影響煙草色素含量的NtWRKY69基因及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)影響煙草色素含量的ntwrky69基因及其應(yīng)用的專利申請(qǐng)。

背景技術(shù)：

煙草是雙子葉植物綱管花目茄科煙草屬植物，煙草屬(nicotiana)有60多個(gè)種，其中2個(gè)栽培種中的普通煙草(又稱紅花煙草，nicotianatabacum)占據(jù)主要面積，黃花煙草(nicotianarustica)的面積很小。栽培煙草按煙葉品質(zhì)特點(diǎn)、生物學(xué)性狀和栽培調(diào)制方法等可分為烤煙、曬煙、晾煙、白肋煙、香料煙和黃花煙六個(gè)類型，其中烤煙是栽培最廣的普通煙草。我國(guó)烤煙種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一位。

作為一種葉用經(jīng)濟(jì)作物，烤煙的栽培技術(shù)有別于其它大田作物，不僅要求有一定的煙葉產(chǎn)量，而且更注重?zé)熑~品質(zhì)。煙葉品質(zhì)決定煙葉的可用性，直接影響卷煙商品的色、香、味和商品價(jià)值，也關(guān)系到煙農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益，是煙草行業(yè)的生命和出發(fā)點(diǎn)。為使在未來(lái)的國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中立于不敗之地，滿足國(guó)內(nèi)外卷煙企業(yè)對(duì)優(yōu)質(zhì)煙葉不斷增長(zhǎng)的需求，必須提高煙葉品質(zhì)和安全性。

植物色素是煙草中一類重要的化合物，主要包括葉綠素和類胡羅卜素類物質(zhì)。葉綠素在煙草成熟和煙葉調(diào)制過(guò)程中會(huì)大量降解消失，其主要降解方式有兩種：一種方式是葉綠素由噗啉環(huán)降解產(chǎn)生吡咯類化合物，從而增加煙葉陳化香；另一種方式是葉綠素水解產(chǎn)生的植醇可進(jìn)一步降解成新植二烯，并再降解成植物呋喃，轉(zhuǎn)化成煙葉的清甜成分。一般而言，葉綠素充分降解后對(duì)煙質(zhì)有利，但如果不能降解完全，在干煙葉中，葉綠素就會(huì)變成一種不利的化學(xué)成分，進(jìn)而使煙葉帶有明顯青雜氣。如果葉綠素在調(diào)制處理過(guò)程中沒(méi)有充分降解就把煙葉烤干，就會(huì)烤出不同程度的“青黃煙”?！扒帱S煙”不僅外觀品質(zhì)不良，而且對(duì)于煙葉質(zhì)量影響十分明顯；因而葉綠素是否降解充分是煙葉分級(jí)中被嚴(yán)格控制的指標(biāo)之一。煙葉中的黃色素主要是類胡蘿卜素，煙葉中的類胡蘿卜素含量與煙葉品質(zhì)存在正相關(guān)關(guān)系，一方面是煙葉外觀品質(zhì)與該類成分含量直接相關(guān)；另一方面類胡蘿卜素是煙草香氣成分的重要前體物質(zhì)，對(duì)煙草的香氣量和香氣品質(zhì)呈正相關(guān)關(guān)系。煙葉中的香味成分很大一部分是類胡蘿卜素的降解產(chǎn)物，其中不少化合物是煙草中關(guān)鍵的致香成分，如紫羅蘭酮、大馬酮和異佛爾酮等。

由于煙葉中色素類物質(zhì)與煙葉品質(zhì)、煙葉質(zhì)量關(guān)系十分緊密，因而對(duì)煙葉色素有關(guān)基因的充分和深入研究，從而對(duì)色素類物質(zhì)進(jìn)行有針對(duì)性調(diào)控，對(duì)于煙葉品質(zhì)改善和煙葉品種改良具有十分重要的理論和應(yīng)用意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一個(gè)影響煙草色素含量的ntwrky69基因，從而能夠?qū)煵葜猩仡愇镔|(zhì)含量有所調(diào)控，進(jìn)而為煙草質(zhì)量改善奠定基礎(chǔ)。

本申請(qǐng)所采取的技術(shù)方案詳述如下。

一個(gè)影響煙草色素含量的ntwrky69基因，包括918bp堿基，其堿基序列如seqidno.1所示；其中第80-600位核苷酸是其特異性核心片段。

影響煙草色素含量的ntwrky69基因所編碼蛋白，包括305個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述影響煙草色素含量的ntwrky69基因在煙草中的應(yīng)用，該基因與煙草色素含量高度相關(guān)，將該基因沉默后，煙草中色素類物質(zhì)含量明顯降低。

用于沉默影響煙草色素含量ntwrky69基因的rnai載體trv2-ntwrky69，構(gòu)建方法為：以ntwrky69基因中第80-600位核苷酸作為vigs的引導(dǎo)序列，將此核酸片段插入trv2載體中，構(gòu)建獲得trv2-ntwrky69載體。

所述用于沉默影響煙草色素含量ntwrky69基因的rnai載體trv2-ntwrky69在植物中的應(yīng)用，用于沉默ntwrky69基因，進(jìn)而下調(diào)植物中色素類物質(zhì)表達(dá)量。

利用所述用于沉默影響煙草色素含量ntwrky69基因的rnai載體trv2-ntwrky69所構(gòu)建的ntwrky69基因沉默植物新品種的培育方法，具體方法為：

通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)、瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)或基因組編輯技術(shù)等干擾、沉默、敲除ntwrky69基因，可獲得色素含量變化的煙草轉(zhuǎn)化植株新品種（也可采用其他載體以對(duì)ntwrky69基因進(jìn)行超量表達(dá)，構(gòu)建ntwrky69基因超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物新品種）；具體而言：

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將rnai載體trv2-ntwrky69轉(zhuǎn)化植株，通過(guò)篩選、鑒定獲得ntwrky69基因沉默植株，所述ntwrky69基因沉默植株其表型為，基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株中色素類物質(zhì)含量比正常植株明顯下降。

本申請(qǐng)中，通過(guò)對(duì)煙草ntwrky69基因的克隆、對(duì)應(yīng)蛋白的分析，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該基因在煙草色素合成途徑調(diào)控上具有重要的用途，與植物葉片中色素類物質(zhì)含量高度相關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在將ntwrky69基因沉默后，新的轉(zhuǎn)基因植株中的色素類物質(zhì)含量明顯降低。利用這一特性，可為煙草的基因工程育種或其他植物新品種培育提供新的策略和路徑。

附圖說(shuō)明

圖1為與對(duì)照植株相比ntwrky69基因沉默植株中該基因的相對(duì)表達(dá)量；

圖2為病毒誘導(dǎo)ntwrky69基因沉默的煙葉及對(duì)照煙葉中的主要色素含量比較。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明，在介紹具體實(shí)施例前，就下述實(shí)施例中所涉及部分生物材料、實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)儀器等基本情況簡(jiǎn)要介紹如下。

生物材料：

煙草材料，栽培煙草（nicotianatabacum）k326品種，購(gòu)買于玉溪中煙種子有限責(zé)任公司；

本氏煙（nicotianabenthamiana），種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所饋贈(zèng)；

沉默煙草基因所用到的載體質(zhì)粒trv2-lic、trv1、trv2、trv2-pds載體等，購(gòu)買于中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心；

基因測(cè)序及引物合成由上海生工生物工程有限公司提供完成；

實(shí)驗(yàn)試劑：

限制性內(nèi)切酶、datp、dttp、primerstargxldnapolymerase、dna凝膠回收試劑盒minibestagarosegeldnaextractionkit、質(zhì)粒dna小量純化試劑盒minibestplasmidpurificationkit、乙酰丁香酮等，均為takara生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；

t4dnapolymerase、rna提取trizol試劑等，為invitrogen公司產(chǎn)品；

反轉(zhuǎn)錄試劑盒，roche公司產(chǎn)品；

dnaase酶，fermentas公司產(chǎn)品；

mes，sigma公司產(chǎn)品；卡那霉素、利福平等抗生素購(gòu)于上海生工生物工程有限公司；

部分試劑配方及配制方法簡(jiǎn)要說(shuō)明如下：

（1）lb液體培養(yǎng)基（1l）：10g細(xì)菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone），10g氯化鈉（nacl），5g酵母抽提物（yeastextract），高溫高壓滅菌；

（2）1m2-(n-嗎啉)乙磺酸（mes）儲(chǔ)備液：ddh2o溶解mes，過(guò)濾滅菌，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

（3）200mm乙酰丁香酮（acetosyringone）儲(chǔ)備液：無(wú)水乙醇溶解乙酰丁香酮，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

實(shí)驗(yàn)儀器：

梯度pcr儀mastercyclerepgradient（用于克隆目的基因片段），德國(guó)eppendorf公司產(chǎn)品。

實(shí)施例1

本實(shí)施例主要就影響煙草色素含量的ntwrky69基因的獲得過(guò)程，簡(jiǎn)要介紹如下。

（1）煙草rna提取及cdna合成

rna提取，具體可參考如下步驟：

以生長(zhǎng)4周大小的栽培煙草k326幼嫩葉片為樣品，經(jīng)液氮充分研磨成粉狀后，取約100mg粉末狀材料置于盛有1.0ml的trizol試劑的1.5ml離心管中，加入200μl氯仿；振蕩混勻，離心后，小心取出上層水相，轉(zhuǎn)入另一離心管中；加入500μl異丙醇，沉淀、離心分離出rna，再經(jīng)75%酒精洗滌，室溫微干后，加入適當(dāng)體積的rnasefree的水，充分溶解；

對(duì)所提取總rna進(jìn)行dnasei處理，10μl的消化反應(yīng)體系設(shè)計(jì)如下：

所提取rna，1μg；

10×reactionbufferwithmgcl2，1μl；

dnasei,rnase-free，1μl（1u）；

depc-treatedwater加至10μl；

37℃水浴中放置30min。

對(duì)上述dnasei處理后rna提取物進(jìn)行cdna反轉(zhuǎn)錄，具體可參考如下操作步驟。

第一鏈合成：在無(wú)菌的0.2ml離心管中配置下列模板rna/引物混合液（7μl體系）：

模板rna(100ng/μl)，1μl；

oligo(dt)primer(50μm)，1μl；

rnasefreedh2o，5μl；

70℃保溫10min后，迅速在冰上急冷2min以上，離心數(shù)秒鐘使模板rna/引物的變性溶液聚集于離心管底部；

在上述離心管中配置如下10μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體系：

上述模板rna/引物變性溶液，7μl；

5×m-mlvbuffer，2μl；

dntp(mixture，各10mm)，0.5μl；

rnaseinhibitor（40u/μl），0.25μl；

rtasem-mlv(rnaseh-)(200u/μl)，0.25μl；

42℃保溫1h；70℃保溫15min，然后冰上冷卻，所得cdna用于后續(xù)pcr擴(kuò)增。

（2）pcr擴(kuò)增獲得ntwrky69基因

設(shè)計(jì)用于pcr擴(kuò)增獲得ntwrky69基因全長(zhǎng)的引物序列如下：

ntwrky69-f:5'-atggatggaagattcaata-3'，

ntwrky69-r:5'-tcagcccgtggtcccacacc-3'；

以上述步驟（1）中所制備cdna為模板，50μl擴(kuò)增體系設(shè)計(jì)如下：

gxlpolymerase，1μl；

cdna，1μl；

5×gxlbuffer，10μl；

dntpmixture(10mm)，4μl；

primer-f/r，8μl；

ddh2o，26μl；

pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃、10sec；55℃、15sec，68℃、1min；40個(gè)循環(huán)。

對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化后，測(cè)序獲得影響煙草色素含量的ntwrky69基因序列，其堿基序列如seqidno.1所示，包括918bp堿基，其中第80-600位核苷酸是其特異性核心片段。

對(duì)該基因序列進(jìn)行翻譯后，其所編碼蛋白序列如seqidno.2所示，包括305個(gè)氨基酸。

實(shí)施例2

利用實(shí)施例1中所獲得影響煙草色素含量的ntwrky69基因，發(fā)明人進(jìn)一步構(gòu)建了基因沉默用rnai干涉載體trv2-ntwrky69，相關(guān)構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)要介紹如下。

選擇此基因中較特異的一段核酸片段（序列表seqidno.1的第80-600位核苷酸序列）為vigs的引導(dǎo)序列，設(shè)計(jì)引物獲得此序列。然后將此核酸片段插入vigs載體中，構(gòu)建trv2-ntwrky69載體，具體構(gòu)建過(guò)程為：

（1）獲得目的片段，選擇此基因中較特異的一段核酸片段（序列表seqidno.1的第80-600位核苷酸序列）為vigs的引導(dǎo)序列，設(shè)計(jì)引物并以實(shí)施1所獲得的基因全長(zhǎng)為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得目的基因片段，引物序列設(shè)計(jì)如下：

ntwrky69-vi-f：5’-cgacgacaagaccctcgccgcgttccgacatgtt-3’，

ntwrky69-vi-r：5’-gaggagaagagccctcgattgacttgcgaaattgc-3’；

ntwrky69-vi-f引物5’端部分序列“cgacgacaagaccct”與ntwrky69-vi-r引物5’端部分序列“gaggagaagagccct”為trv2-lic載體的接頭序列；

pcr擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：520bp。

（2）構(gòu)建trv2-ntwrky69載體，先用限制性內(nèi)切酶psti將trv2-lic質(zhì)粒進(jìn)行單酶切并回收酶切產(chǎn)物，然后用t4dna聚合酶分別對(duì)trv2-lic的單酶切產(chǎn)物片段與步驟（1）中所得目的片段（即ntwrky69基因特異片段）進(jìn)行連接處理；

10μl連接體系設(shè)計(jì)如下：

t4dna聚合酶，1μl；

10xt4dna聚合酶buffer，1μl；

trv2-lic單酶切片段（或ntwrky69基因特異片段），7μl；

dttp，1μl；

22℃連接30min，隨后70℃、20min；

隨后將上述分別處理后的trv2-lic質(zhì)粒載體片段和基因片段充分混勻，65℃、2min，再22℃、10min保溫處理；

將此連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5α，在含有卡那霉素（50mg/l）的lb培養(yǎng)基上涂布，37℃過(guò)夜倒置培養(yǎng)形成單菌落，對(duì)單菌落檢測(cè)，獲得構(gòu)建正確的trv2-ntwrky69重組載體。

為對(duì)植株中ntwrky69基因沉默，一般而言，需要將trv2-ntwrky69重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，進(jìn)一步利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法，將trv2-ntwrky69重組載體整合進(jìn)植株基因組中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因ntwrky69基因的沉默。

將trv2-ntwrky69重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，一般尚需進(jìn)一步篩選、鑒定以獲得用于轉(zhuǎn)化的工程菌，具體操作過(guò)程參考如下：

將trv2-ntwrky69轉(zhuǎn)化gv3301農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，涂布在lb平板（含50mg/l卡那霉素、50mg/l利福平）上，28℃倒置黑暗培養(yǎng)2~3天，挑取單菌落，并利用菌落pcr篩選攜帶ntwrky69基因片段的農(nóng)桿菌單克??；10μl的菌落pcr擴(kuò)增檢測(cè)體系設(shè)計(jì)如下：

gxlpolymerase，0.2μl；

5×gxlbuffer，2μl；

dntpmixture(10mm)，0.8μl；

primer-f/r（實(shí)施例1中ntwrky69-f/r引物），1.6μl；

ddh2o，5.2μl；

菌落，0.2μl；

pcr反應(yīng)程序：98℃、10sec；55℃、15sec，68℃、30sec，35個(gè)循環(huán)。

實(shí)施例3

利用實(shí)施例2所構(gòu)建的含有vigs沉默載體trv2-ntwrky69的工程菌，以本氏煙草為例，發(fā)明人進(jìn)一步進(jìn)行了栽培試驗(yàn)，以沉默植物體內(nèi)影響煙草色素含量的ntwrky69基因，相關(guān)實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)要介紹如下。

（1）將煙草種子播種于育苗缽中育苗，待發(fā)芽后兩周進(jìn)行分苗，種于塑料缽（10cm×10cm）中，于22℃，16h光照/8h黑暗條件下進(jìn)行日常肥水管理等；生長(zhǎng)4周，選取長(zhǎng)勢(shì)一致幼苗分組備用；

（2）將含有trv1、trv2、trv2-ntwrky69、trv2-pds農(nóng)桿菌單菌落（其他質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程參考前述構(gòu)建過(guò)程即可）接入5ml的lb培養(yǎng)基中(含50mg/l卡那霉素、50mg/l利福平)，28℃、180r/min過(guò)夜振蕩培養(yǎng)至od600約為1.0；

將生長(zhǎng)起來(lái)的菌液接種到30ml的lb液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，28℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)至od約為2.0；

3900r/min離心15min收集農(nóng)桿菌到50ml離心管中，棄上清，向各菌體中加入注射緩沖液（10mm的mes，10mm的mgcl2，250μm的乙酰丁香酮），調(diào)od值約為1.0，室溫放置3-6小時(shí)，再向trv2、trv2-ntwrky69、trv2-pds懸浮液中等體積加入trv1懸浮液，混勻；

（3）挑選長(zhǎng)勢(shì)一致，約4-5片葉子的煙草植株，用1ml無(wú)針頭無(wú)菌注射器通過(guò)壓濾法把含有不同trv重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌懸浮液從葉片背面壓入全部展開(kāi)的葉片中，使菌液充滿整個(gè)葉片，于22℃，75%空氣濕度中培養(yǎng)；

接種2周后，采集新生葉片提取rna，利用實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)基因沉默效率，同時(shí)取材利用高效液相色譜法測(cè)量煙草葉片色素類物質(zhì)含量。

分析結(jié)果表明，病毒誘導(dǎo)沉默的trv2-ntwrky69植株中ntwrky69基因的表達(dá)水平僅為對(duì)照的10%左右（結(jié)果如圖1所示），說(shuō)明沉默效果顯著。trv2-ntwrky69植株中新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素、葉綠素a、葉綠素b和β胡蘿卜素雙含量與對(duì)照植株相比顯著下降（圖2和下表所示），說(shuō)明ntwrky69基因與煙草色素含量相關(guān)。

ntwrky69沉默煙草植株色素含量測(cè)定（對(duì)照樣品表示空白載體對(duì)照）：

。

綜合上述結(jié)果可以看出，ntwrky69基因與植物煙葉色素含量高度相關(guān)，通過(guò)沉默ntwrky69基因，可明顯調(diào)整煙葉中的色素含量，進(jìn)而可為煙草改良或其他植物新品種培育奠定基礎(chǔ)。

sequencelisting

<110>中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院

<120>影響煙草色素含量的ntwrky69基因及其應(yīng)用

<130>none

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>918

<212>dna

<213>nicotianatabacumk326

<400>1

atggatggaagattcaataacatttttttatctcatgagcaagaagattccgagaattcg60

ccggaaaacagcctcgattcgccgcgttccgacatgttcaacgataacaagatgatgact120

tctacttcctcccctaaaagaagcagaagatccatacaaaagagagtggtatcagtgcca180

attaaagaagttgaaggatcaaagatgaagggtgaaataagcatgccgccatctgattct240

tgggcatggaggaaatatggacaaaaacccatcaaaggctctccctatcctaggggatat300

tatagatgcagtagttcaaagggatgtccagcaagaaaacaagttgaaaggagccgtgca360

gaccctaacatgttagttgtgacgtattcttgtgaacataaccacccttggccggcttct420

aggaataatcaacacaatcaacgtacaactaccactacatcatgtaccaataatgcaaag480

acgaagacgaaaacattagcatcactaacagcagcagcaacaacaataataacaactacc540

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gagcccaattcggatgaaaaatttaccaatctcggtgaatcttcactaattagttgcaac660

gaatttggatggttttcggattttgagtgttcttctactaccatgctagaaagtcctatt720

ttaaccgaagtcgacgttactgatattgacatgtcatcaactttaacaacattgagagaa780

gaagatgattcacttttcgccgatctcggagagttgccggaatgttcaagggtgtttggc840

cgtggaatgatggaaagggacgaggaacgccggcgacatagcttgagcttgacaccttgg900

tgtgggaccacgggctga918

<210>2

<211>305

<212>prt

<213>nicotianatabacumk326

<400>2

metaspglyargpheasnasnilepheleuserhisgluglngluasp

151015

sergluasnserprogluasnserleuaspserproargseraspmet

202530

pheasnaspasnlysmetmetthrserthrserserprolysargser

354045

argargserileglnlysargvalvalservalproilelysgluval

505560

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65707580

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859095

proargglytyrtyrargcysserserserlysglycysproalaarg

100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

thrserasnphealaserglnsergluproasnseraspglulysphe

195200205

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210215220

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225230235240

leuthrgluvalaspvalthraspileaspmetserserthrleuthr

245250255

thrleuargglugluaspaspserleuphealaaspleuglygluleu

260265270

proglucysserargvalpheglyargglymetmetgluargaspglu

275280285

gluargargarghisserleuserleuthrprotrpcysglythrthr

290295300

gly

305