一株枯草芽孢桿菌BBD012及防治番茄病害中的應用的制作方法

本發明涉及微生物技術領域，具體的說是一種枯草芽孢桿菌bbd012及防治番茄病害中的應用。

背景技術：

番茄灰霉病是番茄上危害較重且常見的病害，各菜區都發生。除危害番茄外，還可危害害茄子、辣椒、黃瓜、瓠瓜等20多種作物。低溫、連續陰雨天氣多的年份危害嚴重。發病嚴重時造成莖葉枯死和大量的爛花、爛果，直接影響產量。番茄灰霉病已成為我國保護地番茄生產的主要病害，灰霉病是由半知菌亞門真菌灰葡萄孢(botrytiscinerea)侵染所致。

番茄葉霉病由番茄葉霉病菌（fulviafulva）侵染所致，在番茄的葉、莖、花、果實上，都會出現癥狀，但是常見癥狀是發生在葉片上，初期在葉片背面出現一些退綠斑，后期變為灰色或黑紫色的不規則形霉層，葉片正面在相應的部位退綠變黃，嚴重時，葉片常出現干枯卷縮。從發病的順序看，經常從植株下部向上蔓延、溫度從9℃到34℃之間，病原都能生長發育，發育的最適溫度是20～25℃。在最適溫度且濕度較大(相對濕度在80%以上)時，僅需10天到半月就可普遍發病。

目前番茄抗病育種還沒有突破性進展，國內防治番茄灰霉病和葉霉病主要依靠化學藥劑。然而，長期、連續用藥使灰霉病菌和葉霉病產生了抗藥性，導致化學藥劑防治效果逐年下降，并且化學藥劑殘留嚴重污染農產品和環境，危及人畜健康。生物防治已經成為控制病害的重要手段，而植物內生細菌作為植物病害生物防治的潛在資源菌具有獨特的優勢，并且已經顯示出很好的利用前景。枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)是一種嗜溫性的好氧產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，能夠產生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑的內生孢子，其抑制植物病原菌的范圍很廣，包括根部病害、枝干病害、葉、花部病害和收獲后果品病害，是一種理想的生防微生物。

技術實現要素：

本發明目的是提供一株枯草芽孢桿菌bbd012，分類命名為枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）bbd012，保藏編號為cctccno：m2017097。

本發明的另一目的是提供一種防治番茄灰霉病和/或葉霉病制劑。

所述枯草芽孢桿菌bbd012可用于抑制番茄灰霉病菌和番茄葉霉病菌。

所述防治番茄灰霉病和/或葉霉病制劑為枯草芽孢桿菌bbd012培養液。

所述枯草芽孢桿菌bbd012培養液中含有菌落4×10⁸cfu·ml^–1。

所述枯草芽孢桿菌bbd012培養液的制備方法為：接種枯草芽孢桿菌bbd012單菌落于lb液體培養基中，28℃的恒溫振蕩培養箱中160r·min^-1培養24h，采用無菌水將培養后所得菌液的菌落稀釋至4×10⁸cfu·ml^–1。

所述制劑治療和預防番茄灰霉病和/或葉霉病的方法，采用枯草芽孢桿菌bbd012培養液對番茄植株進行噴霧，即將枯草芽孢桿菌bbd012培養液噴在番茄葉片的正反面。

有益效果

本發明的枯草芽孢桿菌bbd012篩選自白扁豆植株，該菌株在與宿主植物協同進化的過程中，形成了穩定的生態關系，內生細菌可以通過自身產生或誘導宿主產生一些抗菌的物質，或通過與植物病原菌競爭生態位和營養物質對植物病害起到防治作用。枯草芽孢桿菌bbd012對番茄灰霉病菌和葉霉病菌具有良好拮抗效果，且該菌株對三種桂花病菌（刺球殼、葡萄座腔菌、炭疽病菌）也有一定的拮抗作用，通過試驗證實枯草芽孢桿菌bbd012菌對番茄灰霉病和葉霉病的的防治效果分別達到64.9%和58.0%，具有很好的防病效果。

生物材料的保藏

一株枯草芽孢桿菌bbd012，分類命名為枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）bbd012，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏單位簡稱為cctcc，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為cctccno：m2017097，保藏日期為2017年3月8日。

附圖說明

圖1是本發明枯草芽孢桿菌bbd012對番茄葉霉病菌的抑菌效果圖；

圖2是本發明枯草芽孢桿菌bbd012對番茄灰霉病菌抑菌效果的圖；

圖中：左為對照，右為抑菌效果。

具體實施方式

實施例1

采用預防番茄灰霉病的制劑進行盆栽番茄防治：

步驟一、接種枯草芽孢桿菌bbd012單菌落于200mllb液體培養基中，28℃的恒溫振蕩培養箱中160r.min^-1培養24h，將所培養的菌液稀釋至4×10⁸cfu.ml^–1，制備出預防番茄灰霉病的制劑；

步驟二、取長至5-6葉，長勢一致的盆栽番茄，用治療和預防番茄灰霉病制劑噴霧至番茄葉片正反面，以清水作為對照，24h后將番茄灰霉病菌的孢子懸浮液1×10⁷個孢子/ml（將少許無菌水注入已長滿灰霉病菌的pda平板內，將瓊脂表面的孢子刮下，倒入無菌容器內，充分振蕩后用滅菌的紗布過濾，于血球計數板中計數）噴霧接種其上。番茄植株培養于人工氣候箱（23℃，r≧90%）中。每個處理3盆，每盆3株，重復3次。接種后7d調查番茄的發病情況，病情分級采取5級標準。0級：無病斑，葉片無癥狀，植株健康；1級：病斑面積占總葉片的10%以下；2級：病斑面積占總葉片的10%-50%；3級：病斑面積占總葉片的50%以上；4級：植株死亡。

病情指數=100×[σ（各級病葉數×病害級別數）]/（調查總葉數×4）防治效果（%）=[（對照病情指數-拮抗菌株處理后病情指數）]/對照病情指數]×100

結果表明：噴霧治療和預防番茄灰霉病制劑的番茄植株比用清水處理的病情指數降低23.1，防治效果為64.9%（見表1）。

表1枯草芽孢桿菌bbd012對番茄灰霉病的防治效果

實施例2

采用預防番茄葉霉病的制劑進行盆栽番茄防治：

步驟一、接種枯草芽孢桿菌bbd012單菌落于200mllb液體培養基中，28℃的恒溫振蕩培養箱中160r.min^-1培養24h，將所培養的菌液稀釋至4×10⁸cfu.ml^–1，制備出預防番茄灰霉病的制劑；

步驟二、取長至5-6葉，長勢一致的盆栽番茄，用治療和預防番茄灰霉病制劑噴霧至番茄葉片正反面，以清水作為對照，24h后將番茄灰霉病菌的孢子懸浮液1×10⁷個孢子/ml（將少許無菌水注入已長滿灰霉病菌的pda平板內，將瓊脂表面的孢子刮下，倒入無菌容器內，充分振蕩后用滅菌的紗布過濾，于血球計數板中計數）噴霧接種其上。番茄植株培養于人工氣候箱（23℃，r≧90%）中。每個處理3盆，每盆3株，重復3次。接種后7d調查番茄的發病情況，病情分級采取5級標準。0級：無病斑，葉片無癥狀，植株健康；1級：病斑面積占總葉片的10%以下；2級：病斑面積占總葉片的10%-50%；3級：病斑面積占總葉片的50%以上；4級：植株死亡。

病情指數=100×[σ（各級病葉數×病害級別數）]/（調查總葉數×4）防治效果（%）=[（對照病情指數-拮抗菌株處理后病情指數）]/對照病情指數]×100

結果顯示：接種bbd012菌株后接種番茄葉霉病菌的番茄植株比用清水處理的病情指數降低17.7，防治效果為58.0%（見表2）。

表2：枯草芽孢桿菌bbd012對番茄葉霉病的防治效果

實施例3

枯草芽孢桿菌bbd012菌株的篩選、分離和純化:

步驟一、培養基的制備：

細菌平板培養用lb培養基（胰蛋白胨10g/l；酵母提取物5g/l；氯化鈉10g/l；瓊脂粉18g/l），液體培養用lb液體培養基（不加瓊脂粉），真菌培養及平板對峙試驗用pda培養基（馬鈴薯200g/l；葡萄糖20g/l；瓊脂粉18g/l）。

步驟二、采集健康白扁豆植株的葉片3g，在75%的酒精中浸泡30s，然后用1%的次氯酸鈉消毒3min，用無菌蒸餾水沖洗5次后，取最后一次的沖洗液200μl涂布于lb培養基平板上；消毒后的葉片于無菌的研缽中研磨，加入5ml無菌蒸餾水混勻，取研磨液200μl，涂布于lb培養基平板上。在28℃下培養，逐日觀察，如最后一次沖洗液涂布的培養基中無菌落，研磨液涂布的培養基中長出的菌落是內生菌，進行純化培養后，4℃冰箱中保存備用。

步驟三、拮抗活性測定

番茄灰霉病菌、番茄葉霉病菌、桂花葉斑病菌(刺球殼)、桂花炭疽病菌和桂花葉斑病菌（葡萄座腔菌）活化培養，制成8mm的菌餅放置于pda培養基中心，四周40mm處分別放置四片8mm大小含有內生細菌的濾紙片，置于28℃培養箱內培養4~5天，測量抑菌圈半徑并計算抑菌率。

結果顯示從健康白扁豆的葉片中共分離出19株內生細菌，其中分離得到的bbd012抑菌活性最強，對番茄葉霉病菌抑菌率達65.32%，圖1；對番茄灰霉病菌抑菌率達79.52%，圖2；對其他三種病原菌也有一定程度的抑制作用，表3。

表3菌株bbd012發酵液對5種病原真菌的抑菌率

步驟四、強拮抗內生菌株的鑒定

1、形態及生理生化鑒定

方法參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》(buchanan＆gibbons，1984)和《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠和蔡妙英，1999)。

1）形態特征

菌株bbd012細胞為桿狀、單生、鞭毛周生，革蘭氏染色陽性。菌落呈白色、不透明，邊緣不規則。

2）生理生化特征

菌株bbd012為好氧菌，不能運動，可以利用蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇，但不能利用乳糖，可以水解淀粉和明膠，可分解牛奶產酸，檸檬酸鹽試驗、v-p試驗、硝酸鹽還原試驗和接觸酶試驗呈陽性，苯丙氨酸脫氫酶實驗、甲基紅試驗和氧化酶試驗呈陰性，最適生長ph7.0，最適生長溫度30℃。

2、16srdna和gyra基因序列測定

以細菌基因組dna快速抽提試劑盒（上海生工生物工程公司refb518225-0050）提取的菌株bbd012基因組dna為模板。16srdnapcr擴增采用引物16sl：5'-acggctaccttgttacgacct-3'（其序列如seqidno:1）和引物16sr：5'-agagtttgatcctggctcag-3'（其序列如seqidno:2）。gyra基因pcr擴增采用引物gyra-f：cgatcaggaaatgcgtacgtcctt（其序列如seqidno:3）和引物gyra-r：caaggtaatgctccaggcattgct（（其序列如seqidno:4））。反應體系(50μl)：10×buffer5.0μl、dntps(2.5mmol·l^-1)4.0μl、引物16sr(10pmol·l^-1)2.0μl、引物16sl(10pmol·l^-1)2.0μl、taq酶(5u·μl^-1)0.5μl、模板dna(50ng·μl^-1)2μl、ddh2o34.5μl。pcr反應程序:94℃5min，94℃1min，50℃1min，72℃2min，30個循環；72℃10min。將pcr產物經純化后送上海生工生物工程公司測序。根據測序結果，用blast軟件從genbank數據庫中調出相關菌株的16srdna序列和gyra基因序列，分別用clustalwv1.82軟件進行多序列比對，之后用mega4.1軟件進行序列分析，采用鄰接法(neighbor-joining，nj法)進行系統發育分析和同源性比較。

結果顯示：菌株bbd012的16srdna（基因序列如seqidno：5所示）和gyra基因序列（如seqidno：6所示）與bacillussubtilis同源性均高達99%。結合其形態特征、生理生化特性、16srdna和gyra基因序列分析，將該菌株鑒定為b.subtilisbbd012。

sequencelisting

<110>河南科技大學

<120>一株枯草芽孢桿菌bbd012及防治番茄病害中的應用

<130>1

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

acggctaccttgttacgacct21

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agagtttgatcctggctca19

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cgatcaggaaatgcgtacgtcctt24

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

caaggtaatgctccaggcattgct24

<210>5

<211>1515

<212>dna

<213>枯草芽孢桿菌

<400>5

tagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgag60

cggacagatgggagcttgctcccggatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggta120

acctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttg180

aaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggc240

gcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgaga300

gggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtag360

ggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttt420

tcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtacct480

tgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgta540

ggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagcc600

tgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgc660

agaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacac720

cagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagc780

gaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggg840

gtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcg900

caagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggttta960

attcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagata1020

ggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgt1080

gagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcag1140

ttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaat1200

catcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagc1260

gaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaa1320

ctcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacg1380

ttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcgg1440

tgaggtaaccttttaggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaggtcgt1500

aacaaggtagccgta1515

<210>6

<211>949

<212>dna

<213>枯草芽孢桿菌

<400>6

catgagcgttattgtgtctcgtgctcttccagatgttcgtgacggtttaaaaccggttca60

cagacggattttatacgcaatgaatgatttgggcatgacaagtgacaaaccttataaaaa120

atccgcgcgtatcgttggagaagttatcgggaaataccacccgcacggtgattcagcggt180

atatgaatccatggtcagaatggctcaggatttcaactaccgttatatgctcgttgacgg240

tcacggaaacttcggttctgttgacggagactcagcggcggccatgcgttatacagaagc300

aagaatgtctaaaatctcaatggagattcttcgtgacatcacaaaagacacaatcgatta360

ccaggataactatgacgggtcagaaagagaacctgtcgttatgccttcaaggttcccgaa420

tcttctcgtgaacggtgctgccggcattgcggtaggtatggcaacaaacattcctccgca480

ccagctgggagaaatcattgacggtgtacttgctgtcagtgagaatccggacattacaat540

tccagagcttatggaagtcattccagggcctgatttcccgaccgcgggtcaaatcttggg600

acgcagcggtatccggaaagcatacgaatcaggccgaggctctatcacgatccgggcaaa660

agctgagatcgaacaaacatcttcgggtaaagaaagaattatcgttacagagttacctta720

ccaagtaaataaggcgaaattaattgagaaaattgccgatctcgtaagggacaaaaagat780

agagggtatcacagatctgcgtgatgagtcagatcgtacaggtatgagaattgtcattga840

aatcagacgcgacgccaatgcaaatgtcatcttaaacaatctgtacaaacaaactgctct900

acaaacatcttttggcatcaacctgcttgcacttgtgatgccagccgaa949