抗MSH6蛋白單克隆抗體及其用途的制作方法

本發明涉及生物技術領域，具體涉及可特異結合msh6蛋白的單克隆抗體umab258、產生所述單克隆抗體的細胞株及應用該抗體用于診斷的方法和用途。

背景技術：

msh6(humanmutshonolog)基因是人類錯配修復系統(mismatchrepairmmr)的主要成員之一,1995年首次發現msh6參與構成錯配結合因子。序列分析證明,msh6是muts同源物家族的成員。1996年,確定了msh6基因的整個編碼區。1997年首次報道了人類hmsh6基因的突變。研究發現,該基因的突變與結腸癌、肝癌、子宮內膜癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、泌尿道上皮腫瘤等的發生密切相關。

子宮內膜癌的高發病率與msh6的突變密切相關。在有多個成員患有子宮內膜癌的家庭發現了msh6突變。goodfellow對441例子宮內膜癌患者研究發現100例患者有msh6基因缺失(23％)；和其他mmr基因比較,msh6基因突變的個體更易發生子宮內膜癌、卵巢癌等惡性腫瘤。因此,在女性篩檢時進行msh6的篩檢可能有很大意義。臨床上常用免疫組織化學(ihc)病理實驗檢測腫瘤細胞中蛋白的表達狀況，然而ihc實驗的核心為特異性結合蛋白的單克隆抗體，其性能的優劣直接決定著整個檢測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結合特異性較高的針對msh6蛋白的單克隆抗體對ihc檢測msh6表達水平具有重要的意義。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種結合特異性較高的msh6蛋白的單克隆抗體，及其在制備用于檢測msh6蛋白的免疫檢測工具中的應用。

本發明提供了一種雜交瘤細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為cgmcc)，保藏日期為2017年4月6日，保藏編號為cgmccno.13822。

本發明還提供了一種特異性結合msh6蛋白的單克隆抗體umab258，由上述雜交瘤細胞株產生。

本發明所述單克隆抗體的制備方法如下：

(1)重組表達載體的構建：根據msh6orf核苷酸序列(msh6orf核苷酸序列如seqidno.1所示，4080bp；msh6氨基酸序列如seqidno.2所示)

設計引物pcr擴增msh6orf第1bp位到第840bp位序列，基因兩側分別引入限制性內切酶位點sgfi和mlui，插入表達載體pet23a-n-his，構建msh6氨基酸序列第1位到第280位的重組表達質粒pet23a-rmsh6；上游擴增引物序列，seqidno.3:cacgcgatcgcatgtcgcgacagagcaccc下游擴增引物序列seqidno.4:accgacgcgtctaactgcttatttcatcactg

(2)msh6重組蛋白的表達與純化：將msh6重組表達質粒轉化e.coli細胞，裂解離心獲得上清，鎳柱親和層析柱純化，獲得純化的msh6重組蛋白；

(3)單克隆抗體的篩選與制備：采用上述純化的msh6重組蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾臟細胞與sp2/0細胞進行融合，有限稀釋法獲得單克隆，elisa法篩選陽性雜交瘤細胞，獲得能分泌抗msh6特異性抗體的雜交瘤細胞株，命名為umab258，亞型鑒定為igg1；通過無血清培養基制備抗體，通過親和層析柱純化獲得msh6單克隆抗體umab258。分別通過westernblot、免疫組化實驗驗證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。

本發明還提供了單克隆抗體umab258在制備用于檢測msh6蛋白的免疫檢測工具中的應用。

具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。

在具體的實施例中，本發明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗體umab258，可檢測組織細胞中msh6的表達狀況。

本發明還提供了上述單克隆抗體在制備用于標記腫瘤的試劑盒中的應用。其中所述腫瘤具體是指腫瘤細胞的增殖與msh6的表達密切相關的腫瘤，包括但不限于結腸癌、肝癌、子宮內膜癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、泌尿道上皮腫瘤。

與現有技術相比，本發明提供了一種雜交瘤細胞株(保藏編號為cgmccno.13822)，以及由此雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體umab258。本發明還提供了單克隆抗體umab258在制備用于檢測msh6蛋白的免疫檢測工具中的應用，含單克隆抗體umab258的免疫組化試劑盒，以及單克隆抗體umab258在制備用于標記腫瘤的試劑盒中的應用。本發明所述單克隆抗體可與msh6蛋白特異性結合，真實反映腫瘤細胞內msh6蛋白表達水平，可應用于結腸癌、肝癌、子宮內膜癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、泌尿道上皮腫瘤msh6蛋白表達水平的檢測。

保藏信息

用于保藏的雜交瘤細胞株umab258的分類命名為：鼠抗人錯配修復蛋白6(msh6)單克隆雜交瘤細胞株；

保藏單位全稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；

保藏單位簡稱：cgmcc；

保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；

保藏日期：2017年4月6日；

保藏編號：cgmccno.13822。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示實施例1克隆位點設計如圖，其中底紋部分為orf區；

圖2——圖8示實施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的結腸癌、肝癌、子宮內膜癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、泌尿道上皮腫瘤免疫組化結果圖(一抗為msh6單克隆抗體umab258)。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例1、msh6重組表達質粒的構建

以從美國傲銳東源生物科技有限公司獲得的質粒rc202469(含msh6orf4080bp)為模板，設計兩條引物并分別引入酶切位點sgfi和mlui，克隆入表達載體pet23a-n-his，建立msh6重組表達質粒。克隆位點設計如圖1所示。

實施例2、msh6重組蛋白的表達與純化

1、轉化e.coli細胞：將100ul感受態細胞置于冰上融化后加入質粒dna輕混勻，冰浴30min后42℃熱激90s，然后將其繼續冰浴1-2min。在超凈臺內加入500ul新鮮無抗lb培養基，于37℃搖床孵育45min后取適量菌液均勻涂布于含抗生素的平板上，將培養皿倒置于37℃恒溫培養箱中培養過夜。

2、裂解細胞：挑取單克隆于新鮮培養基中，37℃、200rpm培養至od值達到0.4～0.6時加入iptg(終濃度1mm)誘導培養7h。離心收集菌體，然后用裂解緩沖液重懸菌體，超聲破碎20min后于4℃下12000rpm離心20min，收集上清。取少量上清蛋白用anti-his抗體做wb鑒定。

3、鎳柱親和層析柱純化：用緩沖液平衡鎳柱，將上清用0.45μm濾膜過濾后上樣并收集流出，用緩沖液淋洗去除未結合的蛋白，最后用含不同濃度咪唑的洗脫液洗脫，分別收集后進行sds-page鑒定，將符合要求的洗脫蛋白合并加入10％甘油，純化后的重組msh6蛋白用sds-page鑒定。

實施例3、msh6單克隆抗體的制備與篩選

根據標準方法用重組產生的純化的msh6蛋白片段用于對balb/c小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)進行免疫。具體方法如下：

1、動物免疫：經過純化的msh6抗原以完全弗氏佐劑乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周齡balb/c小鼠，免疫劑量為50μg/只，間隔兩周后進行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為50μg/只。免疫兩次后取尾血以elisa法梯度稀釋測定血清效價；根據結果確定是否加強免疫，選取抗體效價最高的小鼠進行細胞融合。

2、細胞融合：骨髓瘤細胞采用balb/c來源的sp2/0，融合時處于對數生長期；取已免疫小鼠脾臟，制成淋巴細胞單細胞懸液；小鼠脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培養基及其余終止液，離心棄上清后加入hat培養基懸浮混勻，mc定容到50ml，分裝到3.5cm培養皿中，放于濕盒中，置于37℃、5％co2恒溫培養箱中進行培養。

3、篩選和克隆：融合7-10天內挑選細胞克隆，使用msh6純化重組蛋白進行elisa測試。標記細胞株號。對陽性孔細胞進行有限稀釋，每次有限稀釋后5-6天測定elisa值，挑取od280陽性值較高的單克隆孔進行有限稀釋，直至elisa測定96孔板全板結果為陽性。挑取陽性值高的單克隆定株。其對應融合板細胞株為umab258。

4、腹水單抗的制備與純化：10-12周齡的雄性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射經pbs洗滌重懸的單克隆細胞懸液，細胞用量為5×10⁶/只，每株抗體打2只小鼠。待小鼠腹水積聚后收集腹水，離心取上清，親和層析法進行腹水純化，根據抗體亞型選擇相應柱料，細胞株umab258產生的單抗為igg1，采用proteing進行純化。純化后的單抗濃度測定、wb檢測、分裝、凍存在-20℃。

實施例4、單克隆抗體umab258為一抗的免疫組化檢測

(1)、實驗方法：

1、取福爾馬林固定的人淋巴結組織與人扁桃體組織塊進行石蠟包埋，使用finesse組織切片機進行切片，組織厚度為6μm。

2、脫蠟與水化：分析純二甲苯3×10min，無水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去離子水浸泡3min×3次。

3、加入抗原修復液(0.01m，ph6.0枸櫞酸鈉緩沖液)高壓鍋高壓熱修復3min，待高壓鍋溫度降至約90℃時，打開高壓鍋，取出標本，然后自然冷卻至室溫。去離子水浸泡3min×3次。

4、使用3％過氧化氫滅活組織內源性過氧化物酶，室溫靜置10min。去離子水浸泡5min×3次。

5、加上封閉液(pbs+5％脫脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封閉液，勿沖洗，加入msh6單抗(umab258)，稀釋比：1:150，使用封閉液進行稀釋。置于濕盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗滌2次，每次洗滌5min。pbst(0.02％tween-20)洗滌1次，每次洗滌5min。

7、滴加polink-試劑盒2(catlogno.d37-15)試劑1，37℃孵育10-20分鐘。使用pbs洗滌3次，每次5min。滴加polink-2試劑盒(catlogno.d37-15)試劑2，37℃孵育10-20分鐘，使用pbs洗滌3次，每次5min。

8、應用dab溶液(中杉金橋zli-9019)顯色，顯色3～10min。蒸餾水洗滌。

9、蘇木精復染細胞核2min，蒸餾水漂洗，1％鹽酸分化。蒸餾水漂洗3次，室溫靜置1min。

10、脫水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性樹膠封片。

11、鏡檢，見圖2——圖8。

(2)、實驗結果：

由圖2——圖8結果可見，在結腸癌、肝癌、子宮內膜癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、泌尿道上皮腫瘤中可見到特異性胞核染色。結果與msh6在細胞內的定位及組織表達特異性一致，表明單克隆抗體umab258可用于免疫組織化學檢測msh6蛋白的水平。

實施例5、單克隆抗體umab258的特異性檢測

origene高密度蛋白芯片上包含10,000個hek293t細胞蛋白過表達裂解物，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一種蛋白裂解液的定位可以通過excel文件進行準確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣，每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監控每次免疫反應數據的重復性，以及定位陽性信號的方向。以下為使用origene蛋白(origenecatpa100001)芯片進行umab258抗體鑒定實驗的實驗方法：

1、將一張蛋白芯片放在50ml離心管中，使用40ml去離子水浸潤芯片，置于搖床上，室溫混合30分鐘。棄掉去離子水，使用10mlpbst平衡芯片。室溫處理10分鐘。

2、向50ml離心管中加入40ml5％脫脂牛奶(用pbst進行稀釋)置于搖床上，室溫封閉30分鐘。

3、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋一抗umab258，稀釋比列為1:100。

4、將潔凈的封口膜粘貼到實驗臺上，滴加250-300μl一抗在封口膜上。

5、將蛋白芯片從封閉液中抽出，將蛋白芯片nc膜的一面朝下，從芯片的一邊接觸抗體，慢慢滑下，依靠液體表面張力，抗體將慢慢浸潤芯片nc膜，直至整張nc膜浸潤在一抗溶液中。整個操作過程避免產生氣泡。將芯片移到4℃環境下，靜置，一抗孵育過夜。在芯片上加蓋培養皿蓋，其上黏附一張濕紙巾，以防止長時間孵育導致抗體蒸發。

6、第二天將芯片移至50ml離心管中，使用pbst漂洗芯片兩次，去除多余的抗體。使用40mlpbst(0.1％tween-20)洗滌芯片，置于搖床上混合均勻，洗滌三次，每次洗滌5min。

7、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋二抗dylight649-conjugatedaffinipurefragmentgoat-anti-mouseigg，稀釋比例為1:400。

8、按照上述步驟4，步驟5進行二抗孵育操作。室溫孵育1小時。在芯片上方用鋁箔紙遮蓋，以防止發生信號漂白。

9、按照上述步驟6，使用pbst洗滌芯片。

10、使用去離子水沖洗芯片，以去除殘余的鹽分和變性劑。

11、室溫干燥芯片，確保芯片完全干燥。

12、使用芯片掃描儀讀取熒光信號。

13、根據bsa-cy3以及bsa-cy5確定芯片方向以及陽性信號的位點。

14、根據陽性信號位點找出對應蛋白裂解液id，根據裂解液數據庫信息，查找到對應蛋白名稱，ncbi錄入號(accessionnumber)，蛋白id，蛋白大小等信息。

結果表明單抗umab258在origene蛋白芯片上能特異地識別msh6蛋白，表明單抗umab258的特異性較好。

sequencelisting

<110>無錫傲銳東源生物科技有限公司

<120>抗msh6蛋白單克隆抗體及其用途

<210>1

<211>2961

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

origin

1atgtcgcgacagagcaccctgtacagcttcttccccaagtctccggcgctgagtgatgcc

61aacaaggcctcggccagggcctcacgcgaaggcggccgtgccgccgctgcccccggggcc

121tctccttccccaggcggggatgcggcctggagcgaggctgggcctgggcccaggcccttg

181gcgcgatccgcgtcaccgcccaaggcgaagaacctcaacggagggctgcggagatcggta

241gcgcctgctgcccccaccagttgtgacttctcaccgggagatttggtttgggccaagatg

301gagggttacccctggtggccttgtctggtttacaaccacccctttgatggaacattcatc

361cgcgagaaagggaaatcagtccgtgttcatgtacagttttttgatgacagcccaacaagg

421ggctgggttagcaaaaggcttttaaagccatatacaggttcaaaatcaaaggaagcccag

481aagggaggtcatttttacagtgcaaagcctgaaatactgagagcaatgcaacgtgcagac

541gaagccttaaataaagacaagattaagaggcttgaattggcagtttgtgatgagccctca

601gagccagaagaggaagaagagatggaggtaggcacaacttacgtaacagataagagtgaa

661gaagataatgaaattgagagtgaagaggaagtacagcctaagacacaaggatctaggcga

721agtagccgccaaataaaaaaacgaagggtcatatcagattctgagagtgacattggtggc

781tctgatgtggaatttaagccagacactaaggaggaaggaagcagtgatgaaataagcagt

841ggagtgggggatagtgagagtgaaggcctgaacagccctgtcaaagttgctcgaaagcgg

901aagagaatggtgactggaaatggctctcttaaaaggaaaagctctaggaaggaaacgccc

961tcagccaccaaacaagcaactagcatttcatcagaaaccaagaatactttgagagctttc

1021tctgcccctcaaaattctgaatcccaagcccacgttagtggaggtggtgatgacagtagt

1081cgccctactgtttggtatcatgaaactttagaatggcttaaggaggaaaagagaagagat

1141gagcacaggaggaggcctgatcaccccgattttgatgcatctacactctatgtgcctgag

1201gatttcctcaattcttgtactcctgggatgaggaagtggtggcagattaagtctcagaac

1261tttgatcttgtcatctgttacaaggtggggaaattttatgagctgtaccacatggatgct

1321cttattggagtcagtgaactggggctggtattcatgaaaggcaactgggcccattctggc

1381tttcctgaaattgcatttggccgttattcagattccctggtgcagaagggctataaagta

1441gcacgagtggaacagactgagactccagaaatgatggaggcacgatgtagaaagatggca

1501catatatccaagtatgatagagtggtgaggagggagatctgtaggatcattaccaagggt

1561acacagacttacagtgtgctggaaggtgatccctctgagaactacagtaagtatcttctt

1621agcctcaaagaaaaagaggaagattcttctggccatactcgtgcatatggtgtgtgcttt

1681gttgatacttcactgggaaagtttttcataggtcagttttcagatgatcgccattgttcg

1741agatttaggactctagtggcacactatcccccagtacaagttttatttgaaaaaggaaat

1801ctctcaaaggaaactaaaacaattctaaagagttcattgtcctgttctcttcaggaaggt

1861ctgatacccggctcccagttttgggatgcatccaaaactttgagaactctccttgaggaa

1921gaatattttagggaaaagctaagtgatggcattggggtgatgttaccccaggtgcttaaa

1981ggtatgacttcagagtctgattccattgggttgacaccaggagagaaaagtgaattggcc

2041ctctctgctctaggtggttgtgtcttctacctcaaaaaatgccttattgatcaggagctt

2101ttatcaatggctaattttgaagaatatattcccttggattctgacacagtcagcactaca

2161agatctggtgctatcttcaccaaagcctatcaacgaatggtgctagatgcagtgacatta

2221aacaacttggagatttttctgaatggaacaaatggttctactgaaggaaccctactagag

2281agggttgatacttgccatactccttttggtaagcggctcctaaagcaatggctttgtgcc

2341ccactctgtaaccattatgctattaatgatcgtctagatgccatagaagacctcatggtt

2401gtgcctgacaaaatctccgaagttgtagagcttctaaagaagcttccagatcttgagagg

2461ctactcagtaaaattcataatgttgggtctcccctgaagagtcagaaccacccagacagc

2521agggctataatgtatgaagaaactacatacagcaagaagaagattattgattttctttct

2581gctctggaaggattcaaagtaatgtgtaaaattatagggatcatggaagaagttgctgat

2641ggttttaagtctaaaatccttaagcaggtcatctctctgcagacaaaaaatcctgaaggt

2701cgttttcctgatttgactgtagaattgaaccgatgggatacagcctttgaccatgaaaag

2761gctcgaaagactggacttattactcccaaagcaggctttgactctgattatgaccaagct

2821cttgctgacataagagaaaatgaacagagcctcctggaatacctagagaaacagcgcaac

2881agaattggctgtaggaccatagtctattgggggattggtaggaaccgttaccagctggaa

2941attcctgagaatttcaccactcgcaatttgccagaagaatacgagttgaaatctaccaag

3001aagggctgtaaacgatactggaccaaaactattgaaaagaagttggctaatctcataaat

3061gctgaagaacggagggatgtatcattgaaggactgcatgcggcgactgttctataacttt

3121gataaaaattacaaggactggcagtctgctgtagagtgtatcgcagtgttggatgtttta

3181ctgtgcctggctaactatagtcgagggggtgatggtcctatgtgtcgcccagtaattctg

3241ttgccggaagataccccccccttcttagagcttaaaggatcacgccatccttgcattacg

3301aagactttttttggagatgattttattcctaatgacattctaataggctgtgaggaagag

3361gagcaggaaaatggcaaagcctattgtgtgcttgttactggaccaaatatggggggcaag

3421tctacgcttatgagacaggctggcttattagctgtaatggcccagatgggttgttacgtc

3481cctgctgaagtgtgcaggctcacaccaattgatagagtgtttactagacttggtgcctca

3541gacagaataatgtcaggtgaaagtacattttttgttgaattaagtgaaactgccagcata

3601ctcatgcatgcaacagcacattctctggtgcttgtggatgaattaggaagaggtactgca

3661acatttgatgggacggcaatagcaaatgcagttgttaaagaacttgctgagactataaaa

3721tgtcgtacattattttcaactcactaccattcattagtagaagattattctcaaaatgtt

3781gctgtgcgcctaggacatatggcatgcatggtagaaaatgaatgtgaagaccccagccag

3841gagactattacgttcctctataaattcattaagggagcttgtcctaaaagctatggcttt

3901aatgcagcaaggcttgctaatctcccagaggaagttattcaaaagggacatagaaaagca

3961agagaatttgagaagatgaatcagtcactacgattatttcgggaagtttgcctggctagt

4021gaaaggtcaactgtagatgctgaagctgtccataaattgctgactttgattaaggaatta

//

<210>2

<211>986

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

origin

1msrqstlysffpkspalsdankasarasreggraaaapgaspspggdaawseagpgprpl

61arsasppkaknlngglrrsvapaaptscdfspgdlvwakmegypwwpclvynhpfdgtfi

121rekgksvrvhvqffddsptrgwvskrllkpytgskskeaqkgghfysakpeilramqrad

181ealnkdkikrlelavcdepsepeeeeemevgttyvtdkseedneieseeevqpktqgsrr

241ssrqikkrrvisdsesdiggsdvefkpdtkeegssdeissgvgdseseglnspvkvarkr

301krmvtgngslkrkssrketpsatkqatsissetkntlrafsapqnsesqahvsgggddss

361rptvwyhetlewlkeekrrdehrrrpdhpdfdastlyvpedflnsctpgmrkwwqiksqn

421fdlvicykvgkfyelyhmdaligvselglvfmkgnwahsgfpeiafgrysdslvqkgykv

481arveqtetpemmearcrkmahiskydrvvrreicriitkgtqtysvlegdpsenyskyll

541slkekeedssghtraygvcfvdtslgkffigqfsddrhcsrfrtlvahyppvqvlfekgn

601lsketktilksslscslqeglipgsqfwdasktlrtlleeeyfreklsdgigvmlpqvlk

661gmtsesdsigltpgekselalsalggcvfylkkclidqellsmanfeeyipldsdtvstt

721rsgaiftkayqrmvldavtlnnleiflngtngstegtllervdtchtpfgkrllkqwlca

781plcnhyaindrldaiedlmvvpdkisevvellkklpdlerllskihnvgsplksqnhpds

841raimyeettyskkkiidflsalegfkvmckiigimeevadgfkskilkqvislqtknpeg

901rfpdltvelnrwdtafdhekarktglitpkagfdsdydqaladireneqslleylekqrn

961rigcrtivywgigrnryqleipenfttrnlpeeyelkstkkgckrywtktiekklanlin

1021aeerrdvslkdcmrrlfynfdknykdwqsaveciavldvllclanysrggdgpmcrpvil

1081lpedtppflelkgsrhpcitktffgddfipndiligceeeeqengkaycvlvtgpnmggk

1141stlmrqagllavmaqmgcyvpaevcrltpidrvftrlgasdrimsgestffvelsetasi

1201lmhatahslvlvdelgrgtatfdgtaianavvkelaetikcrtlfsthyhslvedysqnv

1261avrlghmacmvenecedpsqetitflykfikgacpksygfnaarlanlpeeviqkghrka

1321refekmnqslrlfrevclaserstvdaeavhklltlikel