本發明涉及一種膽固醇的提取方法，具體涉及一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法。
背景技術：
膽固醇也稱膽甾醇，是動物組織細胞不可缺少的重要物質，也是具有工業用途的天然物質，有廣泛的市場需求，工業上主要用于化妝品、乳化劑、醫藥等。也是人工牛黃、維生素d3和合成激素的原料，膽固醇具有液晶性質，溶液具有流動性，其分子能在一定條件下非常有規則地像那樣排列起來，膽固醇與不同的脂肪酸制成的膽固醇酯是具有顯著溫度效應的液晶材料。
目前，膽固醇主要是以動物的大腦和羊毛脂提取為主，采用丙酮冷浸漬的方法進行提取，該方法在動物腦干粉中加入20倍量丙酮溶液，浸漬耗時長（多達72小時），萃取膽固醇收率低（＜6%），純度低（≤90%），且殘留有毒有機溶劑，所萃取物質只能用于飼料添加劑，致使動物腦資源白白浪費。而羊毛脂提取膽固醇采用更加繁瑣的生產工藝，所用的有機試劑種類多，用量大，純度低且殘留有毒有機溶劑。
而從海洋生物副產品中提取膽固醇未見報道，提高了海洋生物副產品的綜合利用價值。
技術實現要素：
本發明的目的在于針對現有技術不足，提供一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，該方法得到的膽固醇收得率在15-20%，純度在98%以上，且工藝穩定，易于工業化。
為實現上述目的，本發明采用如下的技術方案：
一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，它是按以下步驟制備:（1）皂化:稱取海洋生物副產品，然后加入相當于海洋生物副產品質量0.2-0.4倍的氫氧化鈉，0.6-0.8倍的純化水和5-10%的低級醇，加熱升溫至回流開始計時，皂化1.5-2h，降溫至20-30℃；
（2）成鈣鹽：向步驟（1）制得的皂化液中加入相當于皂化液質量0.2-0.4倍的氯化鈣，邊加邊攪拌，反應30-60min結束，去除水分，得含膽固醇的鈣鹽；
（3）滲濾：稱取膽固醇鈣鹽，加6-8倍量的丙酮，浸泡30-60min，超聲處理，靜置2-4h，放出滲濾液，重復上述步驟3-5次，合并滲濾液；
（4）濃縮結晶：將步驟（3）合并的滲濾液減壓濃縮至干，加入相當于上述濃縮產物質量6-8倍的體積分數為90-95%的乙醇溶液，加熱60-70℃，攪拌至濃縮產物完全溶解后用稀硫酸調ph至1-3，再加熱回流30-60min，趁熱過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶，過濾收集晶體；
（5）溶解結晶：向步驟（4）制得的晶體中加入相當于晶體質量6-8倍的體積分數為95-97%的乙醇溶液，用稀硫酸調ph至4-6后，加相當于溶液質量0.5-1%的雙氧水，攪拌反應30-60min后，加熱回流1-2h，過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶8-10h，過濾即得粗品膽固醇；
（6）重結晶：向粗品膽固醇中加入相當于粗品膽固醇質量8-10倍的體積分數為97-100%的乙醇溶液，并調ph至9-10，加熱回流1-2h，降溫冷卻結晶，過濾即得精品膽固醇；
（7）干燥：將精品膽固醇放入干燥箱內進行干燥，設定干燥溫度為50-60℃，干燥1-2h，再設定干燥溫度為70-90℃，干燥2-3h，即得精品膽固醇成品。
所述的一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，其特征在于：步驟（1）所述的低級醇為甲醇、乙醇中的一種或者二者混合。
所述的一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，其特征在于：步驟（3）所述的酮類試劑為丙酮、丁酮、環己酮中的一種或者二種混合。
所述的一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，其特征在于：步驟（3）所述的超聲頻率為30～50khz，溫度調節控制在25～35℃，超聲時間為5-10min。
所述的一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，其特征在于：步驟（4）和步驟（5）中所述的稀硫酸的濃度為10-20%。
本發明的有益效果:
本發明成鈣鹽步驟中將皂化后的海洋生物副產品加入氯化鈣，將非膽固醇類雜質與鈣鹽進行絡合去除，從而提高膽固醇的純度；本發明采用酮類試劑與超聲波聯用進行連續滲濾，可以顯著提高膽固醇的溶出率，從而提高膽固醇的收得率。本發明提取方法得到的膽固醇收得率在15-20%以上，純度在98%以上，且工藝穩定，易于工業化。
具體實施方式
實施例1
一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，它是按以下步驟制備：
（1）皂化:稱取海洋生物副產品100g，然后加入20g的氫氧化鈉，60g的純化水和5g的甲醇，加熱升溫至回流開始計時，皂化1.5h，降溫至20℃；
（2）成鈣鹽：向步驟（1）制得的皂化液中加入37g氯化鈣，邊加邊攪拌，反應30min結束，去除水分，得含膽固醇的鈣鹽；
（3）滲濾：稱取膽固醇鈣鹽130g，加780g的丙酮，浸泡30min，設定超聲頻率為30khz，溫度調節控制在25℃，超聲5min后，靜置2h，放出滲濾液，重復上述步驟3次，合并滲濾液；
（4）濃縮結晶：將步驟（3）合并的滲濾液減壓濃縮至干得膏狀物42g，加入252g的90%的乙醇溶液，加熱60℃，攪拌至濃縮產物完全溶解后用10%稀硫酸調ph至1，再加熱回流30min，趁熱過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶，過濾收集晶體35g；
（5）溶解結晶：向步驟（4）制得的晶體，加入210g的95%的乙醇溶液，用10%稀硫酸調ph至4后，加1.05g的雙氧水，攪拌反應30min后，加熱回流1h，過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶8h，過濾即得粗品膽固醇28g；
（6）重結晶：向粗品膽固醇中加入224g的97%的乙醇溶液，并調ph至9，加熱回流1h，降溫冷卻結晶，過濾即得精品膽固醇20g；
（7）干燥：將精品膽固醇放入干燥箱內進行干燥，設定干燥溫度為50℃，干燥2h，再設定干燥溫度為70℃，干燥3h，即得精品膽固醇成品16.5g。計算膽固醇的收得率為16.5%，純度為98.2%。
實施例2
一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，它是按以下步驟制備：
（1）皂化:稱取海洋生物副產品1kg，然后加入300g氫氧化鈉，700g的純化水和80g的甲醇，加熱升溫至回流開始計時，皂化2h，降溫至25℃；
（2）成鈣鹽：向步驟（1）制得的皂化液中加入600g氯化鈣，邊加邊攪拌，反應50min結束，去除水分，得含膽固醇的鈣鹽；
（3）滲濾：稱取膽固醇鈣鹽1.3kg，加9.1kg的丁酮，浸泡50min，設定超聲頻率為40khz，溫度調節控制在30℃，超聲7min后，靜置3h，放出滲濾液，重復上述步驟4次，合并滲濾液；
（4）濃縮結晶：將步驟（3）合并的滲濾液減壓濃縮至干得膏狀物450g，加入3.15kg的93%的乙醇溶液，加熱65℃，攪拌至濃縮產物完全溶解后用15%稀硫酸調ph至2，再加熱回流45min，趁熱過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶，過濾收集晶體370g；
（5）溶解結晶：向步驟（4）制得的晶體中加入2.59kg的96%的乙醇溶液，用15%稀硫酸調ph至5后，加18.1g的雙氧水，攪拌反應40min后，加熱回流1.5h，過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶9h，過濾即得粗品膽固醇345g；
（6）重結晶：向粗品膽固醇中加入3.1kg的98%的乙醇溶液，并調ph至9.5，加熱回流1.5h，降溫冷卻結晶，過濾即得精品膽固醇225g；
（7）干燥：將精品膽固醇放入干燥箱內進行干燥，設定干燥溫度為55℃，干燥1.5h，再設定干燥溫度為85℃，干燥2h，即得精品膽固醇成品178g。計算膽固醇的收得率為17.8%，純度為98.3%。
實施例3
一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，它是按以下步驟制備：
（1）皂化:稱取海洋生物副產品100kg，然后加入40kg的氫氧化鈉，80kg的純化水和10kg的甲醇，加熱升溫至回流開始計時，皂化2h，降溫至30℃；
（2）成鈣鹽：向步驟（1）制得的皂化液中加入80kg氯化鈣，邊加邊攪拌，反應60min結束，去除水分，得含膽固醇的鈣鹽；
（3）滲濾：稱取膽固醇鈣鹽160kg，加1280kg的環己酮，浸泡60min，設定超聲頻率為50khz，溫度調節控制在35℃，超聲10min后，靜置4h，放出滲濾液，重復上述步驟5次，合并滲濾液；
（4）濃縮結晶：將步驟（3）合并的滲濾液減壓濃縮至干的膏狀物50kg，加入400kg的95%的乙醇溶液，加熱70℃，攪拌至濃縮產物完全溶解后用20%稀硫酸調ph至3，再加熱回流60min，趁熱過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶，過濾收集晶體40kg；
（5）溶解結晶：向步驟（4）制得的晶體中加入320kg的97%的乙醇溶液，用20%稀硫酸調ph至6后，加3.2kg的雙氧水，攪拌反應60min后，加熱回流2h，過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶10h，過濾即得粗品膽固醇33kg；
（6）重結晶：向粗品膽固醇中加入330kg的100%的乙醇，并調ph至10，加熱回流2h，降溫冷卻結晶，過濾即得精品膽固醇26.4kg；
（7）干燥：將精品膽固醇放入干燥箱內進行干燥，設定干燥溫度為60℃，干燥2h，再設定干燥溫度為90℃，干燥2h，即得精品膽固醇成品20.5kg。計算膽固醇的收得率為20.5%，純度為99.7%。
實施例4
一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，它是按以下步驟制備：
（1）皂化:稱取海洋生物副產品100g，然后加入20g的氫氧化鈉，60g的純化水和5g的乙醇，加熱升溫至回流開始計時，皂化1.5h，降溫至20℃；
（2）成鈣鹽：向步驟（1）制得的皂化液中加入37g氯化鈣，邊加邊攪拌，反應30min結束，去除水分，得含膽固醇的鈣鹽；
（3）滲濾：稱取膽固醇鈣鹽135g，加820g的丙酮，浸泡30min，設定超聲頻率為30khz，溫度調節控制在25℃，超聲5min后，靜置2h，放出滲濾液，重復上述步驟3次，合并滲濾液；
（4）濃縮結晶：將步驟（3）合并的滲濾液減壓濃縮至干得膏狀物45g，加入280g的90%的乙醇溶液，加熱60℃，攪拌至濃縮產物完全溶解后用10%稀硫酸調ph至1，再加熱回流30min，趁熱過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶，過濾收集晶體37g；
（5）溶解結晶：向步驟（4）制得的晶體，加入222g的95%的乙醇溶液，用10%稀硫酸調ph至4后，加1.15g的雙氧水，攪拌反應30min后，加熱回流1h，過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶8h，過濾即得粗品膽固醇30g；
（6）重結晶：向粗品膽固醇中加入240g的97%的乙醇溶液，并調ph至9，加熱回流1h，降溫冷卻結晶，過濾即得精品膽固醇24g；
（7）干燥：將精品膽固醇放入干燥箱內進行干燥，設定干燥溫度為50℃，干燥2h，再設定干燥溫度為70℃，干燥3h，即得精品膽固醇成品17.5g。計算膽固醇的收得率為17.5%，純度為98.1%。
實施例5
一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，它是按以下步驟制備：
（1）皂化:稱取海洋生物副產品1kg，然后加入300g氫氧化鈉，700g的純化水和80g的乙醇，加熱升溫至回流開始計時，皂化2h，降溫至25℃；
（2）成鈣鹽：向步驟（1）制得的皂化液中加入600g氯化鈣，邊加邊攪拌，反應50min結束，去除水分，得含膽固醇的鈣鹽；
（3）滲濾：稱取膽固醇鈣鹽1.4kg，加9.8kg的丁酮，浸泡50min，設定超聲頻率為40khz，溫度調節控制在30℃，超聲7min后，靜置3h，放出滲濾液，重復上述步驟4次，合并滲濾液；
（4）濃縮結晶：將步驟（3）合并的滲濾液減壓濃縮至干得膏狀物470g，加入3.29kg的93%的乙醇溶液，加熱65℃，攪拌至濃縮產物完全溶解后用15%稀硫酸調ph至2，再加熱回流45min，趁熱過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶，過濾收集晶體390g；
（5）溶解結晶：向步驟（4）制得的晶體中加入2.73kg的96%的乙醇溶液，用15%稀硫酸調ph至5后，加20.5g的雙氧水，攪拌反應40min后，加熱回流1.5h，過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶9h，過濾即得粗品膽固醇345g；
（6）重結晶：向粗品膽固醇中加入3.1kg的98%的乙醇溶液，并調ph至9.5，加熱回流1.5h，降溫冷卻結晶，過濾即得精品膽固醇225g；
（7）干燥：將精品膽固醇放入干燥箱內進行干燥，設定干燥溫度為55℃，干燥1.5h，再設定干燥溫度為85℃，干燥2h，即得精品膽固醇成品178g。計算膽固醇的收得率為17.8%，純度為98.8%。
實施例6
一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，它是按以下步驟制備：
（1）皂化:稱取海洋生物副產品100kg，然后加入40kg的氫氧化鈉，80kg的純化水和10kg的乙醇，加熱升溫至回流開始計時，皂化2h，降溫至30℃；
（2）成鈣鹽：向步驟（1）制得的皂化液中加入80kg氯化鈣，邊加邊攪拌，反應60min結束，去除水分，得含膽固醇的鈣鹽；
（3）滲濾：稱取膽固醇鈣鹽150kg，加1200kg的環己酮，浸泡60min，設定超聲頻率為50khz，溫度調節控制在35℃，超聲10min后，靜置4h，放出滲濾液，重復上述步驟5次，合并滲濾液；
（4）濃縮結晶：將步驟（3）合并的滲濾液減壓濃縮至干的膏狀物52kg，加入400kg的95%的乙醇溶液，加熱70℃，攪拌至濃縮產物完全溶解后用20%稀硫酸調ph至3，再加熱回流60min，趁熱過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶，過濾收集晶體40kg；
（5）溶解結晶：向步驟（4）制得的晶體中加入320kg的97%的乙醇溶液，用20%稀硫酸調ph至6后，加3.2kg的雙氧水，攪拌反應60min后，加熱回流2h，過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶10h，過濾即得粗品膽固醇33kg；
（6）重結晶：向粗品膽固醇中加入330kg的100%的乙醇，并調ph至10，加熱回流2h，降溫冷卻結晶，過濾即得精品膽固醇26.4kg；
（7）干燥：將精品膽固醇放入干燥箱內進行干燥，設定干燥溫度為60℃，干燥2h，再設定干燥溫度為90℃，干燥2h，即得精品膽固醇成品20.5kg。計算膽固醇的收得率為20.5%，純度為99.3%。
實施例7
一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，它是按以下步驟制備：
（1）皂化:稱取海洋生物副產品100g，然后加入20g的氫氧化鈉，60g的純化水、2.5g的甲醇和2.5的乙醇，加熱升溫至回流開始計時，皂化1.5h，降溫至20℃；
（2）成鈣鹽：向步驟（1）制得的皂化液中加入37g氯化鈣，邊加邊攪拌，反應30min結束，去除水分，得含膽固醇的鈣鹽；
（3）滲濾：稱取膽固醇鈣鹽120g，加720g的丙酮，浸泡30min，設定超聲頻率為30khz，溫度調節控制在25℃，超聲5min后，靜置2h，放出滲濾液，重復上述步驟3次，合并滲濾液；
（4）濃縮結晶：將步驟（3）合并的滲濾液減壓濃縮至干得膏狀物40g，加入240g的90%的乙醇溶液，加熱60℃，攪拌至濃縮產物完全溶解后用10%稀硫酸調ph至1，再加熱回流30min，趁熱過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶，過濾收集晶體33g；
（5）溶解結晶：向步驟（4）制得的晶體，加入200g的95%的乙醇溶液，用10%稀硫酸調ph至4后，加1g的雙氧水，攪拌反應30min后，加熱回流1h，過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶8h，過濾即得粗品膽固醇26g；
（6）重結晶：向粗品膽固醇中加入208g的97%的乙醇溶液，并調ph至9，加熱回流1h，降溫冷卻結晶，過濾即得精品膽固醇18g；
（7）干燥：將精品膽固醇放入干燥箱內進行干燥，設定干燥溫度為50℃，干燥2h，再設定干燥溫度為70℃，干燥3h，即得精品膽固醇成品15.5g。計算膽固醇的收得率為15.5%，純度為98.7%。
實施例8
一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，它是按以下步驟制備：
（1）皂化:稱取海洋生物副產品1kg，然后加入300g氫氧化鈉，700g的純化水，40g甲醇和40g乙醇，加熱升溫至回流開始計時，皂化2h，降溫至25℃；
（2）成鈣鹽：向步驟（1）制得的皂化液中加入600g氯化鈣，邊加邊攪拌，反應50min結束，去除水分，得含膽固醇的鈣鹽；
（3）滲濾：稱取膽固醇鈣鹽1.3kg，加9.1kg的丁酮，浸泡50min，設定超聲頻率為40khz，溫度調節控制在30℃，超聲7min后，靜置3h，放出滲濾液，重復上述步驟4次，合并滲濾液；
（4）濃縮結晶：將步驟（3）合并的滲濾液減壓濃縮至干得膏狀物455g，加入3.15kg的93%的乙醇溶液，加熱65℃，攪拌至濃縮產物完全溶解后用15%稀硫酸調ph至2，再加熱回流45min，趁熱過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶，過濾收集晶體360g；
（5）溶解結晶：向步驟（4）制得的晶體中加入2.52kg的96%的乙醇溶液，用15%稀硫酸調ph至5后，加18.1g的雙氧水，攪拌反應40min后，加熱回流1.5h，過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶9h，過濾即得粗品膽固醇340g；
（6）重結晶：向粗品膽固醇中加入3.1kg的98%的乙醇溶液，并調ph至9.5，加熱回流1.5h，降溫冷卻結晶，過濾即得精品膽固醇220g；
（7）干燥：將精品膽固醇放入干燥箱內進行干燥，設定干燥溫度為55℃，干燥1.5h，再設定干燥溫度為85℃，干燥2h，即得精品膽固醇成品170g。計算膽固醇的收得率為17.0%，純度為98.5%。
實施例9
一種海洋生物副產品中膽固醇的提取方法，它是按以下步驟制備：
（1）皂化:稱取海洋生物副產品100kg，然后加入40kg的氫氧化鈉，80kg的純化水、5kg的甲醇和5kg的乙醇，加熱升溫至回流開始計時，皂化2h，降溫至30℃；
（2）成鈣鹽：向步驟（1）制得的皂化液中加入80kg氯化鈣，邊加邊攪拌，反應60min結束，去除水分，得含膽固醇的鈣鹽；
（3）滲濾：稱取膽固醇鈣鹽160kg，加1280kg的環己酮，浸泡60min，設定超聲頻率為50khz，溫度調節控制在35℃，超聲10min后，靜置4h，放出滲濾液，重復上述步驟5次，合并滲濾液；
（4）濃縮結晶：將步驟（3）合并的滲濾液減壓濃縮至干的膏狀物46kg，加入368kg的95%的乙醇溶液，加熱70℃，攪拌至濃縮產物完全溶解后用20%稀硫酸調ph至3，再加熱回流60min，趁熱過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶，過濾收集晶體38kg；
（5）溶解結晶：向步驟（4）制得的晶體中加入304kg的97%的乙醇溶液，用20%稀硫酸調ph至6后，加3.0kg的雙氧水，攪拌反應60min后，加熱回流2h，過濾，收集濾液，降溫冷卻結晶10h，過濾即得粗品膽固醇35kg；
（6）重結晶：向粗品膽固醇中加入350kg的100%的乙醇，并調ph至10，加熱回流2h，降溫冷卻結晶，過濾即得精品膽固醇25.4kg；
（7）干燥：將精品膽固醇放入干燥箱內進行干燥，設定干燥溫度為60℃，干燥2h，再設定干燥溫度為90℃，干燥2h，即得精品膽固醇成品20.5kg。計算膽固醇的收得率為18.8%，純度為99.5%。