一種人急性胰腺炎小鼠模型的構建方法與流程
技術領域：
本發明屬于動物模型構建領域，具體涉及一種人急性胰腺炎小鼠模型的構建方法。
背景技術：
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急性胰腺炎(acutepancreatitis，ap)是一種臨床上常見，且具有潛在致命危險的急腹癥。盡管對ap的診治取得了很大進展，但病死率仍在10％左右，重癥患者達50％。其中最重要的原因在于，ap的初始化的具體機制并未被完全認識，也就無從指導新的、更有效的治療胰腺炎藥物的開發。近20多年來，大量的、基于實驗性胰腺炎動物模型的研究發現腺泡細胞內胰蛋白酶原(trypsingen)過早激活在ap初始化過程中起到了關鍵作用。但是關于trypsingen活化的具體機制及其在胰腺炎發展過程中的作用地位尚未得到明確解釋。造成目前胰腺炎領域研究遲滯不前的重要原因在于：缺乏理想的實驗動物模型來完成體內試驗。
目前，有以下幾種實驗性急性胰腺炎的動物模型被廣泛使用，包括雨蛙素注射、胰管結扎、膽鹽胰管逆行灌注、乙硫氯酸飲食以及精氨酸注射等方法。這些動物模型在很大程度上加深了我們對急性胰腺炎早期腺泡損傷機制的認識。然而，這些動物模型在誘發胰腺炎的過程中往往會產生非特異性的表現，而不是針對胰蛋白酶原特異性的激活。并且在過去40年里，超過70例的臨床試驗并沒有發現明確的實驗證據：抑制胰蛋白酶(trypsin，為trypsingen活化產生)激活可以改善胰腺炎的發病過程。針對臨床與動物實驗結果的不一致性的最大可能就是現有的動物模型并不適合研究腺泡內胰蛋白酶原的激活在胰腺炎起始發病階段中的作用，以及檢測潛在性的藥物對于胰腺炎治療和保護的作用。因此，新型的動物模型亟需構建用來研究胰腺炎起始過程中胰蛋白酶的作用，而轉基因動物為基礎研究及新藥的開發帶來了可能。
saluja等利用基因敲除的方法建立了敲除trypsingen異質體表達基因(為小鼠的基因)的轉基因小鼠，并進行了初步研究。與傳統觀點不同在于，他們認為：腺泡內胰蛋白酶原的活化導致了ap早期腺泡的壞死，這些損傷占到了ap50％的損傷。但是，ap局部及全身的炎癥反應，以及慢性胰腺炎的進展并不需要trypsingen的活化。
技術實現要素：
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本發明的目的是提供一種人急性胰腺炎小鼠模型的構建方法，利用本發明的方法構建得到的人急性胰腺炎小鼠模型，符合人陽離子胰蛋白酶原基因定位表達于胰腺腺泡細胞，同時必須使用人源性的彈性蛋白酶作為啟動子，并且其表型與人急性胰腺炎的發病過程十分相似，因而是一種非常好的人急性胰腺炎的疾病模型。
本發明的人急性胰腺炎小鼠模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
構建含有prss1基因(humancationictrypsingen，人陽離子胰蛋白酶原基因)的打靶載體質粒，將含有prss1基因的打靶載體質粒電轉入小鼠胚胎干細胞，得到攜帶有重組prss1基因的小鼠胚胎干細胞；將攜帶有重組prsss1基因的小鼠胚胎干細胞顯微注射入白化的小鼠囊胚期細胞中，將注射完畢后的囊胚期細胞移入假孕母鼠子宮內待產，移植后獲得嵌合鼠；將嵌合率>50％的雄性嵌合體小鼠與野生型c57bl/6j雌性小鼠合籠，繁殖產生下一代小鼠，篩選攜帶有prss1基因的小鼠，即為模擬人急性胰腺炎的小鼠模型。
所述的含有prss1基因(humancationictrypsingen，人陽離子胰蛋白酶原基因)的打靶載體質粒，其核苷酸序列優選如seqidno.1所示。
進一步，含有prss1基因(humancationictrypsingen，人陽離子胰蛋白酶原基因，genbankaccessionnumber:nm_002769.4)的打靶載體質粒構建方法如下：
以prss1-bac質粒為模板，在引物pcr1f和pcr1r、pcr2f和pcr2r、pcr3f和pcr3r的作用下進行pcr擴增，分別獲得擴增產物prss1-pcr1、擴增產物prss1-pcr2和擴增產物prss1-pcr3；將prss1-pcr1與載體pl253連接形成質粒prss1-pcr1-pl253，再將擴增產物prss1-pcr2與質粒prss1-pcr1-pl253通過雙酶切后進行連接，形成質粒prss1-pcr1-pcr2-pl253，然后將擴增產物prss1-pcr3與質粒prss1-pcr1-pcr2-pl253經雙酶切后進行連接，形成質粒prss1-pcr1-pcr2-pcr3-pl253。
所述的攜帶有重組prss1基因的小鼠胚胎干細胞構建方法如下：
(1)用noti處理含有prss1基因的打靶載體質粒，使之線性化，調整質粒載體的dna濃度約為1-5μg/μl；
(2)受精卵的準備：篩選3-4周c57bl/6j雌鼠，分別注射孕馬血清(pmsg)與絨毛膜促性腺激素(hcg)，兩者時間間隔46-48h。注射hcg后將雌鼠與成年的可育成年雄鼠交配，使雌鼠受精。次日將雌鼠安樂死后，從輸卵管內收集受精卵，在培養箱內培養備用。
(3)原核顯微注射：制備顯微注射注射針和固定針。將已線性化和純化的含有prss1基因的打靶載體質粒稀釋為1-5ng/ul的注射液，將注射液加樣到顯微注射針內。篩選形態正常的受精卵置于注射皿內進行顯微注射。在200-400倍的倒置顯微鏡下，將外源的dna溶液(注射液)通過顯微注射的方式注射到受精卵細胞核內。將注射完畢的受精卵轉移到培養箱內，培養1h后進行移植；或者培養至2cell，待第二天進行移植。
(4)代孕鼠制備及胚胎移植：
準備假孕母鼠：選取適齡的可育與輸精管結扎后絕育的雄鼠交配，剌激雌鼠發生一系列妊娠變化而得到假孕母鼠，作為受精卵轉基因后的代孕鼠。將已經注射了外源基因的受精卵移植入見栓當天的代孕母鼠的輸卵管內。將代孕母鼠放在干凈的籠盒中，并保溫待其清醒后放回籠架飼養。輸卵管移植成功后，母鼠一般會在手術后19-20天產仔。小鼠出生1周后，可對小鼠進行剪爪編號，同時進行pcr鑒定；小鼠出生3周后，可分籠獨立飼養。
(5)出生f0小鼠的鑒定：采集1-2周齡的幼鼠組織(尾巴或者腳趾組織)，對組織進行裂解和提取基因組。用針對目的基因的特異性引物進行pcr擴增及電泳檢測，篩選出外源基因整合的后代。有整合的鼠稱為首建鼠(founder)，可進行傳代和建系，同時有需要可進行蛋白表達水平的鑒定。
(6)轉基因小鼠的傳代和建系:將帶有外源基因的小鼠與未經轉基因的小鼠交配、傳代；每只首建鼠都需要獨立進行傳代。對出生的f1小鼠進行鑒定，能正常生殖系傳遞的f0，其后代有50％機率帶有整合的目的基因。可將獲得的f1陽性小鼠用于實驗和繼續傳代。如果需要獲得純合子，可能來源相同的陽性f1進行同胞交配，出生的f2代小鼠，會有25％的概率為純合子。將篩選出目的基因有表達的小鼠，建系穩定的傳代，同時記錄傳代情況和譜系。由此得到prss1基因敲入小鼠，即人急性胰腺炎小鼠模型。
prss1基因敲入小鼠表型鑒定：本發明構建的prss1基因敲入小鼠(12-16周)注射雨蛙素24小時后，即可出現急性胰腺炎的表現；反復注射雨蛙素4周后可出現慢性胰腺炎的表現。迄今，國內外文獻報道、專利數據庫和包括世界最大的小鼠資源中心美國jackson研究所在內的動物模型目錄中，均未見相關野生型prss1基因敲入小鼠的信息。因此，本發明的小鼠模型可廣泛用于人急、慢性胰腺炎的致病病因、病理機制等研究。
本發明的有益效果：本發明利用基因打靶技術產生、篩選到了國際上首個prss1基因敲入(knock-in)的小鼠品系。模型小鼠的表型與人胰腺炎的發病過程非常吻合，從而得到一個從基因到表型完全模仿人胰腺炎的特異動物模型，可進一步廣泛用于人prss1的致病病因、病理機制等研究，以及對胰腺炎治療藥物的篩選和基因治療試驗等。
附圖說明：
圖1是含有prss1基因的打靶載體質粒的構建示意圖。
圖2是引物f2/r2和引物f3/r3擴增產物的電泳圖。
圖3是酶draiii和酶nrui的酶切產物電泳圖。
圖4是酶bg1i的酶切產物電泳圖。
圖5是prss1基因敲入小鼠中鑒定prss1轉基因的pcr鑒定結果(引物f1和r1)，10為prss1基因敲入小鼠，m為marker，positive為陽性對照，wt為野生型小鼠，water為水。
圖6是prss1基因敲入小鼠中鑒定prss1轉基因的pcr鑒定結果(引物f2和r2)，10為prss1基因敲入小鼠，m為marker，positive為陽性對照，wt為野生型，water為水。
圖7是prss1基因敲入小鼠中鑒定prss1轉基因的pcr鑒定結果(引物f3和r3)，10為prss1基因敲入小鼠，m為marker，positive為陽性對照，wt為野生型，water為水。
圖8是prss1基因敲入小鼠中鑒定prss1轉基因的pcr鑒定結果(引物f4和r4)，10為prss1基因敲入小鼠，m為marker，positive為陽性對照，wt為野生型，water為水。
圖9是prss1基因敲入小鼠中鑒定prss1轉基因的pcr鑒定結果(引物f5和r5)，10為prss1基因敲入小鼠，m為marker，positive為陽性對照，wt為野生型，water為水。
圖10是prss1蛋白在prss1基因敲入小鼠胰腺組織中的表達。在野生型(wt)小鼠中，prss1幾乎無表達，而prss1基因敲入小鼠中prss1蛋白的表達量幾乎占正常人的50％，說明該轉基因小鼠與人相比有可比性，可以用來模擬人急性胰腺炎的發病過程。
圖11是prss1基因敲入小鼠注射雨蛙素(cerulein)后(24h后)誘發急性胰腺炎(ap)表型及胰腺組織he染色圖片。與野生型小鼠相比，prss1基因敲入小鼠注射cerulein后胰腺組織水腫明顯伴炎性細胞浸潤。
圖12是與野生型小鼠相比，prss1基因敲入小鼠注射雨蛙素24h后，胰腺淀粉酶、組織評分、組織水腫程度以及trypsin活性明顯升高。說明prss1可以很好的模擬出人急性胰腺炎的發病過程。
圖13是prss1基因敲入小鼠反復注射雨蛙素(cerulein)后(40min后)microsome酶的活性明顯升高，而zymogen及lysome活性無明顯改變。這些改變在野生型小鼠中都無明顯改變。
圖14是prss1基因敲入小鼠反復注射雨蛙素(cerulein)后(4周后)誘發慢性胰腺炎(cp)表型及胰腺組織he及mason染色圖片。prss1小鼠還可以很好地模擬慢性胰腺炎的發病過程，即反復發作的急性胰腺炎可以演變為慢性胰腺炎。
圖15是野生型小鼠與prss1基因敲入小鼠慢性胰腺炎相關指標的對比。可以明顯看出prss1小鼠在胰腺比重、組織評分、血糖方面在注射完雨蛙素后改變明顯。
具體實施方式：
以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是本發明的限制。
小鼠的飼養和繁育：c57bl/6j購自jackson實驗室(美國)，飼養在南方醫科大學南方醫院動物研究所的spf級的動物房里。所有的小鼠操作得到了南方醫科大學動物研究所動物管理委員會的批準和監督。
實施例1含有prss1基因的打靶載體質粒的構建
一、載體的構建：構建示意圖如圖1所示。
1、構建中間載體，將目的片段構建進pstart-k骨架上；
2、擴增待重組片段；
3、將擴增片段與bac進行同源重組；
4、篩選正確克隆；
5、將bac上的目的片段擴增送測；
6、將測序正確的bac進行環測。
7、驗證獲得載體的正確性。
8、載體質粒(即為含有prss1基因的打靶載體質粒，其核苷酸序列如seqidno.1所示)轉化大腸桿菌，得到轉化有載體質粒的大腸桿菌菌液。
二、質粒制備
1、將菌液進行平板劃線，挑取單克隆
將步驟一的轉化有載體質粒的大腸桿菌菌液進行平板劃線，然后隨機挑取8個克隆進行pcr驗證
所用引物：
f2:ggaagactgatttttgcatatcatg
r2:ggttctttaatctaacatatcccct
擴增產物為314bp。
f3:agcacatagagacaaaatatgc
r3:ggtcatcagtatatcgaactattct
擴增產物為364bp。
如果都能擴增到上述兩個擴增產物，則該克隆是陽性克隆，命名為攜帶含有prss1基因的打靶載體質粒的大腸桿菌。pcr產物電泳圖如圖2所示。
2、從上述陽性克隆中挑取一個克隆進行搖菌培養
將上述攜帶含有prss1基因的打靶載體質粒的大腸桿菌接種到100ml已加抗生素的lb培養基里，后放置到振蕩培養箱(上海知楚儀器有限公司，貨號：zqly-300s)培養，參數設定37℃225rpm/min，培養時間16h。
3、質粒抽提
待搖菌時間到后，用qiagen質粒dna純化試劑盒(凱杰企業管理(上海)有限公司，貨號：12145)進行質粒抽提，得到質粒，具體方法如下：
a)收獲lb培養過夜的細菌，在6000g，4℃條件下離心15min。
b)加入10mlbufferp1重懸細菌。
c)加10mlbufferp2，劇烈晃動離心管4-6次使其徹底混勻，室溫放置5min。如果使用了lyseblue試劑，溶液應該變成均勻藍色。
d)在孵育期間，打開針口的密封蓋.并把過濾器放到合適的架子上。
e)加入10ml冰浴的bufferp3到此溶菌產物中，劇烈晃動離心管4-6次使其混勻。如果加入了lyseblue試劑，混勻試劑直到沒有顏色。
f)將溶菌產物倒入針口密封的過濾器中，室溫放置10min，不要插入活塞。打開針口的密封蓋，輕輕擠壓活塞將溶菌產物過濾到一新的50ml離心管中。
g)加2.5mlbufferer到過濾的溶菌液中，充分混勻10次后冰上孵育30min。
h)將qiagen-tip500的柱子掛在另一離心管上，加入10mlbufferqbt，讓管中溶液通過重力滴下排空。
i)將第7步冰上孵育的溶菌液加入qiagen-tip柱子中讓其透過樹脂慢慢滴下。
j)10用2×30mlbufferqc洗qiagen-tip柱。
k)11再用15mlbufferqn洗脫dna，用離心管收集dna洗脫液。
l)12加入10.5ml異丙醇到洗脫液中使dna沉淀下來，混勻。大于15000×g，4℃離心30min，離心后小心倒出上清液。
m)13洗dna用5ml無內毒素-70％乙醇(添加40ml96％-100％乙醇到試劑盒的無內毒素水中)，15000g，4℃離心10min。小心倒出上清液不要碰到質粒。
n)14烘干離心管底部的質粒5-10min。用合適體積的bufferpa重新溶解dna。
o)15檢測dna質粒的濃度并記錄。
4、質粒的檢測
將步驟3提取的質粒進行酶切驗證，酶切時間1h
酶切體系：20ul
dna500ng
buffer2ul
酶(draiii或nrui)1ul
水補齊至20ul
酶切方案：
draiii12.514/9.181/6.336/3.557/3.132/1.740(kbp)
nrui36.460(kbp)
酶切產物電泳圖如圖3所示。由此得到含有prss1基因的打靶載體質粒，經測序，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
5、質粒的線性化
將上述含有prss1基因的打靶載體質粒進行線性化酶切，酶切體系
dna30ug
酶(nrui)70u
buffer25ul
水補齊至250ul
37℃酶切時間16h
酶切方案nrui36.460kbp
由此得到線性化的含有prss1基因的打靶載體質粒。
6、dna片段(線性化的含有prss1基因的打靶載體質粒)的回收
將上述步驟5的含線性化的含有prss1基因的打靶載體質粒反應液進行瓊脂糖膠回收，使用的試劑盒是qiaquickgelextractionkit(250)貨號是28706，方法如下：
a)紫外燈下小心地把包含有的大小約36.460kbp的dna的片段切下來。并盡量去除多余的凝膠。
b)稱取空離心管的重量，切下帶目的片段的凝膠裝在1.5ml離心管中并稱其重量，求出凝膠塊的重量，近似地確定其體積，并加入700μlbufferqg，50℃孵化10min。
c)10min后待凝膠塊徹底溶化后，密切觀察混合溶液的顏色是不是黃色，若顏色為黃色，則繼續下步操作。
d)向混合溶液中加入230μl異丙醇并充分混勻。
e)將qiaquick離心柱(qiaquickspincolumn)裝在一個干凈的2ml收集管中。
f)把③中的所得溶液放入qiaquick吸附柱中，13,000rpm離心1min。棄掉廢液，并把qiaquick離心柱重新套回2ml收集管中。
g)在離心柱中加0.5mlbufferqg，13,000rpm離心1min。
h)把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入50μl洗脫液或滅菌水上柱子膜上，10,000×g離心1min，離心管中的溶液就是純化回收的dna產物，保存于-20度備用用于酶連用。在離心柱中再次加0.75mlbufferpe，13,000rpm離心1min。
i)棄去液體，再次13,000rpm離心1min。
j)取出離心柱，把離心柱裝在一個干凈的1.5ml微量離心管上。
k)在吸附柱的中間部位加50μlbuffereb(10mmtris·cl,ph8.5)，溫室放置1min，再次13,000rpm離心1min，取上清液，-20度保存備用。由此得到線性化的含有prss1基因的打靶載體質粒。
7、回收片段的鑒定
將上述的回收片段(線性化的含有prss1基因的打靶載體質粒)進行酶切鑒定，
酶切體系：20ul
dna500ng
buffer2ul
酶1ul
水補齊至20ul
酶切方案：bgli11/10/6.4/5/3.2/0.8
酶切產物電泳圖如圖4所示，由此得到線性化的含有prss1基因的打靶載體質粒。
8、交付下游
以上檢測完成后，再將線性化的含有prss1基因的打靶載體質粒打標簽分裝給下游進行注射。
二、受精卵的準備
1、受精卵的準備：篩選3-4周c57bl/6雌鼠，分別注射孕馬血清(pmsg)與絨毛膜促性腺激素(hcg)，兩者時間間隔46-48h。
2、注射hcg后將雌鼠與成年的可育成年雄鼠交配，使雌鼠受精。
3、次日上午9點將雌鼠使用二氧化碳安樂死后，準備取受精卵的培養皿(將2mlm2(試劑廠商sigma)培養基放置37度預熱臺預熱半小時)，將小鼠卵巢取出放置預熱后的培養皿，加入60微升透明質酸(試劑廠商sigma),進行從輸卵管內收集受精卵，取完放置在(平衡12小時的m16(試劑廠商sigma)培養皿中培養)c02培養箱內培養備用。
三、原核顯微注射
1、制備顯微注射注射針和固定針。
2、將已線性化和純化的質粒(線性化的含有prss1基因的打靶載體質粒)稀釋為1-5ng/ul的注射液，將注射液使用加樣器加樣到顯微注射針內。
3、篩選形態正常的受精卵待用，制作m2注射滴，將篩選好受精卵放入注射滴，使用石蠟油(試劑廠商sigma)進行覆蓋，放置顯微鏡下注射。
4、在200-400倍的倒置顯微鏡下，將外源的dna溶液(線性化的含有prss1基因的打靶載體質粒)通過顯微注射的方式注射到受精卵細胞核內。注射用氣體采用氮氣，注射前將氣體壓力調至使核區膨脹2至3倍左右大小。
5、將注射完畢，將注射皿移到培養箱內，培養1h后進行移植；或者將受精卵移至m16培養基中進行培養至2cell，待第二天進行移植。
四、代孕鼠制備及胚胎移植
1、準備假孕母鼠：選取適齡的可育與輸精管結扎后絕育的雄鼠交配，剌激雌鼠發生一系列妊娠變化而得到假孕母鼠，作為受精卵轉基因后的代孕鼠。
2、移植前使用麻藥(每次測試合適的麻藥劑量進行腹腔注射)將代孕鼠麻倒，再進行右側背部開1cm口，開口之前使用酒精棉球進行擦拭開口部位，使用高溫高壓滅菌的實驗器材剪刀鑷子拉出輸卵管并暴露在視野里，將已注射外源基因(線性化的含有prss1基因的打靶載體質粒)的受精卵移植入輸卵管內，使用不銹鋼傷口夾縫合。
3、將代孕母鼠放在干凈的籠盒中，并保溫待其清醒后放回籠架飼養。第二天觀察做完實驗的代孕鼠是否有異常。
4、輸卵管移植成功后，母鼠一般會在手術后19-20天產仔。
5、小鼠出生1周后，可對小鼠進行剪爪編號，同時進行pcr鑒定；小鼠出生3周后，可分籠獨立飼養。
五、小鼠鑒定
1：對采集到的1-2周齡的幼鼠組織(尾巴或者腳趾組織)進行裂解和提取基因組。
2、用針對目的基因(prss1基因)的特異性引物進行pcr擴增及電泳檢測，篩選出外源基因整合的后代。
具體使用的引物如下：
1.transgenepcrprimer(pcr引物)f1:gagcggatttgaacgttgtg
transgenepcrprimer(pcr引物)r1:tacttgaagagatttggcgg
internalcontrolpcrprimer(對照組引物)f:ctatcagggatactcctctttgcc
internalcontrolpcrprimer(對照組引物)r:gatacaggaatgacaagctcatggt
annealingtemp(退火溫度):60℃
expectedpcrproduct(預期產物):
transgenepcrproductsize(pcr產物大小):356bp
internalcontrolpcrproductsize(對照產物大小):507bp
2.transgenepcrprimer(pcr引物)f2:ggaagactgatttttgcatatcatg
transgenepcrprimer(pcr引物)r2:ggttctttaatctaacatatcccct
internalcontrolpcrprimer(對照組引物)f:ctatcagggatactcctctttgcc
internalcontrolpcrprimer(對照組引物)r:gatacaggaatgacaagctcatggt
annealingtemp(退火溫度):60℃
expectedpcrproduct(預期產物):
transgenepcrproductsize(pcr產物大小):314bp
internalcontrolpcrproductsize(對照產物大小):507bp
3.transgenepcrprimer(pcr引物)f3:agcacatagagacaaaatatgc
transgenepcrprimer(pcr引物)r3:ggtcatcagtatatcgaactattct
internalcontrolpcrprimer(對照組引物)f:ctatcagggatactcctctttgcc
internalcontrolpcrprimer(對照組引物)r:gatacaggaatgacaagctcatggt
annealingtemp(退火溫度):60℃
expectedpcrproduct(預期產物):
transgenepcrproductsize(pcr產物大小):364bp
internalcontrolpcrproductsize(對照產物大小):507bp
4.transgenepcrprimer(pcr引物)f4:ggtgatggctgtgcccagaa
transgenepcrprimer(pcr引物)r4:cccctttctcccaagcttct
internalcontrolpcrprimer(對照組引物)f:ctatcagggatactcctctttgcc
internalcontrolpcrprimer(對照組引物)r:gatacaggaatgacaagctcatggt
annealingtemp(退火溫度):60℃
expectedpcrproduct(預期產物):
transgenepcrproductsize(pcr產物大小):339bp
internalcontrolpcrproductsize(對照產物大小):507bp
5.transgenepcrprimer(pcr引物)f5:tgctggcaccaagttcctcatctc
transgenepcrprimer(pcr引物)r5:gcaagagattacgcgcagaccaa
internalcontrolpcrprimer(對照組引物)f:gcagaagaggacagatacattcat
internalcontrolpcrprimer(對照組引物)r:cctactgaagaatctatcccacag
annealingtemp(退火溫度):60℃
expectedpcrproduct(預期產物):
transgenepcrproductsize(pcr產物大小):398bp
internalcontrolpcrproductsize(對照產物大小):689bp
用上述五對pcr引物擴增后的擴增產物的電泳圖如圖5-9所示，從上面可以看出，能用五對pcr引物擴增后都能擴增得到目的片段的小鼠為prss1基因整合的后代。有整合的鼠稱為首建鼠(founder)，可進行傳代和建系，同時有需要可進行蛋白表達水平的鑒定。
六、轉基因小鼠的傳代和建系:
將帶有外源基因(prss1基因)的小鼠(首建鼠)與未經轉基因的小鼠交配、傳代；每只首建鼠都需要獨立進行傳代。對出生的f1小鼠進行鑒定(同步驟五)，能正常生殖系傳遞的f0，其后代有50％機率帶有整合的目的基因。可將獲得的f1陽性小鼠用于實驗和繼續傳代。如果需要獲得純合子，可能來源相同的陽性f1進行同胞交配，出生的f2代小鼠，會有25％的概率為純合子。將篩選出目的基因有表達的小鼠，建系穩定的傳代，同時記錄傳代情況和譜系。由此得到prss1基因敲入小鼠，即人急性胰腺炎小鼠模型。
七、prss1基因敲入小鼠表型鑒定：
1、檢測prss1蛋白在人急性胰腺炎小鼠模型組織中的表達。如圖10所示，在野生型(wt，control)小鼠中，prss1幾乎無表達，而prss1基因敲入小鼠(transgene)prss1蛋白的表達量幾乎占正常人(human)的50％，說明該轉基因小鼠與人相比有可比性，可以用來模擬人急性胰腺炎的發病過程。
2、如圖11所示，圖11是prss1基因敲入小鼠注射雨蛙素(cerulein)后(24h后)誘發急性胰腺炎(ap)表型及胰腺組織he染色圖片。與野生型小鼠相比，prss1小鼠注射cerulein后胰腺組織水腫明顯伴炎性細胞浸潤。
3、圖12是prss1基因敲入小鼠注射雨蛙素(cerulein)后(24h后)，與野生型小鼠相比，prss1基因敲入小鼠注射雨蛙素24h后，胰腺淀粉酶、組織評分、組織水腫程度以及trypsin活性明顯升高。說明prss1可以很好的模擬出人急性胰腺炎的發病過程。
4、圖13是prss1基因敲入小鼠反復注射雨蛙素(cerulein)后(40min后)microsome酶的活性明顯升高，而zymogen及lysome活性無明顯改變。這些改變在野生型小鼠中都無明顯改變。
5、圖14是prss1基因敲入小鼠反復注射雨蛙素(cerulein)后(4周后)誘發慢性胰腺炎(cp)表型及胰腺組織he及mason染色圖片。prss1基因敲入小鼠還可以很好地模擬慢性胰腺炎的發病過程，即反復發作的急性胰腺炎可以演變為慢性胰腺炎。
6、圖15野生型小鼠與prss1小鼠慢性胰腺炎相關指標的對比。可以明顯看出prss1小鼠在胰腺比重、組織評分、血糖方面在注射完雨蛙素后改變明顯。
綜上所述，本發明構建的prss1基因敲入小鼠(12-16周)注射雨蛙素24小時后，即可出現急性胰腺炎的表現；反復注射雨蛙素4周后可出現慢性胰腺炎的表現。迄今，國內外文獻報道、專利數據庫和包括世界最大的小鼠資源中心美國jackson研究所在內的動物模型目錄中，均未見相關野生型prss1基因敲入小鼠的信息。因此，本發明的小鼠模型可廣泛用于人急、慢性胰腺炎的致病病因、病理機制等研究。
本發明所獲得的prss1小鼠通過表型驗證，可廣泛用于人急性胰腺炎的致病病因、病理機制研究，以及對急性胰腺炎治療藥物的篩選和基因治療試驗等。
除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發明要求的保護范圍。
序列表
<110>南方醫科大學南方醫院
<120>一種人急性胰腺炎小鼠模型的構建方法
<160>1
<210>1
<211>36500
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
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