水稻半顯性卷葉調控基因ERL1及其應用的制作方法

本發明屬于植物基因工程領域。具體地說，本發明涉及一種通過兩次突變獲得的卷曲度增加突變體，利用正向遺傳學及圖位克隆技術克隆的水稻半顯性卷葉調控基因erl1，以及利用轉基因過表達實驗確認該基因的功能；同時還涉及利用該基因調控葉片泡狀細胞、葉肉細胞和維管束發育，通過生長素的極性分布影響葉片形態，影響葉片形態發育。可以為水稻葉片形態改良和理想株型分子設計育種提供基因資源，提高水稻產量。

背景技術：

葉片從分生組織開始生長后，其形態受近-遠軸、腹-背軸、中-側軸三個軸向發育決定。葉片極性發育決定葉長、葉寬、葉片卷曲度等葉片形態建成的主要指標。水稻葉片為等面葉，葉片中任何器官組織的發育異常都可能導致葉片形態發生改變。自2009年zhang等借助水稻葉形突變體正向克隆第一個卷葉基因sll1以來，科學家們已先后完成了20余個與葉片形態發育相關的基因的克隆及調控機制初步研究。大部分卷葉基因與近軸面泡狀細胞的發育調控相關，其數目和大小的改變導致葉片出現正卷或反卷，包括acl1、roc5、rl14、oszhd1、srl1、sll2、myb103l、rel1、rel2；還有一部分基因，是通過調控近-遠軸面不同組織的發育，影響葉片卷曲度，包括sll1、srl2、adl1、osago7等；此外，還有一小部分基因，如cfl1通過調控細胞質的發育而影響葉片卷曲。現已初步明確水稻葉片寬度與生長素代謝及葉片維管發育密切相關。nal7和nal1通過參與生長素的生物合成和極性運輸影響葉片形態發育；而nrl1、nal2/3和rml1等基因則通過調控葉片維管組織數目和大小而影響葉片寬度。

iii類同源異形域亮氨酸鋅指(hd-zip)基因家族成員是植物發育中重要的調控子。擬南芥中，有5個hd-zipiii基因家族的成員，revoluta(rev)、phabulosa(phb)、phavoluta(phv)、athb8和athb15，這5個成員對莖頂端分生組織的分化，側生器官的極性建立和維管組織的發育具有重要的作用。水稻中，通過反向遺傳研究獲得hd-zipiii基因家族也有5個成員，oshb1、oshb2、oshb3、oshb4和oshb5，這些成員的極性化表達及在側生器官發育和維管組織中作用，依賴于microrna165/166的轉錄后調控。在hd-zipiii功能缺失突變體中，遠軸面起支配作用而sam不形成；在hd-zipiii功能獲得突變體中，mir165/166結合位點發生突變時，使基因的轉錄產物不能被切割。

itoh等(2008)研究認為，當異位表達microrna166-resistance的oshb3，植株表現出嚴重的缺陷，包括產生異位的葉緣、芽和輻射狀的葉片，并發現生長素能夠誘導期在整個sam的異位表達，也證明了生長素引發的異位表達和葉片的發生起始缺陷有關。另有研究認為，干涉oshox33/oshb3的表達能夠加速水稻葉片的衰老(欒維江等，2014)。在擬南芥中發現，kanadi基因家族的成員與hd-zipiii家族基因起相互拮抗作用，其主要在葉原基的遠軸面表達。kan功能缺失突變體的葉片呈現近軸化，其中hd-zipiii基因在整個葉片中都表達；而kan過量表達會導致葉片遠軸化。在葉片發育過程中，yabby基因功能表達相對遲緩，被認為在kan基因的下游。擬南芥中，在yab多重突變體中，yab基因主要在遠軸面表達，呈現近軸化。但到目前為止還未有研究涉及oshb3基因對葉片卷曲度具有半顯性的調控功能。

水稻葉片形態受一個復雜的遺傳網絡調控，目前已克隆的卷葉基因報道不多，多渠道挖掘更多的葉形調控基因資源有利于進一步解析水稻葉片形態建成的分子機理，并為水稻通過改良葉形進行理想株型分子設計育種奠定基礎。

上文中涉及的參考文獻如下：

欒維江，申奧，金治平，等.干擾hd-zipⅲ家族成員oshox33的表達加速水稻葉片的衰老.中國科學:生命科學,2014,44:54–65；

itohji,hibaraki,satoy,etal.developmentalroleandauxinresponsivenessofclassiiihomeodomainleucinezippergenefamilymembersinrice[j].plantphysiology,2008,147(4):1960-1975。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種從兩次突變獲得的卷曲度增加突變體克隆的新基因erl1，該基因編碼的功能蛋白，通過調控葉片泡狀細胞、葉肉細胞和維管束發育，增加葉片的卷曲程度，影響葉片形態發育。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種水稻半顯性卷葉調控基因erl1編碼的蛋白質，該蛋白質具有seqidno：2所示的氨基酸序列。

作為本發明的水稻半顯性卷葉調控基因erl1編碼的蛋白質的改進：氨基酸序列還包括在seqidno：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸或其他物種中的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

本發明還提供了編碼上述蛋白質的基因，該基因具有seqidno：1所示的核苷酸序列。

作為本發明的基因的改進：核苷酸序列還包括在seqidno：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物。

本發明還提供了含有上述基因的質粒。

本發明還提供了含有上述基因的植物表達載體。

本發明還提供了一種宿主細胞，該宿主細胞含有上述基因序列，該細胞為大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或植物細胞。

本發明還提供了上述基因的用途：用于構建轉基因水稻，所述轉基因水稻的葉形得以改良，水稻葉片發生卷曲。所述轉基因水稻的葉片對不同的erl1的表達表現出不同度的卷曲程度和植株高度。

本發明還提供了一種改良水稻葉形的方法，包括用為seqidno：1所示的核苷酸序列的基因轉化水稻細胞，再將轉化后的水稻細胞培育成植株。轉化可采用農桿菌介導法或基因槍法。

具體的說：本發明所提供的從兩次突變的水稻葉片極卷突變體中正向克隆的新基因erl1，具有seqidno：1所示的核苷酸序列。也包括在取代一個核苷酸而產生的突變體等位基因，還含具有相同功能并能達到本發明目的的基因序列。

本發明中seqidno：3所示的蛋白質，還包括其中進行一個或幾個氨基酸的替換、插入或缺失氨基酸所獲得的功能類似物。

本發明所提供了含有seqidno：1所示序列的基因或含部分該基因片段的載體，如圖4所示，該載體可以表達由上述核苷酸序列編碼的多肽或同源類似物。

本發明利用卷葉突變體通過圖位克隆正向獲得的調控葉片卷曲的基因erl1，通過序列比對，發現erl1與oshb3基因等位。

實現本發明的具體技術步驟如下：

一、水稻葉片極卷突變體erl1的分離和遺傳分析

本發明所采用的水稻葉片極卷突變體(extremerolledleaf，erl1)是將粳稻品種(japonica)“日本晴”背景的卷葉突變體sll1經1％濃度的化學誘變劑(ethylmethanesulphonate，ems)處理，與野生親本日本晴雜交之后產生f1代自交產生的f2代群體，借助測序分析和分子標記，分離獲得不含sll1位點突變的表型穩定的水稻極卷葉突變體erl1。該突變體葉片寬度變窄、極卷，呈細卷葉狀，其如圖1所示。極卷突變體erl1與秈稻臺中本地1號(taichungnative1，tn1)雜交f1代自交產生的f2代群體共576株，其中正常葉為138株，半卷葉為273株，極卷葉165株，經卡平方測驗，正常葉、半卷葉與極卷葉個體的分離比符合1：2：1，表明本發明所得到的水稻極卷葉片突變表型是一個符合單基因控制的半顯性遺傳性狀。對erl1和雜合突變體及野生型的劍葉中間做石蠟切片，對組織結構進行觀察比較分析，發現erl1葉片的泡狀細胞、葉肉細胞、厚壁細胞與維管束排列等都發生了明顯的變化(如圖2)。

二、圖位克隆控制水稻極卷葉erl1基因

1、erl1基因的初步定位

為了分離erl1基因，本發明首先建立了一個大的多態性高的定位群體，由極卷突變體erl1與秈稻品種臺中本地1號(taichungnative1，tn1)雜交后自交而形成的f2群體，再通過圖位克隆的方法，并利用sts、ssr等分子標記對erl1位點進行初步定位，將其初步定位在第12染色體長臂上，并介于rm5479和rm1226兩標記之間(圖3)。

2、erl1基因的精細定位及候選基因確定

通過對秈稻品種9311和粳稻品種日本晴進行序列比對分析，發展了8個新的sts分子標記(表1)，將erl1精確定位于sts標記serl-5和(f：gaagccttcgccgtctct；r：aggagaagtagggagaggttgg)和serl-8(f：agggatcaaaagtctgaaacca；r：gctgcatatgatcttgttgttga)之間，55kb的范圍之內。通過測序分析此區段的開放閱讀框(orf)，將erl1基因確定于bac克隆oj1257_b09的14655-20783的位置(圖4)。

3、erl1基因的鑒定和功能分析

利用pcambia1300改造的p1300s載體構建erl1過表達載體。構建步驟：pcr擴增獲得全長為2568bp的cds序列，將該片段連接到1300s載體2×35s啟動子后的多克隆位點xbaⅰ和salⅰ之間，獲得p1300s::erl1過表達載體(圖5)。

通過轉基因技術，進行過量表達轉基因研究，結果表明本發明獲得了使正常葉片形態的野生型水稻的葉片卷曲的轉基因水稻(圖6)，證明了本發明正確克隆了erl1基因，明確erl1基因cdna序列(seqidno：2)，氨基酸序列分析表明erl1基因編碼一個帶有start結構域(甾類激素快速合成調節蛋白相關的脂類轉移結構域)的蛋白(seqidno：3)，首次發現erl1基因的過量表達能使水稻葉片的卷曲度和株高發生改變。erl1的表達量越高，葉片卷曲程度越高。極卷葉突變體erl1植株矮小，葉片極端卷曲的窄葉表型。雜合型突變體的突變位點為aa，極卷葉突變體erl1的突變位點為aa。

綜上所述，本發明從水稻極卷葉突變體erl1中克隆并鑒定了控制水稻葉片卷曲程度的基因，將其命名為erl1，并通過表達實驗進行基因功能驗證。在水稻中，erl1基因功能過表達導致葉片泡狀細胞、葉肉細胞、厚壁細胞和維管束發育異常，造成葉片呈極端的卷曲表型。圖位克隆的結果表明，該基因編碼的功能蛋白，通過調控泡狀細胞、葉肉細胞、厚壁細胞和維管束發育。erl1基因克隆對了解泡狀細胞和維管束的分化發育，以及單子葉植物葉片的極性建成等方面有重要的理論價值。葉片是水稻進行光合作用主要場所，其形態建成及空間伸展姿態是理想株型的重要組成部分。葉形發育與植株耐熱抗旱等抗逆特性及產量密切相關。該發明可以為水稻株型改良和分子設計育種提供新的基因資源和理論指導。

附圖說明

下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。

圖1為日本晴(erl1)、雜合體(erl1/erl1)及水稻極卷葉突變體erl1植株表型圖；

圖2為日本晴(erl1)、雜合體(erl1/erl1)及水稻極卷葉突變體erl1葉片細胞結構圖；

圖3為半顯性卷葉基因erl1在水稻第12染色體上的初定位圖；

圖4為半顯性卷葉基因erl1在水稻第12染色體上的精細定位圖；

圖5為過表達載體p1300s::erl1(12.9kb)質粒圖譜；

圖6為半顯性卷葉基因erl1過表達轉基因植株表型圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此：

實施例1：

1.水稻材料

水稻(oryzasatival.)極卷葉突變體erl1(extremerolledleaf1)，是將粳稻品種(japonica)“日本晴”背景的卷葉突變體sll1經1％濃度的化學誘變劑(ethylmethanesulphonate，ems)處理，與其野生型粳稻品種日本晴雜交之后產生f1代自交產生的f2代群體，借助測序分析和分子標記，分離獲得不含sll1位點突變的表型穩定的水稻極卷葉突變體erl1。該突變體葉片寬度變窄、極卷，呈細卷葉狀，其如圖1所示。對erl1和雜合體及日本晴的劍片中間做石蠟切片，對組織結構進行觀察比較分析，發現erl1葉片的泡狀細胞、葉肉細胞、厚壁細胞與維管束排列等都發生了明顯的變化(如圖2)。

2.分析和定位群體

純合的極卷突變體erl1與秈稻臺中本地1號(taichungnative1，tn1)雜交f1代自交產生的f2代群體共576株，其中正常葉為138株，半卷葉為273株，極卷葉165株。選擇與突變體表型一致的165個極卷葉單株作為定位群體，對半顯性極卷葉調控基因erl1進行定位。在分蘗期每株取1克左右的嫩葉，用來提取總dna。

3.ssr和sts標記定位erl1基因

采用改良的ctab法提取水稻葉片用于基因定位的基因組dna。取3-5cm水稻葉片，剪碎放入2.0mleppendorf離心管中，加入1粒鋼珠，700ul提取液，置于tissuelyseriisystem組織研磨器，研磨2-3min，65℃恒溫水浴40-60min，再用氯仿萃取，吸取上清液，加入等量冰凍的異丙醇，離心，用70％酒精洗滌，晾干即可加入150μl超純水作為dna樣品。每一個pcr反應用2-3μldna樣品。

erl1基因的初步定位：在erl1與tn1組合的f2群體中各單株按葉片表型分成平展、半卷和極卷3類后，組成的小群體進行ssr分析，根據公布的粳稻和秈稻創建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的ssr引物，利用mjresearch的ptc-200型梯度熱循環儀進行pcr擴增，pcr擴增反應總體積為20μl，其中包括50mmol/lkcl，10mmol/ltris-cl(ph9.0)，1.5mmol/lmgcl2，200μmol/ldntp，50-100ng的基因組dna，1個單位的taq聚合酶和0.1μmol/l引物，其余為蒸餾水。擴增程序為94℃預變性4min，進入循環擴增：94℃變性30s，各引物及其退火溫度見表1，退火時間30s，72℃延伸30s，循環40次；72℃延伸10min。經5％瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙啶(eb)染色，檢測pcr產物的多態性。最終將erl1初步定位在第12號染色體長臂rm5479和rm1226兩分子標記之間(圖3)。

erl1基因的精細定位：擴大在erl1與組合的f2群體，選取869株極卷葉突變體(包括初定位的165株)，在初定位的基礎上繼續設計sts標記，通過對秈稻品種9311和粳稻品種日本晴進行序列比對分析，發展了8個具有多態新的分子標記(表1)，即，具體為serl-1、serl-2、serl-3、serl-4、serl-5、serl-6、serl-7、serl-8。

利用東盛.龍的edc-810型pcr擴增儀進行pcr擴增，pcr擴增反應總體積為20μl，其中包括50mmol/lkcl，10mmol/ltris-cl(ph9.0)，1.5mmol/lmgcl2，200μmol/ldntp，50-100ng的基因組dna，1個單位的taq聚合酶和0.1μmol/l引物，其余為蒸餾水。擴增程序為94℃預變性5min，進入循環擴增：94℃變性30s，各引物及其退火溫度見表1，退火時間30s，72℃延伸30s，循環35-39次；72℃延伸10min。經4％-5％瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙啶(eb)染色，檢測pcr產物的多態性。

最終將erl1精確定位于oj1257_b09的bac上，位于分子標記serl-5和serl-8之間共55kb的范圍之內(圖4)。初定位和精細定位的分子標記序列如表1所示。

表1、用于基因定位的分子標記序列

注：**為用于初定位標記；*為用于精細定位標記；“t”為sts標記；“s”為ssr標記。

4、erl1基因預測、cdna全長基因的獲得與功能的預測：

根據精細定位的結果，在55kb范圍內結合基因預測網站riceautomatedannotationsystem(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)的預測，發現在此區間共包含7個開放閱讀框(orf)，并設計測序引物(見表2)進行測序，利用seqman軟件對野生型和極卷葉突變體erl1的測序結果比對，結果表明，位于bac克隆oj1257_b09上第7個orf的外顯子上(16739位點)存在1個由g到a的單堿基突變(圖4)，導致由甘氨酸到谷氨酸的變異。根據bac克隆oj1257_b09序列的基因注釋信息(ncbi)，預測基因編碼一個帶有start結構域(甾類激素快速合成調節蛋白相關的脂類轉移結構域)的蛋白。通過調控水稻葉片泡狀細胞、葉肉細胞、厚壁細胞和維管束發育，影響葉片的卷曲程度。erl1基因包含6129bp的核苷酸序列(即，erl1gdna序列)，如seqidno：1所示。經過pcr擴增得到了erl1基因的2568bpcdna全長序列(seqidno：2)。其與野生型相比，有1個g到a的單堿基突變。

該水稻半顯性卷葉調控基因erl1編碼的蛋白質具有seqidno：3所示的855個氨基酸序列，“*”表示終止密碼子(tga)。

表2、用于候選基因測序的引物及其pcr退火溫度

實施例2：過表達erl1基因改良水稻葉形的方法

以粳稻品種“日本晴”cdna為模板，用引物erl1-ov-f:5'-tgctctagaatggcagcggcggcggtggggg-3'和erl1-ov-r:5'-acgtcgactcacatgaaggtccagttgacg-3'擴增(pcr擴增反應體系為：cdna模板5μl，前引物1μl，后引物1μl，kodfx酶1μl，2×kodpcrbuffer25μl,dntp(2mm)10μl,ddh2o7μl,總共50μl。擴增條件為：94℃預變性5min，進入循環擴增：98℃變性10s，62℃退火30s，68℃延伸3min，循環35次；68℃延伸10min)，獲得2568bperl1基因片段(如seqidno：2所述)，將該片段連接到1300s載體2×35s啟動子后的多克隆位點xbaⅰ和salⅰ之間，獲得p1300s::erl1過表達載體。

具體步驟為：首先，用kod-fx酶對日本晴的erl1cdna進行擴增，連接中間載體pmd19-t，測序，獲得正確克隆erl1-cdna-t；其次，用takara的限制性內切酶xbaⅰ和salⅰ對載體erl1-cdna-t和p1300s分別進行雙酶切，t4dna連接酶16℃過夜進行連接反應，熱激轉化到dh5a大腸桿菌中，鑒定陽性質粒，得到該基因的過表達載體p1300s::erl1。質粒p1300s::erl1通過電擊的方法轉入農桿菌(agrobacteriumtumefaciens)株系eha105中轉化水稻。分別利用粳稻品種“日本晴”成熟胚誘導的愈傷組織，經過誘導培養基培養2周后，挑選生長旺盛愈傷用作轉化的受體。用含有質粒p1300s::erl1的eha105菌株侵染水稻愈傷，在黑暗、28℃條件下共培養3天后，在含有50mg/lhygromycin和400mg/l羧芐的篩選培養基上光照培養14天左右。將預分化的愈傷轉至分化培養基上在光照條件下培養。一個月左右得到抗性轉基因植株株系erl1-over-1和erl1-over-2。對植株進行鑒定和連續的觀察，發現轉基因水稻產生了與雜合型突變體類似的葉片半卷曲表型，而且不同的erl1表達量表現出不同的葉片卷曲程度和植株高度(圖6)。

圖6中的erl1-over-1為erl1過表達轉基因株系1；erl1-over-2為erl1過表達轉基因株系1；erl1-over-1的表達量相對野生型武運粳7相比為448.55，erl1-over-2的表達量相對野生型武運粳7相比為313.95。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。

<110>中國水稻研究所

<120>水稻半顯性卷葉調控基因erl1及其應用

<160>3

<210>1

<211>6129

<212>gdna

<213>水稻（oryzasativa）

<400>1

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