引物組合物及其應用、陰道毛滴蟲檢測試劑盒的制作方法

本發明涉及醫學生物技術領域，且特別涉及一種引物組合物及其應用、陰道毛滴蟲檢測試劑盒。

背景技術：

陰道毛滴蟲(trichomonasvaginalis,t.vaginalis)是一種常見的寄生原蟲，呈全球分布，以性傳播為主，也可以通過間接接觸傳播。其常寄生于女性陰道和尿道，男性的尿道和前列腺，表現為無癥狀帶蟲狀態或急、慢性炎癥。陰道毛滴蟲作為細胞外寄生原蟲主要是吸附在上皮細胞表面寄生，其對上皮細胞的損傷主要依賴于直接接觸。蟲體感染人的生殖泌尿道后，其多形性偽足穿行與包繞及鞭毛運動的機械作用，尤其是釋放水解酶的消化作用和吞噬作用以及細胞脫落因子等綜合因素，可直接損傷寄生部位的上皮細胞，繼而引起組織器官炎癥。

據統計，全世界每年有超過1.7億人感染此病，各地人群的感染率有所不同且有增高趨勢。美國每年有將近500萬人感染陰道毛滴蟲；日本婦女陰道毛滴蟲感染率為24.3％；烏干達農村婦女感染率為23.8％；南非農村婦女感染率為18.0％；而在我國，不同地方及不同人群中陰道毛滴蟲的感染率波動很大，范圍在百分之幾到百分之幾十之間。陰道毛滴蟲感染可造成婦女非典型性盆腔炎，男性的尿道炎、前列腺炎，其還可引起新生兒滴蟲性肺炎、支氣管炎和口腔損害等呼吸道炎癥。孕婦感染可出現胎膜早破、早產、流產和新生兒體重過低。近年研究顯示，陰道毛滴蟲感染還與女性的宮頸癌、男性的前列腺癌以及不孕不育有關，此外，陰道毛滴蟲的廣泛感染和流行還增加了人類感染免疫缺陷病毒(hiv)和支原體的風險。研究表明，陰道毛滴蟲已經成為hiv感染的重要協同因素。

準確診斷陰道毛滴蟲的感染是防治該病的重要環節，對阻止該病傳播具有重要的意義。目前，陰道毛滴蟲的檢測方法主要有濕片法、培養法、pcr、熒光抗體法和elisa。其中濕片法費用低，但敏感性差；培養法是被公認的診斷滴蟲病的“金標準”，其敏感性較高，但費時長，且要求標本質量高以及鏡檢者具有很好的專業知識和經驗；pcr檢測敏感性強、特異性高，但其依賴于價格昂貴的pcr儀，且擴增產物需要進行凝膠電泳進行分析；熒光抗體法和elisa敏感性強，但特異性較差，且抗體花費高，檢測耗時長。

技術實現要素：

本發明的第一目的在于提供一種引物組合物，該引物組合物能夠有效用于擴增陰道毛滴蟲的靶向dna。

本發明的第二目的在于提供一種上述引物組合物在制備陰道毛滴蟲檢測試劑盒中的應用。

本發明的第三目的在于提供一種陰道毛滴蟲檢測試劑盒，該試劑盒成本較低，可用于診斷是否感染陰道毛滴蟲，具有較高的敏感性和特異性。

本發明的第四目的在于提供一種引物組合物在檢測陰道毛滴蟲中的應用。

本發明解決其技術問題是采用以下技術方案來實現的：

本發明提出一種引物組合物，由4條引物組成，4條引物分別為f3、b3、fip和bip，f3、b3、fip和bip的堿基序列分別如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示。

本發明還提出上述引物組合物在制備陰道毛滴蟲檢測試劑盒中的應用。

本發明還提出一種陰道毛滴蟲檢測試劑盒，其包括上述引物組合物。

本發明還提出一種引物組合物在檢測陰道毛滴蟲中的應用。

本發明較佳實施例提供的引物組合物及其應用、陰道毛滴蟲檢測試劑盒的有益效果是：

引物組合物能夠有效用于擴增陰道毛滴蟲的靶向dna，該引物組合物可應用于制備陰道毛滴蟲檢測試劑盒，并可應用于檢測陰道毛滴蟲。

本發明較佳實施例中的陰道毛滴蟲檢測試劑盒成本較低，可用于診斷是否感染陰道毛滴蟲，具有較高的敏感性和特異性。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。

圖1為本發明提供的陰道毛滴蟲actin基因的巢式pcr的擴增步驟中的陰道毛滴蟲actin基因巢式pcr擴增產物圖；

圖2為本發明提供的陰道毛滴蟲ap65基因的lamp擴增步驟中的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增產物電泳圖；

圖3為本發明提供的陰道毛滴蟲ap65基因的lamp擴增步驟中的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增產物顯色圖；

圖4為本發明提供的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增的敏感性步驟中的陰道毛滴蟲actin基因巢式pcr外套擴增產物電泳圖；

圖5為本發明提供的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增的敏感性步驟中的陰道毛滴蟲actin基因巢式pcr內套擴增產物電泳圖；

圖6為本發明提供的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增的敏感性步驟中的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增產物電泳圖；

圖7為本發明提供的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增的敏感性步驟中的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增產物顯色圖；

圖8為本發明提供的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增的敏感性步驟中第(4)步的陰道毛滴蟲actin基因巢式pcr外套擴增產物電泳圖；

圖9為本發明提供的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增的敏感性步驟中第(4)步的陰道毛滴蟲actin基因巢式pcr內套擴增產物電泳圖；

圖10為本發明提供的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增的敏感性步驟中第(4)步的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增產物電泳圖；

圖11為本發明提供的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增的敏感性步驟中第(4)步的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增產物顯色圖；

圖12為本發明提供的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增的特異性步驟中的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增產物電泳圖；

圖13為本發明提供的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增的特異性步驟中的陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增產物顯色圖。

具體實施方式

為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。

下面對本發明實施例進行具體說明。

本發明實施例提供的引物組合物為陰道毛滴蟲黏附蛋白65(ap65)基因的特異性引物。該引物組合物由4條引物組成，4條引物分別為f3、b3、fip和bip。具體地，f3、b3、fip和bip的堿基序列分別如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示。

seqidno.5：cctgccagaagtgggcta；seqidno.6：acctgaccgatgagtgtgta；seqidno.7：cgtgggtagttgcggaggatgacaccgccagtcataccg；seqidno.8：tcgtcgttacagatggtggccagcttgccgactgggata。

上述4條(f3、b3、fip和bip4)引物是以陰道毛滴蟲黏附蛋白65(adhesionprotein65，ap65)基因作為靶標分子而設計的，因此，該4條引物對陰道毛滴蟲具有較高的特異性和敏感性。

作為可選地，可將上述引物組合物用于制備陰道毛滴蟲檢測試劑盒，以快速、準確的檢測是否感染陰道毛滴蟲。

進一步地，本發明實施例還提供了陰道毛滴蟲檢測試劑盒，其包括上述引物組合物，也即包括f3、b3、fip和bip。

作為可選地，該陰道毛滴蟲檢測試劑盒還可包括dntps、甜菜堿、氯化鎂、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶緩沖液以及超純水。其中，甜菜堿可促進dna雙鏈的解鏈，并減少引物二聚體的產生。氯化鎂所含的鎂離子為polymerase的激活劑，其濃度過高會降低擴增的特異性，濃度過低會影響擴增產量，甚至導致擴增失敗得不到所需的擴增產物。

鑒于此，本實施例中陰道毛滴蟲檢測試劑盒中所含的引物組合物及各試劑的濃度分別可以如下：f3的濃度為3.5-4.5μmol/l、b3的濃度為3.5-4.5μmol/l、fip的濃度為15-17μmol/l、bip的濃度為15-17μmol/l；dntps的濃度為8-12μmol/l、甜菜堿的濃度為4.5-5.5μmol/l、氯化鎂的濃度為23-27mmol/l、bstdna聚合酶的濃度為7.5-8.5u/μl。bstdna聚合酶緩沖液優選為10倍濃度，也即10×bstdna聚合酶緩沖液。

更佳地，上述陰道毛滴蟲檢測試劑盒中所含引物組合物及各試劑的濃度分別如下：f3的濃度為4μmol/l、b3的濃度為4μmol/l、fip的濃度為16μmol/l、bip的濃度為16μmol/l；dntps的濃度為10μmol/l、甜菜堿的濃度為5μmol/l、氯化鎂的濃度為25mmol/l、bstdna聚合酶的濃度為8u/μl。bstdna聚合酶緩沖液為10倍濃度。

進一步地，上述陰道毛滴蟲檢測試劑盒還可包括染料，作為可選地，本實施例中的染料例如可以為sybrgreenⅰ、goldview和eb中的任意一種。

優選地，本實施例中的染料選用sybrgreenⅰ。該染料配合試劑盒中的其它試劑和引物組合物，對陰道滴毛蟲的檢測具有顯著的敏感性，不需要紫外激發即可使擴增產物顯色。而經goldview和eb兩種染料染色后的擴增產物需在紫外激發條件下才能顯色。因此，sybrgreenⅰ較其余兩種染料使用更加方便，效果也較佳。

在具體檢測過程中，可將經sybrgreenⅰ染色后的陰道毛滴蟲的dna擴增產物在日光或紫外光的環境中顯色。其顯色情況如下：在日光環境中顯示綠色熒光，在紫外光的環境中顯示強烈的熒光。

此外，本實施例還提供一種上述引物組合物在檢測陰道毛滴蟲中的應用。較佳地，本應用采用的為lamp技術，包括提取待測樣品的dna，用上述陰道毛滴蟲檢測試劑盒對樣品的dna進行lamp擴增，然后檢測擴增產物。

作為可選地，lamp擴增過程中的反應體系由本實施例上述陰道毛滴蟲檢測試劑盒中所含引物組合物及各試劑組成。

與上述引物組合物及各試劑的較佳濃度對應地，引物組合物及各試劑的體積例如可以如下：f3的體積為0.5-1.5μl、b3的體積為0.5-1.5μl、fip的體積為0.5-1.5μl、bip的體積為0.5-1.5μl；dntps的體積為1.5-2.5μl、甜菜堿的體積為5.5-6.5μl、氯化鎂的體積為2.5-3.5μl、bstdna聚合酶的體積為1-2μl、bstdna聚合酶緩沖液的體積為1.5-2.5μl。另外，反應體系中的超純水的體積可以為0.5μl，dna的體積可以為0.8-1.2μl。

與上述引物組合物及各試劑的更佳濃度對應地，引物組合物及各試劑的體積例如可以如下：f3的體積為1μl、b3的體積為1μl、fip的體積為1μl、bip的體積為1μl；dntps的體積為2μl、甜菜堿的體積為6μl、氯化鎂的體積為3μl、bstdna聚合酶的體積為1.5μl、bstdna聚合酶緩沖液的體積為2μl、dna的體積為1μl、超純水的體積為0.5μl。

較佳地，本實施例中反應體系所含的f3、b3、fip、bip、dntps、甜菜堿、氯化鎂、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶緩沖液、dna以及超純水的總體積控制在20μl。

進一步地，本實施例中lamp擴增可以包括以下步驟：混合f3、b3、fip、bip、dntps、甜菜堿、氯化鎂、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶緩沖液、dna以及超純水，得到混合物。

將上述混合物于60-70℃的條件下第一次孵育110-130min，然后再于至少80℃的條件下滅活bstdna聚合酶得到擴增產物。可選地，滅活bstdna聚合酶可以是將第一次孵育后的混物于至少80℃的條件下第二次孵育8-12min，以保證bstdna聚合酶完全被滅活。

作為可選地，第一次孵育和第二次孵育均采用恒溫水浴方式進行。較優地，第一次孵育可以在63℃的條件下恒溫水浴120min，第二次孵育可以在80℃的條件下恒溫水浴10min。

當陰道毛滴蟲檢測試劑盒中不含有染料時，可以通過核酸凝膠電泳的方法對擴增產物進行檢測。由此得到的檢測結果若顯示階梯狀擴增條帶，則表示該檢測樣品陰道毛滴蟲呈陽性；若檢測結果未顯示階梯狀擴增條帶，則表示該檢測樣品陰道毛滴蟲呈陰性。

當陰道毛滴蟲檢測試劑盒中含有熒光染料時，對擴增產物的檢測即可于擴增產物中加入熒光染料，然后在日光或紫外光環境中觀察擴增產物的熒光顯色情況。當熒光染料是goldview和eb時，擴增產物需在紫外激發條件下觀察顯色情況；而當熒光染料是sybrgreenⅰ時，擴增產物在日光燈下即可觀察到顯色情況。加入染料后得到的檢測結果若在日光下顯示綠色熒光或在紫外光下顯示強烈的熒光，則表示該檢測樣品陰道毛滴蟲呈陽性；若在日光或在紫外光下未顯示綠色熒光而呈橙色，則表示該檢測樣品陰道毛滴蟲呈陰性。

值得說明的是，本實施例中的染料并非僅限于上述染料，其它任何可以使dna擴增產物顯色以判斷檢測樣品是否感染陰道毛滴蟲的染料均在本方案的保護范圍之內。此外，上述陰道毛滴蟲檢測試劑盒所包括的試劑及lamp擴增方法中的步驟和參數均可根據實際情況做適當調整。

以下結合實施例對本發明的特征和性能作進一步的詳細描述。

實施例1

本實施例提供一種引物組合物，其由f3、b3、fip和bip四條引物組成。f3、b3、fip和bip以陰道毛滴蟲黏附蛋白65(adhesionprotein65，ap65)基因作為靶標分子設計而得，該四條引物的堿基序列分別如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示。

實施例2

本實施例提供一種陰道毛滴蟲檢測試劑盒。該試劑盒包括實施例1中的引物組合物以及dntps、甜菜堿、氯化鎂、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶緩沖液和超純水。

實施例3

本實施例提供一種陰道毛滴蟲檢測試劑盒。該試劑盒包括實施例1中的引物組合物以及dntps、甜菜堿、氯化鎂、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶緩沖液和超純水。

其中，f3的濃度為3.5μmol/l、b3的濃度為3.5μmol/l、fip的濃度為15μmol/l、bip的濃度為15μmol/l；dntps的濃度為8μmol/l、甜菜堿的濃度為4.5μmol/l、氯化鎂的濃度為23mmol/l、bstdna聚合酶的濃度為7.5u/μl、bstdna聚合酶緩沖液為10×bstdna聚合酶緩沖液。

實施例4

本實施例提供一種陰道毛滴蟲檢測試劑盒。該試劑盒包括實施例1中的引物組合物以及dntps、甜菜堿、氯化鎂、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶緩沖液和超純水。

其中，f3的濃度為4.5μmol/l、b3的濃度為4.5μmol/l、fip的濃度為17μmol/l、bip的濃度為17μmol/l；dntps的濃度為12μmol/l、甜菜堿的濃度為5.5μmol/l、氯化鎂的濃度為27mmol/l、bstdna聚合酶的濃度為8.5u/μl、bstdna聚合酶緩沖液為10×bstdna聚合酶緩沖液。

實施例5

本實施例提供一種陰道毛滴蟲檢測試劑盒。該試劑盒包括實施例1中的引物組合物以及dntps、甜菜堿、氯化鎂、bstdna聚合酶、bstdna聚合酶緩沖液和超純水。

其中，f3的濃度為4μmol/l、b3的濃度為4μmol/l、fip的濃度為16μmol/l、bip的濃度為16μmol/l；dntps的濃度為10μmol/l、甜菜堿的濃度為5μmol/l、氯化鎂的濃度為25mmol/l、bstdna聚合酶的濃度為8u/μl、bstdna聚合酶緩沖液為10×bstdna聚合酶緩沖液。

實施例6

本實施例提供一種包括sybrgreenⅰ染料的陰道毛滴蟲檢測試劑盒。該試劑盒中除sybrgreenⅰ染料外所含的物質可以與實施例3-5中任一實施例相同。

實施例7

本實施例提供一種包括goldview染料的陰道毛滴蟲檢測試劑盒。該試劑盒中除goldview染料外所含的物質可以與實施例3-5中任一實施例相同。

實施例8

本實施例提供一種包括eb染料的陰道毛滴蟲檢測試劑盒。該試劑盒中除eb染料外所含的物質可以與實施例3-5中任一實施例相同。

實施例9

本實施例提供一種引物組合物在檢測陰道毛滴蟲中的應用。包括提取待測樣品的dna，并按以下體系配制成混合物：

1.5μl濃度為4.5μmol/l的f3、1.5μl濃度為4.5μmol/l的b3、1.5μl濃度為17μmol/l的fip、1.5μl濃度為17μmol/l的bip、2.5μl濃度為12μmol/l的dntps、6.5μl濃度為5.5μmol/l的甜菜堿、3.5μl濃度為27mmol/l的氯化鎂、2μl濃度為8.5u/μl的bstdna聚合酶、2.5μl的10×bstdna聚合酶緩沖液、0.5μl的超純水以及1.2μl的dna。

將上述混合物于60℃恒溫水浴下第一次孵育130min，然后再于80℃恒溫水浴下第二次孵育12min以滅活bstdna聚合酶，得到擴增產物。以核酸凝膠電泳的方式對擴增產物進行檢測。

實施例10

本實施例提供一種引物組合物在檢測陰道毛滴蟲中的應用。包括提取待測樣品的dna，并按以下體系配制成混合物：

0.5μl濃度為3.5μmol/l的f3、0.5μl濃度為3.5μmol/l的b3、0.5μl濃度為3.5μmol/l的fip、0.5μl濃度為3.5μmol/l的bip、1.5μl濃度為8μmol/l的dntps、5.5μl濃度為4.5μmol/l的甜菜堿、2.5μl濃度為23mmol/l的氯化鎂、1μl濃度為7.5u/μl的bstdna聚合酶、1.5μl的10×bstdna聚合酶緩沖液、0.5μl的超純水以及0.8μl的dna。

將上述混合物于70℃恒溫水浴下第一次孵育110min，然后再于85℃恒溫水浴下第二次孵育8min以滅活bstdna聚合酶，得到擴增產物。

于擴增產物中加入goldview，然后于紫外激發的條件下觀察擴增產物的顯色情況。

實施例11

本實施例提供一種引物組合物在檢測陰道毛滴蟲中的應用。包括提取待測樣品的dna，并按以下體系配制成混合物：

1μl濃度為4μmol/l的f3、1μl濃度為4μmol/l的b3、1μl濃度為4μmol/l的fip、1μl濃度為4μmol/l的bip、2μl濃度為10μmol/l的dntps、6μl濃度為5μmol/l的甜菜堿、3μl濃度為25mmol/l的氯化鎂、1.5μl濃度為8u/μl的bstdna聚合酶、2μl的10×bstdna聚合酶緩沖液、0.5μl的超純水以及1μl的dna。

將上述混合物于63℃恒溫水浴下第一次孵育120min，然后再于80℃恒溫水浴下第二次孵育10min以滅活bstdna聚合酶，得到擴增產物。

于擴增產物中加入sybrgreenⅰ，然后于日光下觀察擴增產物的顯色情況。

實施例12

本實施例提供一種引物組合物在檢測陰道毛滴蟲中的應用。其與實施例11的區別在于：于擴增產物中加入sybrgreenⅰ，然后于紫外光的條件下觀察擴增產物的顯色情況。

實施例13

本實施例提供一種引物組合物在檢測陰道毛滴蟲中的應用。其與實施例11的區別在于：于擴增產物中加入eb，然后于紫外激發的條件下觀察擴增產物的顯色情況。

試驗例

基礎材料：陰道毛滴蟲：陰道毛滴蟲新鄉株(trichomonasvaginalisxinxiangstrain)，取自滴蟲性陰道炎患者的陰道分泌物，由新鄉醫學院分離、培養及保存。lamp引物：f3、b3、fip和bip四條引物由在線網站設計、生成，其序列分別如seqidno.5至seqidno.8所示。巢式pcr引物：外、內套引物分別如seqidno.1-seqidno.4所示。

seqidno.1：tctggaatggctgaagaagacg；seqidno.2：cagggtacatcgtattggtc；seqidno.3：cagacactcgttatcg；seqidno.4：cggtgaacgatggatg。

試劑與工具酶：dna提取試劑盒購買于omega公司，dna分子量標準物、mgcl2和dntps購買于大連寶生物有限公司(takara)，甜菜堿、sybrgreeni和bstdna聚合酶(10×bstdnabuffer)購買于索萊寶生物科技有限公司，2×pcrmastermix購買于南京翼飛雪生物公司，其他試劑為國產分析純。

儀器設備：紫外可見分光光度計(bio-rad)；電熱恒溫水槽(型號：dk-8d，上海森信實驗儀器有限公司)，離心機(eppendorfcentrifuge5810r)、pcr儀(eppendorf)、電泳儀(型號：dyy-11b北京六一儀器)，核酸凝膠成像系統(bio-rad)。

操作如下：

1.陰道毛滴蟲的收集

將陰道毛滴蟲無菌接種于肝浸湯培養液中(每毫升培養液含青霉素1000u，鏈霉素1mg，制霉菌素1000u)，37℃培養48h。培養好的蟲體于2000r/min的條件下離心5min，pbs清洗兩次。

2.陰道毛滴蟲dna的提取

將收集的陰道毛滴蟲按照omegadna提取試劑盒的說明書所述，進行陰道毛滴蟲總dna提取。提取好的dna于-20℃的條件下凍存備用。該dna的初始濃度為90ng/μl。

3.陰道毛滴蟲actin基因的巢式pcr的擴增

(1)以上述陰道毛滴蟲dna為模板進行巢式pcr。反應所需要的外、內套引物out-f、out-r、in-f、in-r序列分別如seqidno.1-seqidno.4所示。

(2)外套pcr反應體系如下所述配制：

混勻后離心，外套pcr反應條件如下所述：

預變性：95℃，3min；變性：95℃，45s；退火：55℃，30s；第一次延伸：72℃，1min；第二次延伸：72℃，10min；保存：4℃。其中，變性、退火和第一次延伸為35個循環。

(3)內套pcr反應體系如下述配制：

混勻后瞬時離心，內套pcr反應條件如下所述：

預變性：95℃，5min；變性：95℃，45s；退火：50℃，30s；第一次延伸：72℃，1min；第二次延伸：72℃，10min；保存：4℃。其中，變性、退火和第一次延伸為35個循環。

(4)外、內套pcr結束之后，分別取10μl產物進行1％的核酸凝膠電泳。如圖1所示，可見一條1100bp大小的dna片段。圖1中m代表dna標準分子(marker)；1代表陰性對照外套擴增產物；2代表陰性對照內套擴增產物；3代表陰道毛滴蟲dna外套擴增產物；4代表陰道毛滴蟲dna內套擴增產物。

(5)內套pcr產物經回收、純化后進行測序，結果表明該序列與已知的陰道毛滴蟲actin基因序列的同源性可達99％。

4.陰道毛滴蟲ap65基因的lamp擴增

(1)以上述提取的陰道毛滴蟲的dna為模板，按照下表所述配制lamp反應體系。

(2)將該反應體系充分混勻，離心，放置于63℃恒溫水浴鍋孵育120分鐘。

(3)將上述反應體系轉入80℃恒溫水浴鍋孵育10分鐘，滅活bstdna聚合酶。

(4)反應結束后取5μl反應產物進行核酸凝膠電泳，如果結果顯示階梯狀擴增條帶(圖2)則表示該檢測樣品陰道毛滴蟲陽性，否則為陰性；或者向剩余的15μl反應中加入2μl的sybrgreeni，如果在日常光下顯示綠色熒光或者在紫外光下顯示強烈的熒光(圖3)，則表示該檢測樣品陰道毛滴蟲陽性，否則為陰性。

圖2中m代表dna標準分子(marker)；1代表陰性對照lamp擴增產物；2代表陰道毛滴蟲dnalamp擴增產物。圖3中1代表陰性對照lamp擴增產物(橙色)；2代表陰道毛滴蟲dnalamp擴增產物(綠色)。

5.陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增的敏感性

(1)將上述提取的初始濃度為90ng/μl的陰道毛滴蟲的模板dna進行10¹-10¹²倍比稀釋，備用。

(2)按照上述操作過程分別進行巢式pcr和lamp擴增。

(3)結果如圖4-圖7所示，巢式pcr擴增能夠檢測到的最低模板濃度為90×10^-7ng/μl(圖4和圖5)，而lamp擴增技術能夠檢測到的最低模板濃度為90×10^-10ng/μl(圖6和圖7)。

圖4中m代表dna標準分子(marker)；1-8分別為陰道毛滴蟲dna進行10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍稀釋。圖5中m代表dna標準分子(marker)；1-8分別為陰道毛滴蟲dna進行10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍稀釋后，經外套pcr擴增，然后再以外套擴增產物進行巢式pcr內套擴增。圖6中m代表dna標準分子(marker)；1-7分別為陰道毛滴蟲dna進行10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²倍稀釋。圖7中1-7分別為陰道毛滴蟲dna進行10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²倍稀釋，1-5顯綠色，6、7顯橙色。

由此說明：本發明中基于lamp所建立的陰道毛滴蟲檢測技術的敏感性是巢式pcr的1000倍。

(4)為了進一步探討該lamp擴增技術在陰道毛滴蟲檢測中的敏感性，將陰道毛滴蟲滋養體分別稀釋到10³、10²、10¹、0個，并分別進行dna的提取，按照上述操作過程分別進行巢式pcr和lamp擴增。結果如圖8-圖11所示，巢式pcr可以檢測到10³個陰道毛滴蟲滋養體(圖8和圖9)，而lamp擴增可以檢測到10個陰道毛滴蟲滋養體(圖10和圖11)。

圖8中m代表dna標準分子(marker)；1-4分別為10³、10²、10¹、0個陰道毛滴蟲滋養體。圖9中m代表dna標準分子(marker)；1-4分別為10³、10²、10¹、0個陰道毛滴蟲滋養體dna，經外套pcr擴增，然后再以外套擴增產物進行巢式pcr內套擴增。圖10中m代表dna標準分子(marker)；1-4分別為10³、10²、10¹、0個陰道毛滴蟲滋養體。圖11中1-4分別為10³、10²、10¹、0個陰道毛滴蟲滋養體。1-3顯示綠色，4顯示橙色。

6.陰道毛滴蟲ap65基因lamp擴增的特異性

(1)分別以陰道毛滴蟲、旋毛蟲、弓形蟲、大腸桿菌、白色念珠菌、人型支原體、金黃色葡萄球菌等病原體的dna為模板，按照上述陰道毛滴蟲ap65基因的lamp擴增過程進行檢測。

(2)結果如圖12和圖13所示，只有陰道毛滴蟲樣品為陽性擴增，表明該陰道毛滴蟲的lamp檢測技術具有較好的特異性。

圖12中m代表dna標準分子(marker)；1-7分別是陰道毛滴蟲、旋毛蟲、弓形蟲、大腸桿菌、白色念珠菌、人型支原體、金黃色葡萄球菌等病原體的dna。圖13中1-7分別是陰道毛滴蟲、旋毛蟲、弓形蟲、大腸桿菌、白色念珠菌、人型支原體、金黃色葡萄球菌等病原體的dna。圖13中1顯示綠色，2-7顯示橙色。

綜上所述，本發明方案中所提出的引物組合物在檢測陰道毛滴蟲中的應用和其所對應的引物組合物具有高特異性、高敏感性等優點。使用該引物組合物檢測陰道毛滴蟲、旋毛蟲、弓形蟲、大腸桿菌、白色念珠菌、人型支原體、金黃色葡萄球菌等病原體，結果只從陰道毛滴蟲樣品中得到陽性擴增。應用所得的結果是巢式pcr檢測技術的1000倍，10個陰道毛滴蟲滋養體也能檢測出來。并且，上述引物組合物在檢測陰道毛滴蟲中的應用不需要特殊儀器，所用試劑廉價，所耗時間較短且操作簡便。

以上所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發明的范圍，而是僅僅表示本發明的選定實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

sequencelisting

<110>新鄉醫學院

<120>引物組合物及其應用、陰道毛滴蟲檢測試劑盒

<160>8

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