本發明涉及一種南瓜游離小孢子誘導培養基及誘導培養方法，具體涉及一種顯著提高了南瓜游離小孢子胚性愈傷誘導效率、促進了南瓜花培育種體系建立的南瓜游離小孢子誘導培養基及誘導培養方法，屬于蔬菜培育高新技術領域。
背景技術：
南瓜（cucurbitamoschata）屬于葫蘆科南瓜屬的一年生蔓性草本植物，起源于美洲，在16世紀中葉明中期傳入中國。南瓜全球目前栽培種主要有5個：中國南瓜、印度南瓜、美洲南瓜、灰籽南瓜和黒籽南瓜，在中國主要是栽培前3種。南瓜是人類最早栽培的古老作物之一，在公元前4050年就開始了美洲南瓜的栽培，公元前5000～3000年就有了中國南瓜和墨西哥南瓜的殘片存在。
南瓜的營養、保健與藥用價值較高，古代名醫李時珍在《本草綱目》中對南瓜的作用有如下記載“補中，補肝氣，益心氣，益肺氣，益精氣”，凡久病氣虛、脾胃虛弱、癥見氣短倦怠、食少腹脹、水腫尿少者宜用。近年來的研究結果亦表明，南瓜的營養成分豐富，其營養成分為水分90.24%、蛋白質0.65%、脂肪0.13%、碳水化合物6.08%、纖維2.15%、灰分0.73%，同時還含有豐富的胡蘿卜素、維生素b、維生素c、維生素e、精氨酸、天門冬氨酸、腺嘌呤、果膠、甘露醇、葉紅素、葉黃素及鈣、鉀、鋅、鉻等礦物質，特別是稀有氨基酸瓜氨酸含量達20.9mg/100g，果膠含量占南瓜干物質的7%-17%，脂肪含量卻非常低。南瓜具有多種食療保健作用和藥用價值，近年來，國內外研究表明，南瓜具有降血糖、降血脂、解毒、保肝腎、防治癌癥及肥胖癥等保健與藥用功效。隨著人們對南瓜認識的不斷加深，國內外逐漸開始對南瓜進行綜合開發利用，目前市場上出現的系列南瓜產品有南瓜粉、南瓜醬、南瓜罐頭、南瓜果脯、三合味南瓜片、南瓜蜜錢瓜干、南瓜晶、南瓜糊、南瓜糕點、南瓜飲料、南瓜冰淇淋、什錦瓜果、南瓜果凍、南瓜醬油、南瓜火腿、南瓜營養汁等多種品種。
在我國，南瓜的保健作用正漸漸被人們認識了解，南瓜食品越來越受到人們的喜愛。南瓜對環境適應力極強，極易生長，在我國各地普遍栽培，而且運輸和保存比較方便。南瓜在中國的種植面積為76萬hm2，總產量為1616萬噸，面積和總產量分別占全世界的10.3%和20%，我國是南瓜生產世界第一大國。開發南瓜產品，開展南瓜深加工的研究，對發展南瓜的種植及豐富保健食品市場都有較大的意義。
隨著南瓜國際國內市場需求的緊俏，優質、抗病、豐產的南瓜良種培育成為蔬菜培育科研人員的研究主題之一。南瓜是異花授粉植物，雜交優勢非常明顯，目前主要采用雜交育種方法進行南瓜新品種培育。傳統雜交育種方法存在周期長、效率低等突出問題，育成一個穩定優良自交系一般需要6-8年，甚至更長時間，選育自交系非常費事、費工。近年來隨著人工成本的增加，常規育種的不足在實際工作中日漸明顯。因此，迫切需求南瓜育種的新途徑和新方法。
單倍體育種與常規多代自交獲得純系相比，具有周期短、效率高、純系穩定等特點。游離小孢子培養是單倍體育種技術中快速獲得純系的一種有效方法，同單倍體育種技術中的花藥培養相比，游離小孢子培養消除了小孢子和花藥壁、級鏈層細胞之間可能存在的營養競爭，往往培養成功的基因型多，胚狀體誘導頻率也高，同時去除了花藥壁、級鏈層細胞等體細胞再生植株的干擾，從而可以提高選擇的準確性，提高育種效率和品種質量。
國內外學者對影響蔬菜游離小孢子培養的一些因素進行了研究，取得了顯著的進展，通過優化培養基和改進培養方法，使部分蔬菜材料小孢子胚誘導率有了提高，部分蔬菜種花培育種體系得以建立。但是南瓜游離小孢子培養研究進展緩慢，利用這項技術進行南瓜育種的研究鮮見報道，主要原因是小孢子胚性愈傷誘導率低而不穩定，直接限制了南瓜游離小孢子培養技術在育種上的應用。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種顯著提高了南瓜游離小孢子胚性愈傷誘導效率、促進了南瓜花培育種體系的建立的南瓜游離小孢子誘導培養基及誘導培養方法。
本發明的目的是通過以下技術方案解決的：
一種南瓜游離小孢子誘導培養基及誘導培養方法，其特征在于：所述南瓜游離小孢子誘導培養基的配方如下：
kno380-90mg/l，mgso4?7h2o140-160mg/l，kh2po470-76mg/l，ca(no3)2?4h2o160-200mg/l，mnso4?4h2o25-30mg/l，na2-edta11-14mg/l，feso4?7h2o12-15mg/l，h3bo38.0-8.5mg/l，znso4?7h2o8.5-9.5mg/l，ki0.45-0.55mg/l，agno315-19mg/l，na2moo4?2h2o0.2-0.3mg/l，cuso4?5h2o0.02-0.03mg/l，cocl2?6h2o0.02-0.03mg/l，腺嘌呤13-17mg/l，l-谷氨酰胺450-550mg/l，維生素b10.9-1.1mg/l，維生素b60.6-0.8mg/l，vc0.55-0.65mg/l，煙酸4.5-5.5mg/l，肌醇160-180mg/l，甘氨酸3.5-4.5mg/l，環鳥苷酸0.15-0.25g/l，谷胱甘肽30-35mg/l，甲基亞硝基脲1.2-1.8g/l，蔗糖55-65g/l，植物凝膠3.0-3.5g/l，6-ba0.15-0.25mg/l，naa0.3-0.4mg/l，甘露醇10-14g/l，聚乙二醇140-180mg/l，水解蛋白1.0-1.4g/l，植物硫化激動素psk-α25-35pmol/l，ph5.4-5.8。
所述的南瓜游離小孢子的誘導培養方法為：
將南瓜種子在春季3-4月份播于大田，待南瓜秧長至3-4米后進入初花期，選擇單核晚期南瓜花蕾進行取材，置于4℃冰箱內低溫預處理1-2d，接種前，將花蕾轉移入超凈工作臺無菌燒杯中，倒入70%酒精進行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用無菌水沖洗3次；瀝干水分后，在b5液體洗滌培養基中用平頭玻棒碾壓花蕾，擠出小孢子；懸浮液經50μm無菌微孔紗布過濾，收集濾液于10ml離心管，850rpm下離心3min，沉淀物加5mlb5洗滌培養基，搖勻，850rpm下離心2min，重復兩次，所得沉淀物即為南瓜游離小孢子；將南瓜游離小孢子轉移入南瓜游離小孢子誘導培養基中，33℃熱激處理48h后轉入25℃暗培養直至胚性愈傷組織形成。
所述的單核晚期南瓜花蕾的選材標準為：測量花蕾的縱莖和橫莖長度并計算縱橫比，取材縱橫莖之比為2.4-2.6的南瓜花蕾。
本發明相比現有技術有如下優點：
本發明根據禾本科和茄科小孢子誘導培養基配方，針對于南瓜游離小孢子的孢子體發育特性，繼續優化并組合基本培養基配比，調整基本培養基的組配，有利于南瓜游離小孢子的誘導；采用低含量的植物凝膠，使配制成的培養基半固體化，對南瓜游離小孢子的誘導更有利；發掘和試驗針對于提高南瓜游離小孢子成胚誘導能力的有機添加物和無機添加物，agno3、腺嘌呤、環鳥苷酸、谷胱甘肽、甲基亞硝基脲、甘露醇、聚乙二醇和植物硫化激動素psk-α等物質的合適濃度的添加，均不同程度的提高了南瓜游離小孢子的誘導率。
本發明所提供的南瓜游離小孢子誘導培養基，是在現有其它蔬菜種的研究基礎之上創造性改良的成果，是經過大量單因子、多因子試驗所篩選的最優組合，我們進行了大量的實驗研究亦得出本發明的組分配比是最優的。采用本發明所提供的培養基可以大大提高游離南瓜小孢子胚性愈傷的誘導效率，因此具有較高的產業推廣價值。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
一種南瓜游離小孢子誘導培養基及誘導培養方法，其特征在于：所述南瓜游離小孢子誘導培養基的配方如下：
kno380-90mg/l，mgso4?7h2o140-160mg/l，kh2po470-76mg/l，ca(no3)2?4h2o160-200mg/l，mnso4?4h2o25-30mg/l，na2-edta11-14mg/l，feso4?7h2o12-15mg/l，h3bo38.0-8.5mg/l，znso4?7h2o8.5-9.5mg/l，ki0.45-0.55mg/l，agno315-19mg/l，na2moo4?2h2o0.2-0.3mg/l，cuso4?5h2o0.02-0.03mg/l，cocl2?6h2o0.02-0.03mg/l，腺嘌呤13-17mg/l，l-谷氨酰胺450-550mg/l，維生素b10.9-1.1mg/l，維生素b60.6-0.8mg/l，vc0.55-0.65mg/l，煙酸4.5-5.5mg/l，肌醇160-180mg/l，甘氨酸3.5-4.5mg/l，環鳥苷酸0.15-0.25g/l，谷胱甘肽30-35mg/l，甲基亞硝基脲1.2-1.8g/l，蔗糖55-65g/l，植物凝膠3.0-3.5g/l，6-ba0.15-0.25mg/l，naa0.3-0.4mg/l，甘露醇10-14g/l，聚乙二醇140-180mg/l，水解蛋白1.0-1.4g/l，植物硫化激動素psk-α25-35pmol/l，ph5.4-5.8。
南瓜游離小孢子的誘導培養方法為：
將南瓜種子在春季3-4月份播于大田，待南瓜秧長至3-4米后進入初花期，選擇單核晚期南瓜花蕾進行取材，單核晚期南瓜花蕾的選材標準為：測量花蕾的縱莖和橫莖長度并計算縱橫比，取材縱橫莖之比為2.4-2.6的南瓜花蕾；然后將選材的南瓜花蕾置于4℃冰箱內低溫預處理1-2d，接種前，將花蕾轉移入超凈工作臺無菌燒杯中，倒入70%酒精進行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用無菌水沖洗3次；瀝干水分后，在b5液體洗滌培養基中用平頭玻棒碾壓花蕾，擠出小孢子；懸浮液經50μm無菌微孔紗布過濾，收集濾液于10ml離心管，850rpm下離心3min，沉淀物加5mlb5洗滌培養基，搖勻，850rpm下離心2min，重復兩次，所得沉淀物即為南瓜游離小孢子；將南瓜游離小孢子轉移入南瓜游離小孢子誘導培養基中，33℃熱激處理48h后轉入25℃暗培養直至胚性愈傷組織形成。
實施例1
配制本發明所述的一種南瓜游離小孢子誘導培養基，培養基配方具體如下：
kno385mg/l，mgso4?7h2o150mg/l，kh2po473mg/l，ca(no3)2?4h2o180mg/l，mnso4?4h2o27.5mg/l，na2-edta12.5mg/l，feso4?7h2o13.5mg/l，h3bo38.25mg/l，znso4?7h2o9.0mg/l，ki0.5mg/l，agno317mg/l，na2moo4?2h2o0.25mg/l，cuso4?5h2o0.025mg/l，cocl2?6h2o0.025mg/l，腺嘌呤15mg/l，l-谷氨酰胺500mg/l，維生素b11.0mg/l，維生素b60.7mg/l，vc0.6mg/l，煙酸5.0mg/l，肌醇170mg/l，甘氨酸4.0mg/l，環鳥苷酸0.2g/l，谷胱甘肽32.5mg/l，甲基亞硝基脲1.5g/l，蔗糖60g/l，植物凝膠3.25g/l，6-ba0.2mg/l，naa0.35mg/l，甘露醇12g/l，聚乙二醇160mg/l，水解蛋白1.2g/l，植物硫化激動素psk-α30pmol/l，ph5.6。
南瓜游離小孢子的誘導培養方法為：
將南瓜種子在春季3-4月份播于大田，待南瓜秧長至3-4米后進入初花期，選擇單核晚期南瓜花蕾進行取材，單核晚期南瓜花蕾的選材標準為：測量花蕾的縱莖和橫莖長度并計算縱橫比，取材縱橫莖之比為2.4-2.6的南瓜花蕾；然后將選材的南瓜花蕾置于4℃冰箱內低溫預處理1-2d，接種前，將花蕾轉移入超凈工作臺無菌燒杯中，倒入70%酒精進行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用無菌水沖洗3次；瀝干水分后，在b5液體洗滌培養基中用平頭玻棒碾壓花蕾，擠出小孢子；懸浮液經50μm無菌微孔紗布過濾，收集濾液于10ml離心管，850rpm下離心3min，沉淀物加5mlb5洗滌培養基，搖勻，850rpm下離心2min，重復兩次，所得沉淀物即為南瓜游離小孢子；將南瓜游離小孢子轉移入南瓜游離小孢子誘導培養基中，33℃熱激處理48h后轉入25℃暗培養直至胚性愈傷組織形成。
為了比較本發明所提供的南瓜游離小孢子誘導培養基各組分的配比效果，我們對本發明提供的南瓜游離小孢子誘導培養基進行了組分改變的單因子試驗，試驗品種亦采用錦紅一號和黃金二號，游離小孢子的分離方法、組培操作方法、培養方法均相同，胚性愈傷組織形成后分別統計錦紅一號和黃金二號的游離小孢子在各培養基內的小孢子愈傷組織誘導率。
單因子試驗的試驗組分分別為：agno3、腺嘌呤、環鳥苷酸、谷胱甘肽、甲基亞硝基脲、植物凝膠、甘露醇、聚乙二醇和植物硫化激動素psk-α，各組分因子梯度濃度設置和試驗結果如下表1-9。
由表1到表9的南瓜游離小孢子誘導培養基組分改變的單因子試驗可以發現，采用低含量的植物凝膠，使配制成的培養基半固體化，對南瓜游離小孢子的誘導更有利，而當植物凝膠比例繼續降低時，游離小孢子的誘導率突降為0，這是由于小孢子沉降入培養基內造成小孢子誘導生長缺氧造成的；而agno3、甲基亞硝基脲配比的增加產生了很明顯的不利效應；而腺嘌呤、環鳥苷酸、谷胱甘肽、甘露醇、聚乙二醇和植物硫化激動素psk-α的增加不能顯著增加培養基的誘導效果，由于這些添加物的增加會提高培養基的配制成本，在培養基誘導效果達最優值的最小配比量是綜合生產成本后的最佳配比。由此可見，進行任何培養基組分的增加或減少均是不利的，同時說明本發明的組分配比是最優的。
實施例2
為了比較本發明所提供的南瓜游離小孢子誘導培養基與其它培養基對南瓜游離小孢子胚性愈傷組織誘導效率的差異，我們另外選擇了2種游離小孢子誘導培養基，試驗品種亦采用錦紅一號和黃金二號，游離小孢子的分離方法、組培操作方法、培養方法均與實施例1相同，胚性愈傷組織形成后分別統計錦紅一號和黃金二號的小孢子在該2種培養基內的小孢子愈傷組織誘導率。
其它2種游離小孢子誘導培養基配方為：
nln培養液，ph為5.8（對比文件來自于栗根義等《大白菜游離小孢子培養》）；
nln-13培養基+0.5g/l活性炭，ph為5.8（對比文件來自于蔣武生等《活性炭對小白菜小孢子培養的影響》）。
培養基對比實驗
將采用本發明所提供的培養基誘導常州長白梗和合肥小葉菜游離小孢子統計所得的小孢子愈傷組織誘導率與對比實施例的錦紅一號和黃金二號小孢子愈傷組織誘導率進行比較，比較結果如下表10所示。
由表10可以發現，本發明所提供的南瓜游離小孢子誘導培養基對南瓜品種錦紅一號和黃金二號的小孢子愈傷組織誘導率平均值達到了16.7個/蕾，而前人所采用的兩種培養基對南瓜品種錦紅一號和黃金二號的小孢子愈傷組織誘導率平均值分別僅為4.3個/蕾和8.9個/蕾，可以發現本發明所提供的南瓜游離小孢子誘導培養基對南瓜游離小孢子的誘導能力做出了顯著的提升。
本發明所提供的南瓜游離小孢子誘導培養基，是在現有其它蔬菜種的研究基礎之上創造性改良的成果，是經過大量單因子、多因子試驗所篩選的最優組合，我們進行了大量的實驗研究亦得出本發明的組分配比是最優的。采用本發明所提供的培養基可以大大提高游離南瓜小孢子胚性愈傷的誘導效率，因此具有較高的產業推廣價值。
以上實施例僅為說明本發明的技術思想，不能以此限定本發明的保護范圍，凡是按照本發明提出的技術思想，在技術方案基礎上所做的任何改動，均落入本發明保護范圍之內；本發明未涉及的技術均可通過現有技術加以實現。