本發明涉及一種快速檢測阿托伐他汀鈣的敏感性的方法，尤其涉及一種通過高通量測序快速檢測阿托伐他汀鈣的敏感性的方法。
背景技術：
他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶a(hmg-coa)還原酶抑制劑。這類藥物抑制肝臟膽固醇合成限速酶，減少低密度脂蛋白、膽固醇的合成，上調肝臟ldl受體基因表達。他汀類藥物不僅降低低密度脂蛋白、膽固醇，還具有獨立于調脂作用之外的非調脂作用。他汀類藥物具有抗炎、改善內皮細胞功能、延緩粥樣硬化斑塊的破裂、抑制心室重構等降脂外作用穩定斑塊，從而有效地降低冠脈事件的發生。阿托伐他汀鈣自臨床應用20余年以來，在全球大部分國家得到了廣泛應用。阿托伐他汀鈣((3s,5s)-7-[2-(4-氟苯基)-3-苯基-4-(苯基氨基甲酰基)-5-異丙基吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酸)是比較新型的他汀類藥物，其體內代謝產物競爭性抑制hmg-coa還原酶從而起到降低tc、ldl-c、apob和tg水平，改善血脂的作用。多年來的臨床觀察和科學研究表明，不同人群對阿托伐他汀鈣的藥效反應不盡相同。除了個體遺傳因素差異以外，腸道微生物是最為重要的影響因素。已有研究表明，腸道微生物代謝產生的膽汁酸類物質和阿托伐他汀鈣藥物共用肝臟和腸道轉運載體，在吸收上存在競爭抑制關系。因此，對于腸道菌群中產生膽汁酸類物質的細菌類群較多的患者，阿托伐他汀鈣的藥效就會受到影響。雖然目前對于腸道微生物如何影響阿伐他汀鈣藥效的機理已經比較明晰，但是還沒有可行的手段在給藥前對患者腸道菌群類型是否會產生較多的膽汁酸類進行檢測判斷，無法預判阿托伐他汀鈣在個體上的使用效果，因此需要一種能通過患者糞便快速檢測阿托伐他汀鈣的敏感性的方法。
技術實現要素：
為了解決上述技術所存在的不足之處，本發明提供了一種通過高通量測序快速檢測阿托伐他汀鈣的敏感性的方法。
為了解決以上技術問題，本發明采用的技術方案是：
本發明利用還原性物質半胱氨酸，保護糞便樣品表面的嚴格厭氧微生物，提高了后續dna數據采集的完整性，便于實際應用，檢測準確率高。
具體實施方式
下面結合具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。
a、樣品處理：
取高血脂患者新鮮糞便樣品3-5g，置于容量為10ml的離心管中，加入1ml1-10％的半胱氨酸溶液，渦旋震蕩3-5min后進行4-10℃冷藏保存，在0-3小時內進行dna提取。優選半胱氨酸溶液濃度5％，渦旋震蕩4min，4℃冷藏，2小時內提取dna)。
b、基因組dna的提取：糞便微生物的基因組dna采用qlaampdnastoolminikit(qiagen糞便dna快速提取試劑盒)進行提取，基因組dna的完整性用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，濃度和純度用qubitdsdnahsassaykits(qubit核酸定量試劑盒)或者nanodrop分光光度計進行檢測。優選qubitdsdnahsassaykits進行定量與純度檢測。
c、16srrna基因測序文庫的構建及高通量測序：
利用引物341f和806r或者515f和907r對樣品總的16srrna基因的v3-v4區片段進行擴增，反應體系dna模板濃度80-150ng/μl，反應程序循環次數為27-32，pcr產物經純化后連接上測序接頭，從而構建16srrna基因測序文庫；采用illuminahiseq2500測序平臺對樣品中16srrna基因進行高通量雙端測序，采用pe250測序策略，測序長度為250bp×2。優選引物對341f和806r、dna模板濃度100ng/μl、反應循環次數27。
d、序列拼接及數據處理：
采用velevt1.2.10拼接，將測序片段進行k-mers長度的重疊拆分，設置k-mers參數值為10，通過組裝算法dbg(debruijngraph)將各小片段組裝起來；不進行帶polya尾的序列標簽(tags)過濾，嵌合體篩查采用usearch6.1.544軟件包；序列進行操作分類單元(otu)聚類分析，以序列相似度97-98.5％為otu分型界限，忽略數量在1000以下的otu單元，計算屬水平各個細菌類群的豐度數據，以反映樣品中微生物的結構組成。優選out分類界限為序列相似度98％。
e、通過模型-多項式回歸模型計算藥敏性預測值p：
p＝ax1.2+b(xy)2+cy+dz；
其中，a、b、c、d為常數，x為腸桿菌屬細菌相對含量(百分比，下同)，y為擬桿菌屬細菌相對含量，z為乳酸桿菌屬細菌相對含量；
a取值范圍為150-300(最優187)，b取值80000-140000(最優126800)，c取值40-70(最優55)，d取值-240至-260(最優-252)；
f、根據p值預判患者藥敏程度：
p值低于5，患者對阿伐他汀藥物不敏感，不建議使用他汀；p值介于5-8，患者對阿伐他汀敏感性屬中等水平，可根據實際情況給藥；p值高于8，患者對阿伐他汀鈣比較敏感，可優先使用阿托伐他汀鈣。
實施例1：
威海市立醫院，王翔，男67歲，高血脂患者，病史8年：
一、將其晨便進行收集采樣，取濕重5g置于10ml離心管，注入1ml5％半胱氨酸溶液，密閉存放于4℃冷藏冰箱。1小時后用qlaampdnastoolminikit糞便試劑盒進行dna提取。提取后的dna用rnase處理30min去除殘留rna，用蛋白酶k處理20min去除rnase，然后進行割膠純化，要求條帶單一、清晰，無明顯拖尾和彌散。
二、按照步驟一獲得dna樣本后，將樣本利用引物341f和806r或者515f和907r在illuminahiseq2500測序平臺對dna樣本進行高通量paired-endpe250測序。所得reads數據拼接采用velvet，dbg算法，k-mers值取10，不進行tags過濾，嵌合體篩查采用usearch6.1.544包。序列進行otu聚類，以序列相似度98％為界限進行otu聚類，忽略數量在1000以下的otu單元，計算屬水平各個細菌類群的豐度數據。
三、依據步驟一和二中的方法獲得某患者的腸道菌群數據后，計算得到腸桿菌屬細菌占x＝9.1％，擬桿菌屬細菌占y＝5.6％，乳酸桿菌屬占z＝4.8％，代入公式：
p＝187x1.2+126800(xy)2+55y-252z＝10.54+3.29+3.08-12.1＝4.81
p值小于5，不建議患者使用阿托伐他汀鈣。
實施例2：
威海市立醫院，李采梅，女72歲，高血脂患者，病史6年：
一、將其晨便進行收集采樣，取濕重3g置于10ml離心管，注入1ml10％半胱氨酸溶液，密閉存放于4℃冷藏冰箱。2小時后用qlaampdnastoolminikit糞便試劑盒進行dna提取。提取后的dna用rnase處理30min去除殘留rna，用蛋白酶k處理20min去除rnase，然后進行割膠純化，要求條帶單一、清晰，無明顯拖尾和彌散。
二、按照步驟一獲得dna樣本后，將樣本利用引物341f和806r或者515f和907r在illuminahiseq2500測序平臺對dna樣本進行高通量paired-endpe250測序。所得reads數據拼接采用velvet，dbg算法，k-mers值取10，不進行tags過濾，嵌合體篩查采用usearch6.1.544包。序列進行otu聚類，以序列相似度98％為界限進行otu聚類，忽略數量在1000以下的otu單元，計算屬水平各個細菌類群的豐度數據。
三、依據步驟一和二中的方法獲得某患者的腸道菌群數據后，計算得到腸桿菌屬細菌占x＝6.6％，擬桿菌屬細菌占y＝7.3％，乳酸桿菌屬占z＝1.7％，代入公式：
p＝187x1.2+126800(xy)2+55y-252z＝7.17+2.94+4.02-4.28＝9.85
p值大于8，建議患者使用阿托伐他汀鈣。
上述實施方式并非是對本發明的限制，本發明也并不僅限于上述舉例，本技術領域的技術人員在本發明的技術方案范圍內所做出的變化、改型、添加或替換，也均屬于本發明的保護范圍。