本發明涉及生物免疫領域,具體地,本發明涉及一種tm4sf1特異性嵌合抗原受體及其應用。
背景技術:
嵌合抗原受體(car)由抗原識別區、跨膜區、胞內信號區構成,一般通過病毒轉導或者電穿孔,使car分子表達在t細胞表面形成car-t細胞。car-t細胞通過胞外抗原識別區識別腫瘤抗原,招募t細胞到腫瘤細胞表面,并通過胞內信號區激活t細胞,使t細胞行使殺傷作用,以殺傷腫瘤細胞,從而達到治療腫瘤的目的。car分子的設計根據胞內信號區的不同經過了四代的發展,其中第一代car分子僅包含cd3ζ;第二代car分子除cd3ζ之外還包含一個共刺激因子,例如cd28,cd137,ox40等;第三代car分子同時包含串聯的兩個共刺激因子;第四代car分子中包含了il-12等能改善腫瘤微環境的細胞因子。car-t通過靶向cd19分子在血液腫瘤方向取得突破性進展,部分研究中有效率達到了90%。但是,car-t在實體瘤領域一直沒有突破,所以迫切需要新的腫瘤靶點,新的car分子設計以促進其在實體瘤領域的應用。
tm4sf1(transmembrane-4lsixfamilymember1)是一個整合在細胞質膜上的糖蛋白,在多種癌癥細胞中高度表達,包括肝細胞癌,非小細胞肺癌等;tm4sf1還高度表達在人癌癥血管的內皮細胞上。tm4sf1同時在多種組織器官中存在微弱的表達。tm4sf1功能在于能夠調控多種腫瘤細胞的運動性和粘附性。由于tm4sf1在多種腫瘤細胞中高表達同時與腫瘤內血管的生成有關,所以是一個潛在的腫瘤治療靶點。
技術實現要素:
本發明的目的在于克服現有技術中的缺陷,提供一種新的通過靶向tm4sf1的car分子,并證明其在實體瘤治療中的潛在應用。具體的說,本發明提供一種tm4sf1特異性嵌合抗原受體(car),這種car分子通過靶向腫瘤細胞表面的tm4sf1蛋白并激活t細胞下游的信號通路,賦予t細胞殺傷帶有tm4sf1靶點腫瘤細胞的能力。
為實現上述目的,本發明采用如下技術方案:
本發明的第一個目的是提供一種tm4sf1特異性嵌合抗原受體,其包括包括胞外識別區、鉸鏈區、跨膜區和胞內信號區;其中,胞外識別區為抗-tm4sf1抗體序列。
為了進一步優化上述tm4sf1特異性嵌合抗原受體,本發明所采取的技術措施還包括:
優選地,所述抗-tm4sf1抗體序列為一種結合tm4sf1的單鏈可變區(scfv)序列,更優選地,在本發明一實施例中,該抗體序列為來源于本領域已公開的tm4sf1單克隆抗體l6,該tm4sf1單克隆抗體l6包括如seqidno.1所示的重鏈可變區(vh)氨基酸序列和如seqidno.2所示的輕鏈可變區(vl)氨基酸序列。
進一步地,根據scfv的構成規則,vh和vl序列通過一段柔性linker氨基酸序列為ggggsggggsggggs連接到一起,形成scfv序列。
優選地,所述鉸鏈區為cd8hinge區域,其氨基酸序列如seqidno.3所示。
優選地,所述跨膜區所述跨膜區為cd8跨膜區或cd28跨膜區中的任一個,其中,所述cd8跨膜區的氨基酸序列如seqidno.4所示,所述cd28跨膜區的氨基酸序列如seqidno.5所示。
優選地,所述胞內信號區包含cd28、4-1bb、cd3ζ中的至少一個;更優選地,所述胞內信號區為cd28、4-1bb和cd3ζ中的至少兩個的串聯。其中,所述cd28的氨基酸序列如seqidno.6所示,所述4-1bb的氨基酸序列如seqidno.7所示,所述cd3ζ的氨基酸序列如seqidno.8所示。
進一步地,所述胞內信號區為t細胞信號傳導激活區域。
優選地,基于以上tm4sf1car分子的結構,本發明所述的該嵌合抗原受體包括l6-28z、l6-bbz、l6-28bbz中的任一個,其結構如圖1所示;其中,所述l6-28z的氨基酸序列如seqidno.9所示,所述l6-bbz的氨基酸序列如seqidno.10所示,所述l6-28bbz的氨基酸序列如seqidno.11所示。可以理解的是,也可根據本領域適用的其他結構來組成tm4sf1嵌合抗原受體。
具體地,在不同的car分子中,其跨膜區可相同,也可不同;其胞內信號區可相同,也可不同。
優選地,在本發明一具體實施例中,若tm4sf1嵌合抗原受體為l6-28z,則其跨膜區為cd8,其胞內信號區為cd28-cd3ζ;若tm4sf1嵌合抗原受體為l6-bbz,則其跨膜區為cd8,其胞內信號區為4-1bb-cd3ζ;若tm4sf1嵌合抗原受體為l6-28bbz,則其跨膜區為cd28,其胞內信號區為cd28-4-1bb-cd3ζ。
本發明的第二個目的是提供一種編碼上述tm4sf1特異性嵌合抗原受體的核酸。
優選地,所述核酸的核苷酸序列包括seqidno.12~seqidno.14所示序列。更具體地說,seqidno.12所示序列的核酸編碼l6-28z,seqidno.13所示序列的核酸編碼l6-bbz,seqidno.14所示序列的核酸編碼l6-28bbz。
car分子的氨基酸序列及其編碼核酸序列如下表所示:
本發明的第三個目的是提供一種含有編碼上述tm4sf1特異性嵌合抗原受體的核酸的重組表達載體。
優選地,所述重組表達載體包括慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒或質粒等;更優選地,在本發明一實施例中,原始重組表達載體為慢病毒。具體的,在該實施例中所使用的載體為慢病毒載體pcdh-ef1-mcs-t2a-copgfp(以下簡寫為pcdh),其圖譜見圖2。在該載體中,car分子的表達由ef1啟動子驅動轉錄表達,帶有gfp標記基因作為慢病毒轉導的標志。car慢病毒載體質粒在輔助包裝質粒pspax2和vsv-g包膜質粒pmd2.g存在的情況下,共轉染hek293t細胞,即可包裝為帶有car分子的慢病毒。
本發明的第四個目的是提供一種含有編碼上述tm4sf1特異性嵌合抗原受體的核酸的重組表達載體的宿主細胞。
優選地,所述宿主細胞為t細胞或含有t細胞的細胞群。
本發明還涉及一種上述宿主細胞的構建方法,其包括重組表達載體的構建步驟、重組表達載體的包裝步驟以及將重組表達載體轉導至宿主細胞的步驟。
最后,本發明還提供一種上述tm4sf1特異性嵌合抗原受體,上述編碼tm4sf1特異性嵌合抗原受體的核酸,上述重組表達載體以及宿主細胞在哺乳動物腫瘤治療中的應用。
優選地,哺乳動物實體腫瘤包括但不限于,腎臟腫瘤、神經母細胞瘤、生殖細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、軟組織肉瘤、肝臟腫瘤、胸腺瘤、肺母細胞瘤、胰母細胞瘤、血管瘤等。
更具體的說,上述應用為一種tm4sf1car-t細胞,其通過慢病毒介導的轉導使得t細胞帶有tm4sf1car,從而賦予了t細胞識別tm4sf1分子的能力,并靶向tm4sf1陽性的哺乳動物實體腫瘤。
在一個實施例中,將tm4sf1car-t細胞與表達tm4sf1的腫瘤細胞系calu-3,calu-6-tm4sf1共孵育,結果顯示tm4sf1car-t細胞能夠在靶細胞的刺激下大量的產生ifn-γ;但是卻不能在與tm4sf1陰性的細胞系calu-6共孵育時產生ifn-γ;同時非tm4sf1靶向的car-t細胞19-28bbz不能夠在tm4sf1陽性細胞刺激下產生ifn-γ。該實施例說明了tm4sf1car-t細胞的良好的特異性靶向性,能夠在tm4sf1刺激下將t細胞殺傷功能激活。
在另一實施例中,證明了在一定的效靶比(car-t細胞:靶細胞)下,tm4sf1car-t細胞能夠有效的殺傷tm4sf1陽性的腫瘤細胞;但是非tm4sf1靶向的car-t細胞19-28bbz不能夠有效殺傷靶細胞。該實施例說明了tm4sf1car-t能夠在體外能夠有效的裂解tm4sf1陽性的腫瘤細胞。
在另一實施例中,基于tm4sf1陽性肺癌細胞系calu-3構建了nod-scid免疫缺陷鼠皮下移植腫瘤模型。使用本發明tm4sf1car-t細胞l6-28bbz治療該荷瘤小鼠,結果說明,tm4sf1car-t細胞可以有效清除tm4sf1陽性腫瘤細胞,并且治療組的小鼠在30天全部存活;但是對照19-28bbz組中腫瘤不斷長大,并且在30天時僅有20%小鼠存活下來。
與現有技術相比,本發明具有以下有益效果:
當前car-t技術在實體瘤領域的應用并不成功,一個很重要的原因就是缺少合適的實體瘤靶點。本發明提供了一個新的通過car-t技術靶向實體瘤的靶點tm4sf1,該基因在正常組織細胞中不表達或僅少量表達,而在肺癌,肝癌等實體腫瘤組織以及腫瘤血管內皮細胞中高度表達,特別是在腫瘤干細胞上高表達。本發明所述的tm4sf1car分子可以通過修飾t細胞,并使特異性car-t細胞高效特異的治療tm4sf1陽性實體腫瘤。
附圖說明
圖1為tm4sf1特異性嵌合抗原受體(car)分子結構的說明示意圖;
圖2為慢病毒載體pcdh結構的說明示意圖;
圖3為tm4sf1car分子酶切鑒定電泳的結果示意圖;
圖4為流式細胞術檢測tm4sf1轉導t細胞轉導效率的結果示意圖;
圖5為不同腫瘤細胞系中tm4sf1表達水平的示意圖;
圖6為tm4sf1car-t細胞ifn-γ分泌情況的示意圖;
圖7a和圖7b為tm4sf1car-t細胞體外殺傷tm4sf1靶細胞的結果示意圖;
圖8a和圖8b為tm4sf1car-t細胞小鼠體內殺傷tm4sf1陽性移植腫瘤的結果示意圖。
具體實施方式
本發明提供一種tm4sf1特異性嵌合抗原受體(即靶向tm4sf1的car分子),其包含胞外識別區、鉸鏈區、跨膜區和胞內信號區,其中胞外識別區為抗-tm4sf1抗體序列(scfv序列,seqidno.1以及seqidno.2),鉸鏈區為cd8hinge區域(seqidno.3),跨膜區為cd8跨膜區(seqidno.4)或cd28跨膜區(seqidno.5)中的任一個,胞內信號區包含cd28(seqidno.6)、4-1bb(seqidno.7)、cd3ζ(seqidno.8)中的至少一個。
本發明的嵌合抗原受體具體為l6-28z(seqidno.9)、l6-bbz(seqidno.10)和l6-28bbz(seqidno.11),其分別由seqidno.12~seqidno.14所示序列的核酸編碼。
本發明在實施例一提供了構建上述car分子到慢病毒載體pcdh中的方法。實施例二中提供了將car分子包裝成為慢病毒,轉導t細胞,測定轉染效率的方式。實施例三提供了構建tm4sf1靶細胞,以及car-t細胞殺傷tm4sf1靶細胞的能力。實施例四提供了car-t細胞在小鼠模型中抑制tm4sf1陽性腫瘤生長的能力。
下面結合附圖和實施例,對本發明的具體實施方式作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發明的技術方案,而不能以此來限制本發明的保護范圍。
實施例一
本實施例提供了構建上述car分子到慢病毒載體pcdh中的方法。
通過本實施例構建tm4sf1car分子,根據car分子信號區域的不同,將其分為了l6-28z,l6-bbz,l6-28bbz三種:其中l6-28z中采用的胞內信號區為cd28-cd3ζ;l6-bbz中采用的胞內信號區為4-1bb-cd3ζ;而在l6-28bbz中所采用的胞內信號區為cd28-4-1bb-cd3ζ,其分子結構模式圖如圖1所示。通過常規分子克隆手段將如上car分子構建到了慢病毒載體pcdh中,慢病毒載體pcdh的結構如圖2所示。
l6-28bbz載體構建:首先化學合成了l6-28bbz核酸片段至puc57載體中(上海奧吉生物有限公司),使用noti/xbai雙酶切得到l6-28bbz片段。noti/xbai雙酶切慢病毒載體pcdh,電泳后凝膠回收7kb大小左右dna片段。將l6-28bbz與載體pcdh使用t4dna連接酶,室溫連接1-2小時,隨后轉化stbl3感受態細胞。第二天接種單菌落至lb擴增培養,并提取質粒。使用ncoi酶切驗證所得質粒是否正確,酶切結果見圖3,第二泳道。將正確質粒送測序,進一步驗證其序列是否正確。留下正確的質粒命名為pcdh-l6-28bbz進行下一步實驗。
l6-28z載體構建:首先化學合成了l6-28z的鉸鏈區、跨膜區和胞內區序列puc57-28z(上海奧吉生物有限公司合成)。將puc57-28z和pcdh-l6-28bbz分別進行bamhi/noti雙酶切,并電泳回收。將pcdh-l6-28bbz與28z用t4dna連接酶,室溫連接1-2小時,隨后轉化stbl3感受態細胞。第二天接種單菌落至lb擴增培養,并提取質粒。使用ncoi酶切驗證所得質粒是否正確,酶切結果見圖3,第三泳道。將正確質粒送測序,進一步驗證其序列是否正確。留下正確的質粒命名為pcdh-l6-28z進行下一步實驗。
l6-bbz載體構建:使用引物bbf(5’-aaacggggcagaaagaaactcctgt-3’,seqidno.17)和cd3zr(5’-gcgagggggcagggcctgcatgtga-3’,seqidno.18),以l6-28bbz為模板進行pcr擴增bbz信號區序列;用引物carf(5’-atggccttaccagtgaccgccttgc-3’,seqidno.19)和cd8tmr(5’-gcagtaaagggtgataaccagtgac-3’,seqidno.20),以l6-28z為模板擴增l6scfv,cd8鉸鏈區和跨膜區序列。之后進行搭橋pcr將前后兩部分序列拼接為完整l6-bbz,引物為carf2(5’-ctagctagcatggccttaccagtgaccgccttgc-3’,seqidno.21)和cd3zr2(5’-cgggatccgcgagggggcagggcctgcatgtga-3’,seqidno.22)兩者分別使用并分別進行noti/xbai雙酶切,并電泳回收。并用t4dna連接酶,室溫連接1-2小時,隨后轉化stbl3感受態細胞。第二天接種單菌落至lb擴增培養,并提取質粒。使用ncoi酶切驗證所得質粒是否正確,酶切結果見圖3,第四泳道。將正確質粒送測序,進一步驗證其序列是否正確。留下正確的質粒命名為pcdh-l6-bbz進行下一步實驗。
實施例二
本實施例為tm4sf1car-t細胞的構建。
car慢病毒的包裝:首先使用qiagen無內毒素大提質粒試劑盒分別提取實施例一構建的慢病毒質粒pcdh-l6-28z、pcdh-l6-bbz、pcdh-l6-28bbz、pcdh-19-28bbz(非靶向tm4sf1對照car分子質粒)以及慢病毒系統輔助包裝質粒pmd2.g和pspax2。在轉染前一天將2.5×10e7293t鋪至t75培養瓶中。轉染前1小時將293t細胞培養基換為10ml無血清培養基。使用磷酸鈣沉淀法將質粒共轉染到293t細胞中,轉染后24小時將細胞培養基換為15ml完全培養基dmem+10%fbs。轉染后48小時收取細胞上清,并加入15ml新鮮完全培養基。72小時再次收取細胞上清,棄去細胞。將收取的細胞上清使用0.45um濾膜過濾,之后5000g離心1min以去除雜質。隨后40000g離心2小時,沉淀病毒,使用0.1mlpbs重懸病毒。放置-80℃凍存備用。
t細胞轉導:采用常規方法采血并分離pbmc,在含有5%人ab血清和300iu/ml白細胞介素-2的x-vivo15培養基中,并用抗cd3/cd28單克隆抗體刺激。開始培養以后48小時,將活化t細胞懸浮于含有硫酸魚精蛋白和300iu/il-2的x-vivo15培養基中,加入相應慢病毒(l6-28z,l6-bbz,l6-28bbz或者19-28bbz)。然后將t細胞在37℃培養3小時。然后用rpmi培養基+10%胎牛血清和il-2將上清液稀釋2倍,將t細胞在稀釋的上清液中過夜培養,然后返回x-vivo15培養基(含有il-2,5%人ab血清)中培養。72小時后利用流式細胞術檢測gfp表達以檢測car分子轉導效率。如圖4所示,觀察到l6-28z,l6-bbz,l6-28bbz,19-28bbz在t細胞上陽性率大約在60%-70%,19-28bbz作為tm4sf1car-t細胞的非靶向對照car-t細胞。
實施例三
本實施例為tm4sf1car-t細胞活性的測定。
tm4sf1car-t靶細胞的鑒定和構建:使用qpcr檢測了calu-6,calu-3等肺癌細胞系上tm4sf1的表達,如圖5所示,calu-3細胞系高表達tm4sf1基因,而calu-6幾乎不表達tm4sf1基因。使用編碼tm4sf1基因的慢病毒載體,利用嘌呤霉素篩選,構建得到高表達tm4sf1基因的calu-6細胞系。calu-6-tm4sf1細胞系的tm4sf1表達水平見圖5。根據圖5結果可知,calu-3,calu-6-tm4sf1細胞系為tm4sf1陽性表達,而calu-6細胞系tm4sf1陰性。
ifn-γ分泌實驗:在96孔板中將l6-28z,l6-bbz,l6-28bbz,19-28bbz四種car-t細胞(效應細胞)與靶細胞以5:1效靶比混合。在37℃培養24小時,之后使用標準elisa方法檢測ifn-γ的表達。結果如圖6所示,當三種tm4sf1靶向的car-t細胞與calu-3或者calu-6-tm4sf1共培養時,car-t細胞會大量分泌ifn-γ,并且l6-28bbz的分泌量高于l6-28z和l6-28bbz,說明第三代car結構的l6-28bbz靶向tm4sf1的活性優于第二代car結構的l6-28z以及l6-28bbz。而tm4sf1的三種car分子與低表達tm4sf1的calu-6細胞共孵育是不能大量產生ifn-γ,說明本發明所構建car-t細胞具有良好的靶向特異性。而作為對照,非靶向tm4sf1的19-28bbzcar-t細胞并未產生大量ifn-γ,也說明了本發明所構建car-t細胞具有良好的靶向特異性。
實施例四
本實施例驗證tm4sf1car-t細胞體殺傷tm4sf1靶細胞的能力。
用5-羧基熒光素琥珀酰亞胺基(cfse)將靶細胞染色,分別取實施例二中的car-t細胞與tm4sf1陽性的calu-3,calu-6-tm4sf1以如下的效靶比混合共培養:0.5:1,1:1,2:1,5:1。經過4小時共培養后,將細胞用pi試劑盒染色,同時設置對照組,對照組中加入靶細胞但同時未加入效應car-t細胞。使用流式細胞術對細胞殺傷進行檢測。結果見圖7a和圖7b。tm4sf1car-t細胞能夠有效殺傷calu-3以及calu-6-tm4sf1細胞,但是對照的19-28bbzcar-t細胞不能夠有效殺傷這兩種靶細胞。第三代car結構的l6-28bbz殺傷tm4sf1陽性肺癌細胞的活性優于第二代car結構的l6-28z以及l6-28bbz。
本實施例說明l6-28bbz,l6-28z,l6-bbz三種car分子構建的car-t細胞能夠有效殺傷tm4sf1陽性的肺癌細胞。
實施例五
本實施例驗證car-t細胞在小鼠模型中抑制tm4sf1陽性腫瘤生長的能力。
使用6周齡nod-scid免疫缺陷鼠,皮下注射5×106calu-3肺癌細胞系,允許腫瘤生長5-15天,用測徑器測量腫瘤大小,以腫瘤最長長度乘最長長度垂直方向的長度得到一mm2為單位的腫瘤大小。當腫瘤大小達到20-30mm2時,通過靜脈注射5×106的tm4sf1car-t細胞l6-28bbz或者19-28bbz,之后每3天測量腫瘤大小,當腫瘤直徑達到1.5cm時,處死小鼠。
本實施例結果如圖8a和圖8b所示,注射l6-28bbzcar-t細胞6天之后腫瘤開始變小,到15-18天已經基本完全清楚腫瘤,并且所有小鼠均存活到第30天。然而對照非靶向tm4sf1的19-28bbzcar-t細胞不能夠使腫瘤細胞減小,在30天時小鼠的存活率僅為20%。
本實施例說明,本發明的靶向tm4sf1的car-t細胞能夠有效清除小鼠tm4sf1陽性腫瘤移植瘤模型中的腫瘤。
以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述,但其只作為范例,本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言,任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此,在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改,都應涵蓋在本發明的范圍內。
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