本發明涉及一種嬰兒的口腔細胞dna提取試劑盒。
背景技術：
隨著近年來嬰兒基因保存、易感基因檢測與產前診斷需求的急劇增加，對口腔細胞dna提取試劑盒的需求也逐年增加。
但是目前市場上的口腔細胞dna提取試劑盒有如下顯著的缺陷：(1)取樣拭子簡陋，通常使用粗糙的棉棒或者粗糙的化纖刮棒，取樣效率不高，難以判斷取樣效果。(2)拭子取樣后在寄送往檢測單位過程中容易腐敗變質，無法進行后續操作。(3)現行的試劑盒為防止取樣拭子腐敗變質往往要求將拭子在空氣中晾干，此步操作極易引起樣品污染。(4)目前市場上的口腔細胞dna提取試劑盒最多只能從一次采樣中提取3ug基因組，若后續需要進行大量基因操作，則要多次采樣提取才能滿足。(5)目前市場上沒有專門針對嬰兒的口腔細胞dna提取試劑盒，因為嬰兒口腔細胞采樣困難，并且采樣量極小，如果用目前市場上的常用的口腔細胞dna提取試劑盒進行操作，難以得到需要的基因量。
授權公告號為cn1943517b的發明專利公開了一種口腔粘膜細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒(聯合基因生物科技(上海)有限公司)，該發明是一個口腔細胞采集、保存試劑盒，通過取樣后立即裂解細胞、失活蛋白來防止腐敗，延長了細胞樣品保存時間。盡管其技術方案取得了一定的突破，但并未解決取樣效率不高、得率低、操作復雜等問題。
技術實現要素：
針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種嬰兒的口腔細胞dna提取試劑盒。
本發明是通過以下技術方案實現的：
第一方面，本發明提供一種口腔細胞采集拭子，包括采樣頭和拭子桿；還包括容納所述采樣頭的保存管，所述保存管的管口設有可拆卸的蓋體；所述蓋體上設有與所述拭子桿外徑大小匹配的孔，拭子桿可自由穿過所述孔；所述蓋體包括鉸接在一起的內蓋與外蓋，所述內蓋的外徑與所述保存管管口的內徑相匹配，所述外蓋的外徑與所述孔的直徑相匹配。
優選地，所述保存管的材質為聚乙烯，具有較好的剛性強度。
優選地，所述采樣頭為八邊形的片狀結構。進一步地，所述八邊形為長八邊形，即與所述拭子桿平行的一組對邊長度大于其他三組對邊。
優選地，所述采樣頭的直徑為0.4～0.8mm，遠大于普通采樣棉簽(直徑0.2mm)能夠大大減少嬰兒采樣時的不適感，提高采樣效率；所述直徑具體指采樣頭垂直于所述拭子桿方向的寬度。
優選地，所述采樣頭的表面分布有絨毛，絨毛密度細密，易吸附口腔細胞，增加了采樣成功率；所述絨毛的長度小于0.5mm。
優選地，所述采樣頭采用柔軟吸水材料制作而成。
優選地，所述拭子桿的長度為200mm，直徑為2mm。
采樣結束后將采樣頭置于保存管中，蓋緊外蓋，再拔出拭子桿，此時采樣頭攜帶口腔細胞留在保存管中，再用存管蓋內蓋封上外蓋上的孔，即完成采樣。
第二方面，本發明提供一種口腔細胞采集盒，包括所述口腔細胞采集拭子、保溫部件、封裝部件；所述口腔細胞采集拭子、保溫部件封裝于所述封裝部件中。
優選地，所述保溫部件包括冰袋，用于控制溫度。進一步地，所述冰袋選自普通市面所售的冰袋，型號包括65mm×65mm。
優選地，所述封裝部件包括自封袋。進一步地，所述自封袋具體為鋁箔基質自封袋，外涂不透明涂料，涂料有一定隔熱效果，是一種增厚隔熱自封袋，對冰袋的保溫起輔助作用；所述自封袋的型號為14cm×23cm。
使用本發明口腔細胞采集盒采集樣品后，帶有采集樣品的采樣頭保存在保存管中，保存管與保溫冰袋一同放入增厚隔熱自封袋中，封上袋口即可保證樣品保持-20℃至少8個h。在這段時間里將樣品運回檢測單位待檢。
以上第一方面所述的口腔細胞采集拭子的結構設計、第二方面所述口腔細胞采集盒部件組成設計具備如下有益效果：
1、提出了嬰兒專用的口腔細胞采樣拭子，大大提高了采樣效率；
2、該采集拭子采樣過程快，暴露時間短，采樣全程不需要借助其他工具即可分離樣品與多余的部件，大大減少了污染
3、一體式低溫保存設計阻止了樣品腐敗的發生，無需像同類產品在空氣中晾干拭子，減少了空氣中微生物污染樣品的可能。
第三方面，本發明提供一種口腔細胞dna提取試劑盒，包括所述口腔細胞采集盒、口腔細胞dna提取試劑盒。
優選地，所述口腔細胞dna提取試劑盒包括懸浮緩沖液、裂解液、phi29dna聚合酶(polymerase)、反應緩沖液(reactionbuffer)。
優選地，所述懸浮緩沖液、裂解液常溫保存。
優選地，所述懸浮緩沖液配方為：0.1％吐溫-20，nacl200mmol/l，kcl2mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l。
優選地，所述裂解液的配方為：dtt0.1m，tris-hcl20mm，鹽酸胍5m。
優選地，所述phi29dna聚合酶(polymerase)和反應緩沖液(reactionbuffer)保存于-10℃～-30℃。進一步優選地，所述phi29dna聚合酶(polymerase)和反應緩沖液(reactionbuffer)保存于-20℃。
第四方面，本發明提供一種用所述試劑盒進行口腔細胞dna提取的方法，包括：
第一步，裂解細胞：向裝有采樣頭的保存管內加入懸浮緩沖液，混合；取混合所得混合液加至pcr管，再加入裂解液，混合、加熱，制成細胞裂解液；
第二步，擴增基因：向所得細胞裂解液中加入phi29dna聚合酶(polymerase)和反應緩沖液(reactionbuffer，孵育完成dna擴增，再次孵育、使酶失活，即可。
優選地，第一步中，向保存管內加入懸浮緩沖液的體積以足夠浸沒采樣頭，且保證保存管內液體體積大于采樣頭體積。進一步優選地，加入懸浮緩沖液的體積為1～2ml，特別優選為1ml。
優選地，第一步中，加入懸浮緩沖液后混合的時間為5～20s。優選為20s。
優選地，第一步中，向pcr管中加入的混合液與裂解液為等體積。優選為5ul。
優選地，第一步中，加入裂解液后混合的時間為5～20s。優選為20s。
優選地，第一步中，所述加熱的條件為60～75℃、1～10min。優選為70℃、5min。此處加熱的溫度越高，所需時間越短，高于70℃時加熱所需時間不到5min，70℃時需要加熱5min，60℃需要加熱10min。
優選地，第二步中，所述孵育的條件為30℃、6～10h。優選為8h，8h后phi29dnapolymerase酶基本進入平臺期，復制不再進行，產物達到最大濃度。
優選地，第二步中，所述再次孵育的條件為65℃、5min，使酶失活。
以上所述的口腔細胞dna提取的方法具備如下優勢：
1、高效：首次將mda技術引入“嬰兒口腔細胞提取”產品，大大提高了產物得率。
2、省時：原先復雜的先提取再擴增的方法需要人工操作4h以上。本發明提出的“兩步法mda直接擴增技術”只需人工操作20min。
3、原先復雜的先提取再擴增的方法需要20萬至100萬個細胞才能滿足提取要求，本方法只需要采取的細胞量達到1000個即可。
本發明擴增基因使用的主要技術為mda，關鍵成分是phi29dna聚合酶，為了使得本發明的內容更加的清晰，以下是對mda與phi29dna聚合酶的介紹：
phi29dna聚合酶是從一種攜帶有噬菌體phi29dna聚合酶基因重組e.coli菌株(ane.colistrainthatcarriesthephi29dnapolymerasegenefrombacteriophagephi29)中發現的，能夠在30℃條件下對dna進行擴增的酶。這種酶是人們在擴增大的環狀dna模板如質粒或噬菌體dna時發現了這種酶具有滾環擴增dna的能力，由blanco等于1984年率先報道(1984，proc.natl.acad.sci.usa，81,5325-5329)。最早該酶被用于擴增環狀dna，稱為滾環擴增方法。但是后來發現phi29dna聚合酶還可以擴增線性dna(稱為多重置換擴增-multipledisplacementamplification,mda)。在mda中，phi29dna聚合酶和耐核酸外切酶活性的隨機引物，不需要經過pcr熱循環過程，只在30℃條件下恒溫即可反應。將上述反應中的模板換成人類基因組dna,發現線性的模板同樣也可被擴增，其擴增的機制是一種鏈置換反應。首先隨機6堿基寡核苷酸作為引物在多個位點與基因組模板dna退火，接下來phi29dna聚合酶在dna的多個位點同時起始復制，它沿著dna模板合成dna，同時取代模板的互補鏈。被置換的互補鏈又成為新的模板來進行擴增，成為一個級聯分支的放大系統。因此最終可以獲得大量高相對分子質量的dna，因而，這種方法被稱為多重置換擴增(multipledisplacementamplification,mda)。
phi29dna聚合酶擴增具有以下優點：
1、樣本無需純化：可用來進行基因組dna擴增的樣本種類有很多，包括新鮮或水凍的全血、組織培養細胞、口腔拭子細胞、病灶的炎性白膜層等。在多重置換擴增反應中，樣本不需要經過純化，可以直接作為起始模板進行全基因組擴增，并能獲得高純度的dna產物。傳統樣本的處理往往要經過費時的步驟，很難實現自動化，限制了高通量的使用。而進行mda反應的細胞或全血，只要經過簡單的裂解步驟就可進行后續的擴增，dna抽提及各種純化步驟都省略了，有效避免了處理過程中可能的污染，而且大大簡化了操作，特別適用于臨床樣品的分析和檢測。通過mda擴增10000倍甚至獲得更多的dna，而且比通過傳統抽提法得到的樣本dna純度還要高。這是因為phi29dna聚合酶高效的活性能確保各種不同的模板有一致的產量。另一方面，如果將0.05l的血液加入到100ixl的mda反應體系中，血液被稀釋了2000倍，一些抑制反應的因素如血液中的血紅素或樣品添加劑edta等，經過這樣的稀釋后所造成的影響就幾乎可以忽略了。所以能確保未經純化后的樣本經過mda擴增后有較高的純度，可以直接用于后續的遺傳分析研究。
2、產量穩定：基因組dna經過30℃反應4～6h,mda擴增達到高峰后維持在一個穩定水平，使所有反應的dna產量幾乎相等。looμl的反應體系中，無論起始模板量差別多大(100fg～10ng),擴增后的dna產量都一致保持在20～30g左右，十分穩定。這種一致的產量在某些方面是很重要的。因為無需對dna定量，所以允許使用不同起始濃度或數量的樣品，并且對下游的遺傳分析提供可重復的結果。而傳統的方法所產生的基因組dna，在產量和純度方面都有顯著的不同，在進行基因檢測前必須重新測量和調整濃度。而且相對于其他全基因組擴增如pep法產生大小不一的短片段，mda能擴增出集中均一的長片段產物。這是因為來自于噬菌體phi29的dna聚合酶能與dna模板結合得非常緊密，每次能持續擴增約70000個堿基而不解離，所以能在mda反應中產生長片段的dna產物，平均12kb，最長可達100kb。長片段的產物有利于多方面的應用，包括限制性片段長度多態分析，設計探針及dna測序等方面。
3、對基因組均勻擴增：在許多情況下，全基因組擴增應以最低的位點擴增誤差提供盡可能完全的基因組覆蓋率，使產物保持模板的遺傳序列信息。任何一種擴增方法都會導致一定的序列偏差，導致的因素很多如引物效率、模板的結合力、gc含量、與端粒和著絲粒的遠近等。一種全基因組擴增方法是否有效，取決于能否以最小的擴增偏差代表整個基因組的能力。這些基于pcr用于wga的方法如dop和pep，因為在不同位點間存在大范圍的偏差，從而限制了這些方法的使用。擴增偏差改變了dna序列組成的信息，使它在診斷性的檢測中成為不可靠的模板。有些情況下，基因組的某些區域完全缺失，導致等位基因丟失和誤診的發生。mda能使基因組dna得到均勻的擴增，從而使各個位點達到較完全的覆蓋，確保后續遺傳分析的準確性。
4、操作簡單，不依賴pcr反應：操作比較簡單，原始樣本(全血、血漿、細胞等)無需純化，經細胞裂解提取dna后，加入到eppendof管的反應液中，包括dntp、六核苷酸隨機引物、phi29dna聚合酶以及酶緩沖液，然后置于30℃水浴下蜉育4～6h進行多重置換擴增反應，最后65℃8min滅活酶的活性。反應結束后即可產生大量長片段均一、完整的全基因組dna序列。因為反應在水浴中進行，而不是在熱循環儀中，從而避免了pcr反應所帶來的非特異性擴增產物，反應體系可以根據需要按比例任意配制。該方法高效、簡單，非常適合于臨床的遺傳分析檢測。
盡管上述技術及其優勢已被在先技術cn101619364a(檢測hpv的方法及phi29dna聚合酶在檢測hpv中的應用)公開，但是具體到嬰兒的口腔細胞dna，是無法進行借鑒、應用的，這是是目前應用的難題，因此本發明將上述技術在嬰兒的口腔細胞dna中的應用從而實現優異的效果，是付出了大量的創造性的勞動的。
與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：
(1)口腔細胞采集拭子安全、舒適、高效；
(2)口腔細胞采集拭子取樣后在寄送往檢測單位過程中能夠持續低溫杜絕微生物污染；
(3)操作簡易無需晾干拭子，減少拭子暴露時間；
(4)得率高，目前市場上的口腔細胞dna提取試劑盒最多只能從一次采樣中提取3ug基因組，若后續需要進行大量基因操作，則要多次采樣提取才能滿足；本發明在同樣采樣量的情況下可以獲得50ug基因組；
(5)這是一款專門針對嬰兒的口腔細胞dna提取試劑盒，考慮到嬰兒取樣、擴增的種種困難，能高效的完成采樣、保存與提取等步驟。
附圖說明
通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯：
圖1為口腔細胞采集拭子結構示意圖；其中，1是保存管，2是采樣頭，3是蓋體，31是外蓋，32是內蓋，4是拭子桿，5是孔。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。
實施例1
本實施例提供一種口腔細胞采集拭子，結構見圖1所示，包括采樣頭2和拭子桿4；還包括容納所述采樣頭2的保存管1，所述保存管1的管口設有可拆卸的蓋體3；所述蓋體3上設有與所述拭子桿4外徑大小匹配的孔5，拭子桿4可自由穿過所述孔5；所述蓋體3包括鉸接在一起的內蓋32與外蓋31，所述內蓋32的外徑與所述保存管1管口的內徑相匹配，所述外蓋31的外徑與所述孔5的直徑相匹配。
上述結構中，所述保存管1的材質為聚乙烯，剛性強度較好；所述采樣頭2為八邊形的片狀結構，直徑為0.8mm，采用柔軟吸水材料制作而成；所述采樣頭2的表面分布有細密的絨毛，絨毛的長度為0.3mm，易吸附口腔細胞，增加了采樣成功率；所述拭子桿4的長度為200mm，直徑為2mm。
需要說明的，本發明提供的口腔細胞采集拭子，采樣頭的直徑為0.4～0.8mm中的任意值均可，絨毛的長度小于0.5mm即可。
在使用本實施例提供的口腔細胞采集拭子采樣結束后，將采樣頭2置于保存管1中，蓋緊外蓋31，再拔出拭子桿4，此時采樣頭2攜帶口腔細胞樣品留在保存管1中，再用內蓋32封上外蓋31上的孔5，即可。
實施例2
本實施例提供一種口腔細胞采集盒，包括實施例1所述的口腔細胞采集拭子、保溫部件、封裝部件；所述口腔細胞采集拭子、保溫部件封裝于所述封裝部件中；
其中，所述保溫部件為市售常見冰袋，用于控制溫度，防止樣品高溫腐蝕；所述封裝部件主要用于盛裝冰袋和口腔細胞采集拭子，一般采用自封袋，涂有不透明涂料的鋁箔基質自封袋具有一定隔熱效果，可以輔助冰袋進行溫度控制。
使用本實施例的口腔細胞采集盒采集樣品后，含有采樣頭的保存管與冰袋一同放入自封袋中，封上袋口即可保證樣品保持-20℃至少8h。這段時間足以將樣品運回檢測單位待檢。
實施例3
本實施例提供一種嬰兒的口腔細胞dna提取試劑盒：包括實施例2所述口腔細胞采集盒、口腔細胞dna提取試劑盒；其中，所述口腔細胞dna提取試劑盒包括懸浮緩沖液、裂解液、phi29dna聚合酶(polymerase)、反應緩沖液(reactionbuffer)；
所述懸浮緩沖液配方為：0.1％吐溫-20，nacl200mmol/l，kcl2mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l；所述裂解液的配方為：dtt0.1m，tris-hcl20mm，鹽酸胍5m；一般情況下，所述懸浮緩沖液、裂解液常溫保存；
所述phi29dna聚合酶(polymerase)和反應緩沖液(reactionbuffer)保存于-10℃～-30℃，保存于-20℃更佳。
實施例4
本實施例提供一種利用實施例3試劑盒進行嬰兒口腔細胞dna提取dna的方法，整個流程如下：
1、將口腔細胞采集盒部分由采樣人員分發給受試者；口腔細胞dna提取試劑盒部分根據實施例3所列條件進行保存。
2、預冷口腔細胞采集盒中冰袋10h(-20℃以下預冷，優選-30℃)，采樣4個月齡嬰兒。
用采樣頭2在嬰兒口兩側腔壁上刮擦1～5次(優選5次及以上)，將采樣頭2放入保存管1，蓋緊外蓋31，拔出拭子桿4，再蓋緊內蓋32。取樣時間約5min(優選2min以內)。
3、將裝有采樣頭2的保存管1放與保溫冰袋一同放入增厚隔熱自封袋中，封上袋口將樣品送往實驗室，可在常溫下放置8～14h(優選8h以內送往檢測實驗室)，用口腔細胞dna提取試劑盒進行dna提取；如不能立即操作，則將保存管放置于冰箱-20℃冷凍層保存，可儲存一個月(優選2周以內進行提取)
4、實驗室收到樣品后向裝有采樣頭2的保存管1內加入1ml懸浮緩沖液，混合10s；取出5ul加入5ul裂解液混合10s，70℃加熱1～10min(優選5min)，制成細胞裂解液。
5、向10ul細胞裂解液中加入phi29dnapolymerase和反應緩沖液，30℃孵育6～10h(優選8h)，即完成擴增反應。之后，65℃孵育產物5min，使酶失活。
6、檢測產物濃度為1800ng/ul，共50ul。即獲得基因組dna90ug。
本實施例提供的提取方法，與現有技術相比，具有如下的有益效果：(1)口腔細胞采集拭子安全、舒適、高效；(2)口腔細胞采集拭子取樣后在寄送往檢測單位過程中能夠持續低溫杜絕微生物污染；(3)操作簡易無需晾干拭子，減少拭子暴露時間；(4)得率高，目前市場上的口腔細胞dna提取試劑盒最多只能從一次采樣中提取3ug基因組，若后續需要進行大量基因操作，則要多次采樣提取才能滿足；本發明在同樣采樣量的情況下可以獲得50ug基因組；(5)這是一款專門針對嬰兒的口腔細胞dna提取試劑盒，考慮到嬰兒取樣、擴增的種種困難，能高效的完成采樣、保存與提取等步驟。
以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發明的實質內容。