本發明屬于藥物制備領域，涉及天然產物異構體的分離制備，具體涉及一種高效、快速制備分離三種人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4的方法。
背景技術：
達瑪烷型人參皂苷的c20位多具有羥基，廣泛存在于人參屬植物，且含量較多。經加熱處理后，達瑪烷型皂苷及其苷元的c20位羥基易發生脫水反應，形成雙鍵，生成雙鍵異構的系列c20位脫羥基達瑪烷型稀有人參皂苷及其苷元。
cn102911238a公開了如下反應式：
但實際上，脫水產物還包括d結構的稀有人參皂苷，其化學式如下：
稀有人參皂苷b、c、d為同分異構體，b與c或d的雙鍵位置不同，c與d為同一位置雙鍵的順式和反式異構體。這三個同分異構體的極性相似，分離難度大。
cn103193846a公開了一種制備人參皂苷rk3和人參皂苷rh4順反異構體的方法。人參皂苷rk3和人參皂苷rh4順反異構體的化學結構式如下：
制備方法包括：(1)硅膠柱層析得人參皂苷rk3和rh4粗品；(2)反相制備液相制備得到人參皂苷rk3與z型rh4的混合品、精制e型人參皂苷rh4；(3)高速逆流分離人參皂苷rk3與z型rh4混合品得精制人參皂苷rk3和精制z型人參皂苷rh4。該申請指出，在大量制備三種化合物的單體純品時，反相柱色譜無法將人參皂苷rk3與z型rh4有效分離，而高速逆流雖然可以將人參皂苷rk3與z型rh4分開，卻無法僅通過高速逆流就將三者分離。
人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4是另一組由達瑪烷型皂苷的c20位羥基發生脫水形成的同分異構體稀有皂苷，化學結構式如下：
有研究表明，rg6、z型和e型f4存在不同的藥理作用，但是由于標準品獲得難度大，無法大量制備，限制了研究者對其活性進一步深入研究。雖然上文提及的cn102911238a公開了一種制備rg6、f4的方法，但是該方法收率低(不到20％)；另外，現有技術也沒有公開如何大量(此處大量指單次分離獲得三種異構體各100mg以上)分離rg6、z型和e型f4。
總之，大量獲得人參皂苷rg6、z型和e型f4標準品的難度較大。
技術實現要素：
本發明目的在于克服現有技術不足，提供一種高效、快速、大量制備分離人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4的方法；該方法不僅產物得率高，而且可以有效將三種異構體分離，單次分離即可獲得三種異構體的質量各在100mg以上。
本發明通過下面的技術方案得以實現：
一種制備人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4混合物的方法，以人參皂苷rg2為原料，以含酸的醇水溶液為反應體系，進行加熱脫水反應，創新點在于：以二氧化鉛為催化劑進行非均相脫水反應，反應結束后先濾除催化劑再進行濃縮即得。
優選地，所述醇水溶液優選甲醇、乙醇的水溶液，體積百分濃度為40-60％。
優選地，所述酸為甲酸、乙酸，體積百分濃度為0.04-0.06％。
優選地，脫水反應的條件為：反應溫度為80-90℃，常壓反應時間為2-3小時。
一種以上述混合物為原料分離制備人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4的方法：采用高速逆流色譜法進行分離制備，并且以乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(體積比4:1:5:0.08)為溶劑系統，將該溶劑系統劇烈震蕩后靜置分層，將上下兩相分開，上相為固定相，下相為流動相。該溶劑系統中，若不添加乙酸，(z)-f4和(e)-f4無法分開，而且換做甲酸也依然無法分開。
優選地，所述高速逆流色譜法采用多層聚四氟乙烯螺旋管作為分離管，直徑2.3mm，分離體積230ml，β值為0.5-0.8。
優選地，高速逆流色譜法的轉速為750-850r/min，流動相的流速為1.3-1.5ml/min，分離溫度為33-37℃。
優選地，將所述混合物用等體積固定相和流動相組成的混合溶劑溶解作為高速逆流的樣品溶液。
優選地，所述固定相、流動相使用前超聲30分鐘。
本發明的優點：
本發明提供的制備人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4混合物的方法得率高，90％以上的人參皂苷rg2均轉化為rg6、(z)-f4和(e)-f4，原料利用率高；本發明提供的高速逆流分離該人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4混合物的方法分離效率高，分度度好，可以有效將三種異構體分離，單次分離即可獲得三種異構體的質量各在100mg以上。因此，本發明可以用于高效制備人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4標準品，便于開展藥效學研究。
附圖說明
圖1為高速逆流分離人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4混合物的色譜圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例進一步介紹本發明的技術方案。
下述實施例采用的高速逆流色譜儀的相關信息：
gs10a型高速逆流色譜儀(hsccc，北京艾美林科技有限公司)、多層聚四氟乙烯螺旋管(直徑2.3mm，分離體積230ml，β值為0.5-0.8)、tbp泵(上海同田生物技術有限公司)、8823b-紫外檢測器(北京賓達英創科技有限公司)、3057-11記錄儀(重慶川儀總廠有限公司)。
實施例1人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4混合物的制備和混合物的分離
混合物的制備方法：
取500mg人參皂苷rg2(自制，純度大于95％)，用200ml含有甲酸的甲醇水溶液(甲醇體積百分濃度為50％)溶解，甲酸添加體積為甲醇水體積的0.05％。溶解后，在反應體系中添加50mg二氧化鉛顆粒，85℃熱回流反應2.5小時。反應結束后，自然冷卻至室溫，過濾去除二氧化鉛顆粒，濾液濃縮成基本不含甲醇的水溶液，冷凍干燥得到凍干粉。
混合物的高速逆流分離方法：
分離前12小時配制乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(體積比4:1:5:0.08)溶劑系統，具體配制方法為：將四種溶劑按比例混合，劇烈震蕩后，靜置12小時使其完全分層，在漏斗中將上、下相分離，上相用作固定相，下相用作流動相，用前超聲半小時。
分別取上相5ml和下相5ml，混合后將上述凍干粉全部溶解在其中(需要超聲輔助溶解)作為高速逆流的樣品溶液。
將兩相溶劑體系中已超聲脫氣的上相(固定相)以20ml/min的流速泵入hsccc分離管中(分離溫度35±2℃)，待上相充滿整個分離管后，調節主機轉速達800r/min，順時針旋轉，待轉速穩定后，以1.4ml/min流速泵入下相(流動相)，檢測波長為254nm。當流動相從主機口流出時，說明體系已達到流體動力學平衡，此時將已準備好的10ml樣品溶液注入hsccc儀，同時開始采集數據，根據色譜圖收集目標成分，色譜圖如圖1所示。
結果色譜圖上主要有三個色譜峰a、b、c，經鑒定，三個色譜峰根據出峰時間依次對應人參皂苷rg6(115.5mg，hplc歸一化純度96.4％)、人參皂苷(z)-f4(123.8mg，hplc歸一化純度95.5％)、人參皂苷(e)-f4(203.5mg，hplc歸一化純度96.9％)。
碳譜結構鑒定：13c-nmr(500mhz，c5d5n)顯示，人參皂苷rg6、(z)-f4、(e)-f4的碳譜特征與cn103193846a公布的一致，即：
1、rg6雙鍵在c20和c21之間，c20和c21位于低場，c20和c21化學位移高(c20,δ155.5；c21,δ108.1)；(e)-f4雙鍵位置在c20和c22之間，c20和c22位于低場，c20和c22化學位移高(c20,δ140.1；c22,δ123.6)；(z)-f4雙鍵位置也在c20和c22之間，c20和c22位于低場，c20和c22化學位移高(c20,δ140.1；c22,δ123.5)；
2、(e)-f4相比較(z)-f4，前者c21化學位移較低，約為13ppm；后者c21化學位移較高，約為27ppm。說明e構型由于空間位阻的原因，c21化學位移較低。
實施例2人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4混合物的制備和混合物的分離
混合物的制備方法：
取500mg人參皂苷rg2(自制，純度大于95％)，用200ml含有乙酸的乙醇水溶液(乙醇體積百分濃度為50％)溶解，乙酸添加體積為乙醇水體積的0.05％。溶解后，在反應體系中添加50mg二氧化鉛顆粒，85℃熱回流反應2.5小時。反應結束后，自然冷卻至室溫，過濾去除二氧化鉛顆粒，濾液濃縮成基本不含乙醇的水溶液，冷凍干燥得到凍干粉。
混合物的高速逆流分離方法：
分離前12小時配制乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(體積比4:1:5:0.08)溶劑系統，具體配制方法為：將四種溶劑按比例混合，劇烈震蕩后，靜置12小時使其完全分層，在漏斗中將上、下相分離，上相用作固定相，下相用作流動相，用前超聲半小時。
分別取上相5ml和下相5ml，混合后將上述凍干粉全部溶解在其中(需要超聲輔助溶解)作為高速逆流的樣品溶液。
將兩相溶劑體系中已超聲脫氣的上相(固定相)以20ml/min的流速泵入hsccc分離管中(分離溫度35±2℃)，待上相充滿整個分離管后，調節主機轉速達800r/min，順時針旋轉，待轉速穩定后，以1.4ml/min流速泵入下相(流動相)，檢測波長為254nm。當流動相從主機口流出時，說明體系已達到流體動力學平衡，此時將已準備好的10ml樣品溶液注入hsccc儀，同時開始采集數據，根據色譜圖收集目標成分，色譜圖和圖1基本一致。
結果色譜圖上主要有三個色譜峰a、b、c，經鑒定，三個色譜峰根據出峰時間依次對應人參皂苷rg6(98.5mg，hplc歸一化純度95.2％)、人參皂苷(z)-f4(110.3mg，hplc歸一化純度95.0％)、人參皂苷(e)-f4(194.5mg，hplc歸一化純度95.8％)。
實施例3人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4混合物的制備和混合物的分離
混合物的制備方法：
取500mg人參皂苷rg2(自制，純度大于95％)，用200ml含有甲酸的甲醇水溶液(甲醇體積百分濃度為40％)溶解，甲酸添加體積為甲醇水體積的0.06％。溶解后，在反應體系中添加50mg二氧化鉛顆粒，80℃熱回流反應3小時。反應結束后，自然冷卻至室溫，過濾去除二氧化鉛顆粒，濾液濃縮成基本不含甲醇的水溶液，冷凍干燥得到凍干粉。
混合物的高速逆流分離方法：
分離前12小時配制乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(體積比4:1:5:0.08)溶劑系統，具體配制方法為：將四種溶劑按比例混合，劇烈震蕩后，靜置12小時使其完全分層，在漏斗中將上、下相分離，上相用作固定相，下相用作流動相，用前超聲半小時。
分別取上相5ml和下相5ml，混合后將上述凍干粉全部溶解在其中(需要超聲輔助溶解)作為高速逆流的樣品溶液。
將兩相溶劑體系中已超聲脫氣的上相(固定相)以20ml/min的流速泵入hsccc分離管中(分離溫度35±2℃)，待上相充滿整個分離管后，調節主機轉速達750r/min，順時針旋轉，待轉速穩定后，以1.3ml/min流速泵入下相(流動相)，檢測波長為254nm。當流動相從主機口流出時，說明體系已達到流體動力學平衡，此時將已準備好的10ml樣品溶液注入hsccc儀，同時開始采集數據，根據色譜圖收集目標成分，色譜圖和圖1基本一致(各色譜峰的保留時間比實施例1滯后約18分鐘，峰形基本一致)。
結果色譜圖上主要有三個色譜峰a、b、c，經鑒定，三個色譜峰根據出峰時間依次對應人參皂苷rg6(118.5mg，hplc歸一化純度96.5％)、人參皂苷(z)-f4(129.2mg，hplc歸一化純度95.2％)、人參皂苷(e)-f4(214.0mg，hplc歸一化純度95.4％)。
實施例4人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4混合物的制備和混合物的分離
混合物的制備方法：
取500mg人參皂苷rg2(自制，純度大于95％)，用200ml含有甲酸的甲醇水溶液(甲醇體積百分濃度為60％)溶解，甲酸添加體積為甲醇水體積的0.04％。溶解后，在反應體系中添加50mg二氧化鉛顆粒，90℃熱回流反應2小時。反應結束后，自然冷卻至室溫，過濾去除二氧化鉛顆粒，濾液濃縮成基本不含甲醇的水溶液，冷凍干燥得到凍干粉。
混合物的高速逆流分離方法：
分離前12小時配制乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(體積比4:1:5:0.08)溶劑系統，具體配制方法為：將四種溶劑按比例混合，劇烈震蕩后，靜置12小時使其完全分層，在漏斗中將上、下相分離，上相用作固定相，下相用作流動相，用前超聲半小時。
分別取上相5ml和下相5ml，混合后將上述凍干粉全部溶解在其中(需要超聲輔助溶解)作為高速逆流的樣品溶液。
將兩相溶劑體系中已超聲脫氣的上相(固定相)以20ml/min的流速泵入hsccc分離管中(分離溫度35±2℃)，待上相充滿整個分離管后，調節主機轉速達850r/min，順時針旋轉，待轉速穩定后，以1.5ml/min流速泵入下相(流動相)，檢測波長為254nm。當流動相從主機口流出時，說明體系已達到流體動力學平衡，此時將已準備好的10ml樣品溶液注入hsccc儀，同時開始采集數據，根據色譜圖收集目標成分，色譜圖和圖1基本一致(各色譜峰的保留時間比實施例1提前約5分鐘，峰形基本一致)。
結果色譜圖上主要有三個色譜峰a、b、c，經鑒定，三個色譜峰根據出峰時間依次對應人參皂苷rg6(108.7mg，hplc歸一化純度95.1％)、人參皂苷(z)-f4(117.5mg，hplc歸一化純度95.8％)、人參皂苷(e)-f4(209.3mg，hplc歸一化純度96.1％)。
本發明提供的制備人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4混合物的方法得率高，90％以上的人參皂苷rg2均轉化為rg6、(z)-f4和(e)-f4，原料利用率高；本發明提供的高速逆流分離該人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4混合物的方法分離效率高，分度度好，可以有效將三種異構體分離，單次分離即可獲得三種異構體的質量各在100mg以上。因此，本發明可以用于高效制備人參皂苷異構體rg6、z型和e型f4標準品，便于開展藥效學研究。