一類抗氧化超短肽及其應用的制作方法

本發明涉及一類抗氧化超短肽及其應用，屬于生物醫學技術領域。

背景技術：

自由基是具有強氧化活性的一組物質，極易發生反應。活性氧自由基不僅會使人體內的脂質與蛋白質發生鏈式氧化反應導致細胞膜、組織、酶和基因受損,對肌體造成了損害和衰老，而且會促使有關的基因突變，誘發相關的疾病，如動脈硬化癥、高血壓、類風濕性關節炎、白內障、老年癡呆癥、帕金森氏病以及神經退行性病變等。越來越多的醫學研究及臨床試驗證據顯示，體內自由基含量越高壽命越短，自由基可謂“萬病之源”。

近年來抗氧化在化妝品領域的應用中很廣泛。由于皮膚的光老化作用是由于紫外線誘導皮膚細胞產生大量的氧自由基堆積而造成的。現在許多護膚品中加入抗氧化劑,有減少雀斑、防輻射、延緩衰老、調節免疫和提高皮膚自我保護的作用。此外食品中營養成分的氧化反應會產生過氧化物。過氧化物影響食品的營養價值，甚至嚴重還可導致疾病發生，尋找安全的抗氧化劑以抑制過氧化物產生一直是生化營養學的研究熱點。

目前，化工領域常用抗氧化劑多為化學合成物，如bha、bht等，雖抗氧化效果良好，但對人體肝、脾、肺有蓄積性致癌作用。臨床上常見的抗氧化劑如維生素c、維生素e與谷胱甘肽等。維生素c主要以清除·oh為主，但需大劑量使用才能達到目的，但同時，大劑量維生素c使用容易導致酸中毒；維生素e主要通過抑制細胞膜上的脂質過氧化來達到抗氧化的目的，但長期是用則有潛在的致突變風險。而臨床還原型谷胱甘肽的產業化壁壘較高，已被日本協和發酵工業株式會社幾乎壟斷全球谷胱甘肽的供應,每公斤高達8000美金。同時，現在國內制藥企業所用的谷胱甘肽制藥原料還不能擺脫進口，谷胱甘肽價格一直居高不下。可見，活性佳、易合成、產量高的新型抗氧化肽已在醫療、食品、化妝品等領域中亟待開發。

小分子超短肽purin-wh1、purin-wh2，具有極強的抗氧化活性，invitro對多種自由基的清除率優于臨床抗氧化制劑——谷胱甘肽，且無細胞毒、無溶血，穩定性高。purin-wh1、purin-wh2一級序列全長只有5-6個氨基酸殘基、分子量小、結構簡單、無蛋白修飾，通過化學合成方法制備，工藝簡便、產量高且純度高，對比臨床還原型谷胱甘肽，生產成本大大降低。因此，本專利中的兩種超短肽purin-wh1、purin-wh2具有十分突出有益的效果。

技術實現要素：

本發明涉及一類抗氧化超短肽，包括兩種抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2及其在制備抗氧化藥物、食品、化妝品添加劑的應用。

本發明的有益效果在于：本發明提供的兩種抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2化學合成的方法得到。其中purin-wh1分子量為544.71da，等電點是8.19，含有5個氨基酸殘基；purin-wh2分子量為641.83da，等電點是8.19，含有6個氨基酸殘基；兩種超短肽均具有極強的抗氧化活性，濃度為3mm時對dpph自由基清除率i％可以達到58.54％、59.89％；對abts^·+正離子自由基清除率i％為96.02％、72.16％。并且兩種抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2分子量小、結構簡單、溶血活性低、細胞毒性極低、制備方法簡單等，因此將其應用在抗氧化藥物、食品或者化妝品添加劑中，可以提高藥物、食品或化妝品添加劑的抗氧化效果，具有很好的應用前景。

附圖說明

圖1是超短肽purin-wh1、purin-wh2對hff-1細胞的毒性圖。

圖中：

具體實施方式

以下結合附圖和技術方案，進一步說明本發明的具體實施方式。

實施例1

兩種抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2的化學合成：

(1)兩種抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2的化學合成方法：根據超短肽氨基酸序列，用自動多肽合成儀(433a,appliedbiosystems)合成二者的全序列，通過hplc反相柱層析脫鹽。

(2)分子量測定采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(maldi-tof)。

(3)純化的兩種抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2用高效液相色譜hplc方法鑒定其純度，分子量測定采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(maldi-tof)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。

兩種抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2是直鏈小肽，其中purin-wh1分子量為544.71da，等電點是8.19，含有5個氨基酸殘基，全序列的一級結構為纈氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-賴氨酸；purin-wh2分子量為641.83da，等電點是8.19，含有6個氨基酸殘基，全序列的一級結構為纈氨酸-纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-賴氨酸；

實施例2

兩種抗氧化超短肽purin-wh1、purin-wh2的抗氧化實驗：

(1)兩種超短肽purin-wh1、purin-wh2抗氧化活性測定

(1.1)dpph自由基清除活性(dpphradicalscavengingassay)

稱取一定量的dpph(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylhydrate，sigma，美國)，用甲醇溶解，配成6×10^-5m的溶液，現配現用。將48μldpph溶液和2μl樣品混合(最終樣品與dpph的質量比為3:1)，室溫下避光靜置30min，于517nm處測定吸光值。空白對照組以樣品溶解介質代替待測樣品。實驗做三個平行，紫外分光光度計調零時使用甲醇。

dpph·清除率(％)＝(ab－aa)/ab×100(ab:空白對照組吸光值；aa:樣品組吸光值)。

(1.2)abts^·+自由基正離子清除活性

abts(3-ethylbezothiazoline-6-sulfonicacid)(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)用pbs緩沖液(ph7.4)配成2mm的abts儲存液。將abts儲存液和70mm過硫酸鉀(k2s2o8)水溶液按體積比250:1混合，于室溫避光放置15-16h。試驗開始前，將abts^·+釋至734nm波長處的吸光值為0.80±0.03。將4μl樣品和96μl上述校正過的abts^·+溶液混合，室溫放置10min后，于734nm波長處檢測反應液的吸光值。空白對照組為溶解樣品所用滅菌去離子水。實驗做三個平行。

abts^·+清除率i(％)＝(ab－aa)/ab×100(ab:空白對照組吸光值；aa:樣品組吸光值)。

表1.超短肽purin-wh1、purin-wh2抗氧化活性

結果如表1所示，超短肽purin-wh1、purin-wh2具有極強的抗氧化活性。在樣品濃度為3mm時，超短肽purin-wh1、purin-wh2對dpph自由基清除率i％可以達到58.54％、59.89％；對abts^·+正離子自由基清除率i％為96.02％、72.16％。與臨床藥物谷胱甘肽具備相當抗氧化活性。故超短肽purin-wh1、purin-wh2將在抗氧化藥品、食品等領域具有優秀的開發潛力。

(2)超短肽purin-wh1、purin-wh2溶血與細胞毒測定

(2.1)溶血性檢測

將采集的健康人血與阿氏液混合抗凝，生理鹽水洗滌2次并重懸成10⁷-10⁸cell/ml的懸浮液。上述稀釋好的紅細胞懸液與溶解于生理鹽水的超短肽mapin-wh2樣品混合，37℃保溫30min，再于1000rpm離心5min，上清液于540nm測吸收值。陰性對照使用生理鹽水，陽性對照使用tritonx-100，溶血百分比按以下公式計算：溶血百分比h％＝a樣品-a陰性對照/a陽性對照×100％。

表2.超短肽purin-wh1、purin-wh2溶血性

結果表明超短肽purin-wh1、purin-wh2濃度高達160μg/ml時的溶血率只有1.66％、1.27％。說明超短肽purin-wh1、purin-wh2不具有溶血性，不易引起人體紅細胞破裂溶解而對人體產生傷害，因此十分利于其在抗氧化藥物、食品或者化妝品添加劑領域進一步的開發應用。

(2.2)超短肽purin-wh1、purin-wh2細胞毒性檢測

用mtt法檢測該組超短肽對人皮膚成纖維細胞hff-1細胞(購于上海細胞庫)毒性。先將成纖維細胞于含有15％胎牛血清以及雙抗(青霉素和鏈霉素各100u/ml)的dmem中培養，待細胞長滿后，用0.25％的胰蛋白酶消化下來，用上述培養基洗兩次，重新懸浮細胞，細胞計數后將細胞懸浮液100μl加入到96孔細胞培養板中，使每孔細胞數達到10⁵個。加入樣品，對照組加入相同體積的滅菌超純水，置37℃，5％co2培養箱內培養24h。培養結束后，96孔細胞培養板每孔加入20μl5mg/mlmtt溶液(用細胞培養pbs緩沖液配制)，繼續培養5h，用注射器吸出孔中液體，每孔加入100μldmso，用移液槍吹打幾次使紫色結晶完全溶解。酶標儀檢測光吸收，測定波長490nm，參考波長630nm。

結果如圖1所示，超短肽purin-wh1、purin-wh2濃度為160μg/ml時的細胞毒性只有15.48％和2.84％，說明超短肽purin-wh1、purin-wh2對人皮膚成纖維細胞的毒性極低，對正常細胞存活率無顯著性影響。對人體正常皮膚細胞不會產生傷害，因此十分利于其在在抗氧化藥物、食品或者化妝品添加劑領域進一步的開發應用。