方案在細胞培養物或實驗動物中確定組合物的治療功效和毒性。例如，存在確定ed50(在群體的50％中治療有效的劑量)和ld50(對群體的50％致死的劑量)的大量方法。治療效果和毒性效果之間的劑量比率是治療指數，并且它可以表示為比率ed50/ld50。優選表現高的治療指數的組合物。由細胞培養測定或動物研究獲得的數據可用于配制一系列的人使用劑量。該劑量優選在包括ed50的具有極小的毒性或沒有毒性的濃度范圍內，并且可以依據所采用的劑型、患者敏感性和施用途徑而在此范圍內變化。
劑量方案還考慮本領域內熟知的藥代動力學參數，即，吸收速率、生物可用性、代謝、清除和類似參數(參見，例如，hidalgo-aragones(1996)j.steroidbiochem.mol.biol.58:611-617；groning(1996)pharmazie51:337-341；fotherby(1996)contraception54:59-69；johnson(1995)j.pharm.sci.84:1144-1146；rohatagi(1995)pharmazie50:610-613；brophy(1983)eur.j.clin.pharmacol.24:103-108；最新版的remington(雷明頓),如上)。現有技術使得臨床醫師能夠對各單獨的患者、治療劑和所治療的疾病確定劑量方案。本發明組合物的單次或多次施用可以依據所需的劑量和頻率和患者的耐受來施用。預防性治療和治療性治療的持續時間將依據所治療的具體疾病或病癥而變化。一些疾病使得它們需要急性治療，而其他的疾病則需要長期治療。如果施用不是基于每天進行的，例如，如果注射是每隔幾天、每隔幾周或每隔幾個月給予的，那么在每次施用中可以包括更多的治療劑，以便藥劑每天釋放的量足以滿足治療需要。
在優選的實施方案中，本發明的治療劑以節律性(metronomic)給藥方案通過連續輸注或頻繁施用而不延長休息期(restperiod)施用。這種節律性施用可以包括以恒定間隔而沒有休息期的給藥。通常以較低的劑量使用治療劑，尤其是細胞毒性劑。這種給藥方案涵蓋在延長的時間期內相對較低劑量的慢性每日施用，這種施用可以最小化毒副作用并消除休息期。kamat等人(2007)cancerresearch67:281-88。在某些實施方案中，治療劑通過在下列時間范圍內的慢性低劑量或連續輸注遞送：約24小時至約2天、至約1周、至約2周、至約3周至約1個月至約2個月、至約3個月、至約4個月、至約5個月、至約6個月。這種劑量方案的安排可以由熟練的腫瘤學家優化。
對于本發明所涵蓋的抗體，施用給患者的劑量通常為0.0001mg/kg至100mg/kg患者體重。優選地，施用給患者的劑量為0.0001mg/kg患者體重與20mg/kg患者體重之間、0.0001mg/kg患者體重與10mg/kg患者體重之間、0.0001mg/kg患者體重與5mg/kg患者體重之間、0.0001與2mg/kg患者體重之間、0.0001與1mg/kg患者體重之間、0.0001mg/kg患者體重與0.75mg/kg患者體重之間、0.0001mg/kg患者體重與0.5mg/kg患者體重之間、0.0001mg/kg患者體重至0.25mg/kg患者體重之間、0.0001至0.15mg/kg患者體重之間、0.0001至0.10mg/kg患者體重之間、0.001至0.5mg/kg患者體重之間、0.01至0.25mg/kg患者體重或0.01至0.10mg/kg患者體重之間。施用的劑量和頻率可以通過諸如脂化等修飾增強抗體的攝取和組織滲透來降低或改變。在一個實施方案中，施用給患者的抗體劑量在用作單藥劑治療時為0.01mg至1000mg/天。在另一實施方案中，抗體與其他治療組合物組合使用，并且施用給患者的劑量低于所述分子用作單藥劑治療時的劑量。在優選的實例中，用在約0.1至30mg/kg體重之間的范圍內的抗體每周一次治療受治療者持續約1至10周、優選2至8周、更優選約3至7周并且甚至更優選約4周、5周或6周。
c5.組合治療
本發明還涵蓋與本領域技術人員已知的用于治療或預防癌癥、自身免疫疾病、炎癥或傳染病的其他治療組合施用本發明的抗體或多肽，所述其他治療包括但不限于：當前的標準的和實驗性化療、激素治療、生物治療、免疫治療、放射治療或手術。在一些實施方案中，本發明的抗體或多肽可以與治療有效量或預防有效量的本領域技術人員已知的用于治療和/或預防癌癥、自身免疫疾病、傳染病或中毒的一種或多種治療劑組合施用。
如本文所用，術語“組合”是指使用不止一種治療劑。術語“組合”的使用并不限制治療劑施用給患疾患的受治療者的順序，也不是意指藥劑準確地在同一時間施用，而是意指本發明的抗體或多肽與其他藥劑以某一順序并且在某一時間間隔內施用給哺乳動物，以便使本發明的抗體或多肽可以與其他藥劑一起作用從而提供比它們以其他方式施用增加的有益效果。例如，各治療劑(例如，化療、放射治療、激素治療或生物治療)可以在同一時間施用或者在不同的時間點以任何順序順序地施用；然而，如果不在同一時間施用，則他們應在足夠接近的時間施用以便提供期望的治療或預防效果。各治療劑可以以任何適當的形式并且通過任何合適的途徑單獨施用，例如一種通過口服途徑，另一種通過腸胃外途徑。
在多個實施方案中，第一治療劑可以在將第二(或后續)治療劑施用給患疾患的受治療者之前(例如，5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同時或之后(例如，5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用。在優選的實施方案中，兩種或更多種藥劑在同一患者隨訪中施用，或在不超過12小時的間隔、不超過24小時的間隔或不超過48小時的間隔內施用。
在某些實施方案中，將治療劑循環施用給受治療者。循環治療包括施用第一藥劑一段時間，然后施用第二藥劑和/或第三藥劑一段時間并重復這種順序施用。循環治療可以降低對一種或多種治療發展抗性，避免或降低治療之一的副作用和/或改善治療的功效。示例性的循環是約每周一次、約每10天一次、約每兩周一次以及約每3周一次。各循環可以包含至少一周的休息、至少2周的休息、至少3周的休息。所施用的循環數是約1至約12個循環，更通常約2至約10個循環，并且更通常約2至約8個循環。
在治療細胞增殖性疾患的實施方案中，本發明的抗體或多肽與另一治療劑軛合或與另一治療劑組合施用，所述另一治療劑例如但不限于：烷化劑(例如，氮芥或順鉑)、血管發生抑制劑、蒽環類抗生素(例如，柔紅霉素/道諾霉素或多柔比星)、抗生素(例如，放線菌素d、博來霉素或安曲霉素)、抗體(例如，抗-vegf抗體如貝伐單抗(由genentech,inc.以
合適的血管發生抑制劑的非限制性實例包括：abt-627；血管他丁(纖溶酶原片段)；血管發生酶(angiozyme)；抗血管發生的抗凝血酶iii；bay12-9566；氟草胺；貝伐單抗；bms-275291；二膦酸鹽；軟骨衍生抑制劑(cdi)；cai；cd59補體片段；cep-7055；col3；考布他汀a-4；內皮他丁(xviii型膠原片段)；法呢基轉移酶抑制劑(fti)；纖連蛋白片段；gro-β；鹵夫酮；肝素酶；肝素己糖片段；hmv833；人絨毛膜促性腺激素(hcg)；im-862；干擾素α/β/γ；干擾素誘導蛋白(ip-10)；白細胞介素-12；kringle5(纖溶酶原片段)；馬立馬司他；金屬蛋白酶抑制劑(timp)；2-甲氧雌二醇；mmi270(cgs27023a)；moabimc-1c11；新伐司他；nm-3；panzem；pi-88；胎盤核糖核酸酶抑制劑；纖溶酶原激活物抑制劑；血小板因子-4(pf4)；普啉司他；催乳素16kda片段；增殖素相關蛋白(prp)；ptk787/zk222594；類視黃醇；索利司他；角鯊胺；ss3304；su5416；su6668；su11248；四氫皮質醇-s；四硫鉬酸鹽；沙利度胺；血小板反應蛋白-1(tsp-1)；tnp-470；轉化生長因子-β(tgf-b)；血管抑制素(vasculostatin)；血管形成抑制素(鈣網織蛋白片段)；zd6126；和zd6474。
治療細胞增殖性疾患的其他抗體的非限制性實例包括下列物質的抗體：17-1a、αvβ3、afp、cd3、cd18、cd20、cd22、cd33、cd44、cd52、cea、ctla-4、dna-結合蛋白、egf受體、ep-cam、gd2-神經節苷脂、gpiiib/iiia、gp72、her2、hla-dr10β、hla-dr抗原、ige、神經節苷脂gd3、muc-1、nuc242、pem抗原、sk-1抗原、腫瘤抗原ca125、腫瘤抗原muc1、vegf和vegf-受體。
在不同的實施方案中，本發明的抗體或多肽可以與用于治療炎性疾患的治療劑組合施用，所述治療劑例如但不限于：抗體、抗膽堿能藥劑(anticholingericagent)、β-激動劑、甲基黃嘌呤、非類固醇抗炎藥(nsaid)(例如，阿司匹林、布洛芬、塞來考昔或雙氯芬酸)和類固醇抗炎藥(例如，糖皮質激素、地塞米松、可的松、潑尼松或類花生酸)。其他抗體可以是用于治療炎性疾病的任何合適的抗體，例如但不限于下列物質的抗體：α4β7、β2-整聯蛋白、cbl、cd2、cd3、cd4、cd11a、cd11/18、cd14、cd18、cd23、cd25、cd40l、cd64(fcr)、cd80、cd147、補體(c5)、e-選擇素、vii因子、gpiibiiia、icam-3、ige、il-4、il-5、il-8、tnf-α和vla-4。
在又一實施方案中，本發明的抗體或多肽可以與用于治療自身免疫疾患的治療劑組合施用，所述治療劑例如但是不限于：抗體、布喹那、環磷酰胺、環孢霉素a、細胞因子受體調節劑、脫氧精胍菌素、來氟米特、大環內酯類抗生素、丙二腈酰胺(malononitriloamindes)(例如，來氟米特(leflunamide))、氨甲喋呤(methothrexate)、甲潑尼龍、咪唑立賓、麥考酚酸莫酯、雷帕霉素(西羅莫司)、類固醇和t細胞受體調節劑。其他的抗體可以是用于治療自身免疫疾患的任何合適抗體，并且非限制性實例包括下列物質的抗體：a4b7整聯蛋白受體、cbl抗原、cd2、cd4、cd23、cd40、cd80、fcri、γ干擾素、il-8、肌苷一磷酸脫氫酶、ice白細胞介素-1β、p38map激酶和tnf。
在又一實施方案中，本發明的抗體或多肽可以與用于治療傳染病的治療劑組合施用，所述治療劑例如但不限于：抗生素、抗真菌劑或抗病毒劑。可以與本發明的分子組合使用的抗生素包括但不限于：2,4二氨基嘧啶類(例如，溴莫普林)、氨基糖苷類(例如，安普霉素、新霉素或大觀霉素)、酰胺醇類(例如，氯霉素)、安福霉素類、安沙霉素類(例如，利福米特和利福平)、桿菌肽類、碳頭孢烯類(例如，氯碳頭孢)、碳青霉烯類(例如，比阿培南和亞胺培南)、頭孢菌素類(例如，頭孢氨芐或頭孢羥氨芐)、頭霉素類(例如，頭孢拉宗、頭孢美唑、和頭孢米諾)、克拉霉素類、紅霉素類、林可酰胺類(例如，克林霉素和林可霉素)、大環內酯類(例如，妥布霉素)、單酰胺菌素類(例如，卡蘆莫南)、硝基呋喃類(例如，呋喃他酮、和呋唑氯銨)、氧頭孢烯類(例如，氟氧頭孢和拉氧頭孢)、青霉素類、喹諾酮類(例如，氧氟沙星或環丙沙星)、磺胺類(例如，芐磺胺、和磺胺乙胞嘧啶)、砜類(例如，地百里砜、葡萄糖氨苯砜鈉和苯丙砜)、和四環素類(例如，阿哌環素和金霉素)。
可以與本發明的分子組合使用的抗真菌劑包括但不限于：兩性霉素b、布康唑、環吡酮、克霉唑、益康唑、氟康唑、氟胞嘧啶、灰黃霉素(griseofuldin)、鹵普羅近(haloprogrin)、鞘內(intrathecal)、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑、萘替芬、制霉菌素、特比萘芬、特康唑、噻康唑和十一烯酸酯。可以與本發明的分子組合使用的可用抗病毒劑包括但不限于：非核苷反轉錄酶抑制劑、核苷類似物、核苷反轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。這類藥劑的非限制性實例是阿昔洛維、阿德福韋、α干擾素、金剛烷胺、安潑那韋、克來夫定(clevadine)、恩替卡韋、膦甲酸、更昔洛韋(gangcyclovir)、碘苷、茚地那韋、洛匹那韋、普來可那立、利巴韋林、金剛乙胺、利托那韋、沙奎那韋、曲氟尿苷、阿糖腺苷和齊多夫定。
c6.治療效用證明
本發明的藥物組合物、預防劑或治療劑在用于人之前優選在體外、細胞培養系統中和動物模型生物體(例如嚙齒動物模型系統)中進行期望的治療活性的測試。例如，可用于確定是否期望特定藥物組合物施用的測定包括細胞培養測定，其中患者組織樣品在培養物中生長，并且暴露于或以其它方式接觸本發明的藥物組合物，并且觀察這種組合物對組織樣品的作用。可以通過患者的活組織檢查獲得組織樣品。這種測試容許鑒定對每個單獨的患者治療最有效的預防性或治療性分子。在多個具體實施方案中，用參與自身免疫或炎性疾患的細胞類型的代表性細胞(例如，t細胞)進行體外測定以確定本發明的藥物組合物對這種細胞類型是否具有期望的作用。
合適的動物模型系統包括但不限于：大鼠、小鼠、雞、牛、猴、豬、狗、兔等。可以使用本領域中熟知的任何動物系統。在本發明的具體實施方案中，在小鼠模型系統中測試預防劑和/或治療劑的組合。用于本發明方法的優選的動物模型是例如在小鼠效應子細胞上表達人fcγr的轉基因小鼠，例如在u.s.5,877,396中所描述的任何小鼠模型均可用于本發明。
抗炎活性可以通過使用本領域內已知的和croffordl.j.和wilderr.l.,“arthritisandautoimmunityinanimals(動物中的關節炎和自身免疫性)”,(在arthritisandalliedconditions:atextbookofrheumatology(關節炎和相關病癥：風濕病學教科書),mccarty等人(編輯),第30章(lee和febiger,1993)中)中描述的炎性關節炎的多種實驗動物模型和自發動物模型來確定。例如，佐劑誘導的關節炎模型如大鼠、倉鼠、兔、狗和豬中角叉菜膠、酵母聚糖(xymosan)或膠原誘導的關節炎可用于研究抗炎活性，并且在大鼠中角叉菜膠誘導的爪子水腫的抑制是大部分nsaid的抗炎活性的主要體內篩選方式，并且被認為是人功效的預示。這些模型描述于：例如winter等人(1962)proc.soc.exp.biolmed.111:544-47；和hansra等人(2000)inflammation24(2):141-55。用于炎性腸病的動物模型也可用于估計本發明的治療功效，例如在如strober(1985)dig.dis.sci.30(12增刊):3s-10s；kim等人(1992)scand.j.gastroentrol.27:529-37)中描述的模型。在這些模型中，可以通過口服施用硫酸化多糖、硫酸葡聚糖或化學刺激物誘導動物中的潰瘍性結腸炎(ulcerativecholitis)和克羅恩病。
治療自身免疫疾患的功效可以使用用于如下的自身免疫疾患的動物模型來估計：1型糖尿病、甲狀腺自身免疫病、系統性紅斑狼瘡和腎小球腎炎，例如在下列文獻中所描述的模型：flanders等人(1999)autoimmunity29:235-46；krogh等人(1999)biochimie81:511-15；foster(1999)semin.nephrol.19:12-24等。
還可以通過使用用于癌癥研究的多種實驗動物模型來確定治療劑的抗癌活性，例如scid小鼠模型、具有人異種移植物的轉基因小鼠或裸鼠、以及本領域已知的和在下列文獻中描述的其他動物模型如倉鼠、兔等：relevanceoftumormodelsforanticancerdrugdevelopment(用于抗癌藥物開發的腫瘤模型的實用性)(1999,編輯fiebig和burger)；contributionstooncology(對腫瘤學的貢獻)(1999,karger)；thenudemouseinoncologyresearch(腫瘤學研究中的裸鼠)(1991,boven和winograd編輯)；和anticancerdrugdevelopmentguide(抗癌藥物開發指南)(1997teicher編輯)。優選的動物模型是小鼠異種移植物模型。可用作異種移植物腫瘤來源的腫瘤細胞系包括但不限于：skbr3和mcf7細胞，它們可源自于患乳腺癌的患者。這些細胞具有erbb2和催乳素受體二者。本領域中常使用skbr3細胞作為adcc和異種移植物腫瘤模型。可選擇地，源自人卵巢腺癌的ovcar3細胞可以用作異種移植物腫瘤來源。
在用于人之前，優選先后在體外和體內測試本發明的治療劑的期望治療活性或預防活性。可以使用腫瘤細胞或惡性細胞系篩選治療劑和治療方法。本領域中的許多標準測定可用于估計這種存活和/或生長；例如，細胞增殖可以如下測定：通過測量3h-胸苷摻入、通過直接細胞計數、通過檢測諸如原癌基因(例如，fos、myc)等已知基因或細胞周期標記物的轉錄活性改變；細胞活力可以通過臺盼蘭染色估計；分化可以根據在軟瓊脂上的形態改變、生長減少和/或集落形成或者在三維基底膜上或胞外基質制劑上的管狀網絡形成來在視覺上估計；等等。
從細胞培養測定和動物研究獲得的數據可用于配制用于人的一系列治療劑劑量。這種藥劑的劑量優選處于具有極少或沒有毒性的循環濃度的范圍內，該范圍包括ed50。劑量可以依據所采用的劑型和利用的施用途徑在此范圍內變化。對于用于本發明方法中的任何藥劑，治療有效劑量可以由細胞培養測定初步估計。可以在動物模型中配制劑量以到達循環血漿濃度范圍，該范圍包括如細胞培養物中確定的ic50(即，達成癥狀最大抑制的一半的測試化合物濃度)。這種信息可用于更準確地確定人中的可用劑量。可以通過例如高效液相色譜來測量血漿中的水平。
d.其他方法
d1.基因治療
在具體的實施方案中，施用包含編碼本發明分子的序列的核酸以借助于基因治療來治療、預防或改善與疾病、疾患或感染相關的一種或多種癥狀。基因治療是指通過給受治療者施用表達的或可表達的核酸來進行的治療。在本發明的這種實施方案中，核酸產生它們編碼的抗體或融合蛋白，該抗體或融合蛋白介導治療或預防作用。可以使用本領域中可用的用于基因治療的任何方法，例如，在下列文獻中描述的方法：例如goldspiel等人(1993)clinicalpharmacy12:488-505；wu和wu(1991)biotherapy3:87-95；tolstoshev(1993)ann.rev.pharmacol.toxicol.32:573-596；mulligan(1993)science260:926-932；以及morgan和anderson(1993)ann.rev.biochem.62:191-217。
在優選的方面，本發明的組合物包含編碼本發明的抗體、雙抗體或融合蛋白的核酸，所述核酸是在合適的宿主中表達所述抗體的表達載體的一部分。具體地，這些核酸具有啟動子，優選與抗體編碼區可操作地連接的異源啟動子，所述啟動子是誘導型的或組成型的并且任選為組織特異性的。在另一具體實施方案中，使用的核酸分子中抗體編碼序列和任何其他期望序列的兩側為促進在基因組的期望位點同源重組的區域，從而提供了編碼抗體的核酸的染色體內表達，如在koller和smithies(1989)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)86:8932-35；和zijlstra等人(1989)nature342:435-38中所描述的。
核酸遞送至受治療者中可以是直接的，在這種情況下受治療者直接暴露于核酸或攜帶核酸的載體；或者是間接的，在這種情況下，首先在體外用核酸轉化細胞，然后將細胞移植到受治療者中。這兩種方法分別稱為體內(invivo)基因治療或離體(exvivo)基因治療。
在具體的實施方案中，編碼本發明多肽的多核苷酸在體內施用，在體內多核苷酸被表達產生編碼的多肽。這可以通過大量方法的任一種來完成，例如通過使用反轉錄病毒載體或其他病毒載體感染(如描述于下列文獻中的：例如美國專利第4,980,286號；miller等人(1993)meth.enzymol.217:581-599；salmons和gunzberg(1993)humangenetherapy4:129-141；grossman和wilson(1993)curr.opin.ingeneticsanddevel.3:110-114；kozarsky和wilson(1993)currentop.ingeneticsanddev.3:499-503；walsh等人(1993)proc.soc.exp.biol.med.204:289-300；bout等人(1994)humangenetherapy5:3-10；boesen等人(1994)biotherapy6:291-302；clowes等人(1994)j.clin.invest.93:644-651；klein等人(1994)blood83:1467-1473；和美國專利第5,436,146號)；或通過直接注射裸dna；或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍)；或用脂質或細胞表面受體或轉染劑包被、封裝在脂質體、微粒或微膠囊中；或通過與已知進入核的肽連接或與經受受體介導的內吞作用的抗原連接而施用它們(如在下列文獻中描述的：例如wu和wu(1987)j.biol.chem.262:4429-4432；joliot等人(1991)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)88:1864-1868；wo92/06180；wo92/22635；w092/20316；w093/14188；wo93/20221)(它可用于靶向特異性表達受體的細胞類型)，等等。
可以將核酸引入細胞中，然后體內施用所得重組細胞，例如在下列文獻中描述的：wo94/08598；rheinwald(1980)meth.cellbio.21a:229；pittelkow和scott(1986)mayoclinicproc.61:771；stemple和anderson(1992)cell71:973-985。可以通過本領域中已知的多種方法將所得重組細胞遞送給受治療者。重組血細胞(例如，造血干細胞或造血祖細胞)優選靜脈內施用。預期使用的細胞量取決于期望的作用、患者狀態等，并且可以由本領域技術人員確定。核酸可以引入其中的用于基因治療目的的細胞涵蓋任何期望的可用的細胞類型，并且包括但不限于：上皮細胞、內皮細胞、角質形成細胞、成纖維細胞、肌肉細胞、肝細胞；血細胞，例如t淋巴細胞、b淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞、粒細胞；各種干細胞或祖細胞，尤其造血干細胞或造血祖細胞，如由骨髓、臍帶血、外周血、胎兒肝等所獲得的等。在優選的實施方案中，用于基因治療的細胞是受治療者自體的。
d2.疫苗治療
在一些實施方案中，本發明的抗體可用于誘導針對抗原劑或免疫原性劑的免疫反應，所述抗原劑或免疫原性劑包括但不限于癌癥抗原和傳染病抗原。本發明的疫苗組合物包含期望對其發生免疫反應的一種或多種抗原劑或免疫原性劑，其中所述一種或多種抗原劑或免疫原性劑被用本發明的抗體包被。本發明的疫苗組合物在引發免疫反應，優選針對抗原劑或免疫原性劑的保護性免疫反應中尤其有效，所述抗原劑或免疫原性劑可以是期望對其發生免疫反應的病毒或源自其他病毒或非病毒病原體的抗原。
在又一實施方案中，本發明涵蓋在其表面上表達抗體的病原性細胞或病毒，優選減毒病毒。本發明還涵蓋通過施用本發明的組合物誘導受治療者的耐受的方法。優選地，適于誘導受治療者耐受的組合物包含用本發明的抗體包被的抗原劑或免疫原性劑。
d3.靶向脂質體或其他微米載體(microcarrier)和納米載體(nanocarrier)
在一些實施方案中，本發明的抗體可用于制備靶向的脂質體以用于將期望的治療組合物(例如，抗癌劑)遞送給靶細胞(例如，前列腺癌細胞或其他表達her2/neu的細胞)。用于抗腫瘤藥物的靶向遞送的免疫脂質體的制備和使用在mastrobattista等人(1999)advanceddrugdeliveryreviews40:103-127中綜述。脂質體是基于脂質雙層的囊狀結構。它們的直徑可以小至20nm并且大至10μm。它們可以是單層的(僅有一層雙層環繞水性核心)或多層的(兩層或更多層雙層環繞水性核心同心地定向)。使用多種靶向劑(例如，本發明的抗體)進行脂質體靶向是本領域中熟知的。參見，例如美國專利第4,957,773和4,603,044號。可以使用用于將靶向劑與脂質體偶聯的標準方法。可以使用例如摻入蛋白a的脂質體來構建抗體靶向的脂質體。參見renneisen等人(1990)j.biol.chem.265:16337-16342；和leonetti等人(1990)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)87:2448-2451。
在優選的實施方案中，脂質體由標準的成囊泡脂質(vesicle-forminglipid)形成，該成囊泡脂質通常包括中性的和負電荷的磷脂和固醇，如膽固醇。脂質的選擇一般由例如脂質體大小和脂質體在血流中的穩定性的考慮來指導。多種方法可用于制備脂質體，如在下列文獻中所描述的：例如，szoka等人(1980)ann.rev.biophys.bioeng.9:467；美國專利第4,235,871號；4,501,728號和4,837,028號。一種方法產生不均一尺寸的多層囊泡。在此方法中，將形成囊泡的脂質溶解在合適的有機溶劑或溶劑系統中并在真空或惰性氣體下干燥以形成薄的脂膜。如果期望，可以將膜再溶解在諸如叔丁醇等合適的溶劑中，并然后將其凍干以形成呈更容易水合的粉末樣形式的更加均勻的脂質混合物。用靶向的藥物和靶向組分(抗體)的水溶液覆蓋這種膜，并容許其水合，通常是在攪拌下進行15-60分鐘的時間段。可以通過在更劇烈攪拌的條件下水合脂或通過添加諸如脫氧膽酸鹽等增溶性去垢劑來將所得多層囊泡的尺寸分布轉化成較小的尺寸。
d4.免疫測定
本發明的抗體可用于檢測her2/neu或表達her2/neu的細胞。可以使用大量方法的任一種來達成這種檢測。例如，可以使用免疫結合測定(參見，例如美國專利第4,366,241號；4,376,110號；4,517,288號；和4,837,168號)。對于一般免疫測定的綜述還參見asai(編輯1993)methodsincellbiology(細胞生物學中的方法)第37卷,academicpress,newyork；stites&terr(編輯1991)basicandclinicalimmunology(基礎和臨床免疫學)第7版。
因此，本發明提供檢測表達her2/neu的細胞的方法。在一個方法中，對受治療者進行活組織檢查并體外測試所收集的組織。然后用本發明的抗-her2/neu抗體接觸組織或來自組織的細胞。所得的任何免疫復合體表明活組織檢查樣品中her2/neu蛋白的存在。為了易化這種檢測，可以放射性標記抗體，或將其與為可檢測標記如放射性標記的效應子分子偶聯。在另一方法中，可以使用通常的成像系統體內檢測細胞。然后，通過用于檢測標記的任何已知方法確定標記的定位。可以使用用于顯現診斷成像的常規方法。例如，可使用順磁同位素進行mri。抗體內化對于將其在生物體中的壽命延長至超過胞外結合所提供的壽命是很重要的，胞外結合對于被與循環清除偶聯的胞外酶環境清除是敏感的。
還可以使用標準的免疫測定方法和本發明的抗體檢測her2/neu蛋白。標準方法包括：例如，放射免疫測定、免疫色譜法、夾心免疫測定(包括elisa)、免疫熒光測定、蛋白質印跡、親和色譜(與固相結合的親和配體)和用標記抗體進行的原位檢測。
現在已經大致描述了本發明，可以通過參考下列實施例更容易地理解本發明，除另外說明外，下列實施例僅通過示例提供并且不旨在限制本發明。
實施例1
biacore親和力確定
使用biacore測定(biacore儀器1000,biacoreinc.,piscataway,n.j.)和相關軟件分析洗脫抗體和純化抗體的結合的動力學參數。通過胺偶聯化學法(通過用nhs/edc的混合物修飾羧甲基基團)將her-2固定在傳感器芯片表面的四個流動室之一(流動室2)上，使約1000個反應單位(ru)的受體固定于表面上。這之后，用1met-nh2注射將未反應的活性酯“脫帽”。制備了合適的表面后，便以70ml/分鐘的流速將ch4d5-fcwt(野生型fc)、ch4d5和曲妥單抗(對照)以6.25-200mm的濃度注射到該表面上持續180秒。
收集到整個數據組后，便將所得的結合曲線進行全擬合，并使用廠家提供的計算機算法計算速率常數和表觀平衡結合常數，如在由biacore,inc獲得的biaevaluationsoftwarehandbook(biaevaluation軟件手冊)中所描述的。圖3顯示spr分析的圖表結果，并且計算的常數提供在表5中。
實施例2
凋亡
用ch4d5和ch4d5-fcmt1孵育各細胞系過夜。通過facs分析測定凋亡，結果顯示在表6中。
實施例3
增殖
使用摻入到dna中的[3h]胸苷([3h]tdr)作為skbr3細胞增殖的生物化學指數來比較本發明實施方案的各種嵌合4d5抗體的作用。研究了ch4d5-ag、ch4d5和ch4d-fcmt1對cd16-158f+和cd16-158v+細胞的作用并與對照比較。結果描繪在圖4中。
實施例4
在小鼠(乳癌模型)中的抗腫瘤活性
使用非轉基因小鼠和轉基因(hcd16a)小鼠在乳癌模型中研究各種抗體的抗腫瘤活性。在第0天用jmt-1乳癌細胞對來自macrogenics繁殖群體的50只balb/crag2-/-非轉基因小鼠進行皮下注射。將小鼠分為5組，每組10只，并用ch4d5n297q、ch4d5野生型fc、ch4d5-fcmt1、ch4d5-fcmt2或pbs(陰性對照)腹膜內(intraperitoneously)(ip)處理8周，每周一次。每周使用測徑器監測腫瘤發展兩次，并通過下面的公式估計腫瘤重量：腫瘤重量＝(長×寬2)/2。結果顯示在圖5中。在第0天用jimt-1乳癌細胞對來自macrogenics繁殖群體的23只balb/crag2-/-mcd16-/-hcd16a+轉基因小鼠進行皮下注射。將小鼠分為3組，并用ch4d5野生型fc(n＝8)、ch4d5-fcmt1(n＝8)或pbs(陰性對照；n＝7)腹膜內(ip)處理8周，每周一次。每周使用測徑器監測腫瘤發展兩次，并通過下面的公式估計腫瘤重量：腫瘤重量＝(長×寬2)/2。結果顯示在圖6中。
實施例5
小鼠(卵巢癌模型)中的抗腫瘤活性
使用非轉基因小鼠和轉基因(hcd16a)小鼠在卵巢癌模型中研究各種抗體的抗腫瘤活性。在第0天用skov-3卵巢癌細胞對來自macrogenics繁殖群體的22只r3-/-n/n非轉基因小鼠進行皮下注射。將小鼠分為4組，并用ch4d5n297q(n＝5)、ch4d5-野生型fc(n＝6)、ch4d5-fcmt1(n＝6)或pbs(陰性對照；n＝5)腹膜內(ip)處理8周，每周一次。每周使用測徑器監測腫瘤發展兩次，并通過下面的公式估計腫瘤重量：腫瘤重量＝(長×寬2)/2。結果顯示在圖7的圖a中。在第0天用skov-3卵巢癌細胞對來自macrogenics繁殖群體的32只r3-/-n/nhcd16a+轉基因小鼠進行皮下注射。將小鼠分為4組，并用ch4d5n297q(n＝8)、ch4d5-野生型fc(n＝8)、ch4d5-fcmt1(n＝8)或pbs(陰性對照；n＝8)腹膜內(ip)處理8周，每周一次。每周使用測徑器監測腫瘤發展兩次，并通過下面的公式估計腫瘤重量：腫瘤重量＝(長×寬2)/2。結果顯示在圖7的圖b中。在第0天用skov-3卵巢癌細胞對來自macrogenics繁殖群體的96只mcd16-/-hucd16afoxn1-/-(nu/nu)轉基因小鼠進行皮下注射。將小鼠分為6組，每組16只，并用ch4d5-fcmt3、ch4d5-fcmt1、ch4d5-fcmt4、ch4d5、ch4d5ag或pbs(陰性對照)腹膜內(ip)處理8周，每周一次。每周使用測徑器監測腫瘤發展兩次，并通過下面的公式估計腫瘤重量：腫瘤重量＝(長×寬2)/2。結果顯示在圖8中。
實施例6
多種癌癥細胞系中的adcc測定
圖9圖解多種癌癥細胞系的代表性her2/neu免疫組織化學染色。如以dakohercepttesttm(dakocytomation,glostrup,denmark)出售的her2/neu測試試劑盒中所說明的，根據細胞系的her2/neu染色強度對它們進行評級：缺乏her2/neu染色(dako評分0)；弱her2/neu染色(dako評分1+)；中度her2/neu染色(dako評分2+)；和強her2/neu染色(dako評分3+)。代表各細胞系的各圖顯示在表7中。
測試了包括具有fc變體結構域的ch4d5抗體的幾種ch4d5抗體在癌癥細胞系中介導adcc的能力，所述ch4d5抗體包括ch4d5-fcmt1、ch4d5-fcmt2、ch4d5-fcmt3、ch4d5-fcwt(野生型fc)、ch4d5n297q和曲妥單抗(對照)。來自有效測定(sr≤20％mr,aicc≤50％mr)的數據報告在表8中，其中僅有模型符合最大裂解>20％時認為ec50估計值是有效的。ec50與最大裂解參數的比較是通過用平方和f檢驗詢問fc-優化的抗體所獲得的最佳擬合值與fc野生型ch4d5抗體所獲得的最佳擬合值是否在統計學上有差異。還將數據與s形(sigmoidal)劑量響應模型擬合，如圖10-13中所顯示。
本說明書中所提到的所有的出版物和專利均通過引用并入本文，其程度如同各單獨的出版物或專利申請特定地且單獨地指示為通過引用并入本文一樣。盡管本發明是與其具體實施方案結合描述的，但應理解本發明能夠進一步修改，并且本申請旨在涵蓋大體上遵循本發明的原理的任何變化、用途或改進并且包括來自本公開內容的這些偏差，如同本發明所屬領域所已知的或慣常的實踐和可以應用于本文之前所列的基本特征一樣。
序列表
<110>宏觀基因有限公司
萊斯利·s·約翰遜
菱·黃
納丁·泰朗
埃茲奧·泊韋尼
<120>her2/neu-特異性抗體和其使用方法
<130>1301.0021i
<150>us61/041,649
<151>2008-04-02
<160>13
<170>patentin版本3.4
<210>1
<211>645
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>嵌合的(鼠-人)
<400>1
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<213>人工的
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