白蟻溶纖維類芽孢桿菌NP1、木聚糖酶PtXyn1及其編碼基因和應用的制作方法

本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種白蟻溶纖維類芽孢桿菌np1、木聚糖酶ptxyn1及其編碼基因和應用。
背景技術：
：木質纖維素是自然界最豐富的生物質資源，對其進行綜合利用對人類社會的可持續發展具有重要意義。在自然界能降解木質纖維素的微生物主要是一些真菌和細菌，對這些微生物資源的挖掘將有助于對生物質的開發與利用。木質纖維素由纖維素、半纖維素和木質素這三種高分子化合物組成，在自然界能穩定存在。降解木質纖維素需要一系列復雜酶系中多種酶的相互作用。能降解木質纖維素的微生物均含有豐富的纖維素酶、半纖維素酶等，因此，從自然環境中篩選纖維素降解菌，將具有良好的開發與應用前景。木聚糖在半纖維素中含量豐富，結構要比纖維素復雜，完全降解木聚糖需要多種水解酶(即木聚糖降解酶系統)的協同作用。木聚糖酶(e.c3.2.1.8)是一類以內切方式降解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷鍵的酶系。內切-β-1,4-木聚糖酶是木聚糖降解的主要作用酶，它與β-木糖苷酶共同作用可以使木聚糖降解為木糖或者木聚寡糖。近年來，木聚糖酶在食品、紡織、飼料、能源工業中都顯示了廣闊的應用前景。在仔豬飼料中添加含有木聚糖酶的復合酶制劑能夠提高干物質、粗蛋白質粗纖維等的表觀消化率以及降低糞便中大腸桿菌數和腹瀉率。在造紙工業中，應用半纖維素酶進行預漂、助漂，可以降低化學藥品的使用量，已經成為一種較為成熟的工藝技術。在果汁生產過程中，采用木聚糖酶、纖維素酶和果膠酶共同處理能夠降低提取液的粘度，有利于過濾和濃縮。但在實際的生產以及應用過程中，需要一些在中溫和高溫條件下穩定并且能夠較好地發揮酶活作用的木聚糖酶。因此，獲得活性高且在中溫和高溫穩定的木聚糖酶對于木聚糖酶的工業應用具有重要的實踐價值。技術實現要素：本發明目的在于提供一株具有多種纖維素降解酶的白蟻溶纖維類芽孢桿菌np1。本發明的第二個目的在于提供一種在中溫和高溫條件下酶活活性高且穩定的木聚糖酶ptxyn1。本發明的另一個目的在于提供一種編碼所述木聚糖酶ptxyn1的基因。本發明的又一個目的在于提供一種包含所述編碼木聚糖酶ptxyn1基因的重組載體、轉化子、重組病毒、重組菌和轉基因細胞系。本發明的再一個目的在于提供所述木聚糖酶ptxyn1在降解木聚糖方面的應用。為實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案為：一株白蟻溶纖維類芽孢桿菌，該菌株命名為類芽孢桿菌np1(paenibacillustermiticellulosilyticusnp1)，已于2016年2月25日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏單位地址：中國，武漢，武漢大學，保藏號為cctccno：m2016072。上述類芽孢桿菌np1的菌落形態及生理生化特性為：類芽孢桿菌np1菌落呈圓形、濕潤、光滑，菌體呈桿狀，菌體大小約0.3-0.4×1.7-3.0μm；革蘭氏染色陰性，好氧，無鞭毛或周毛，不具有運動性，芽孢近端生(圖1)；該菌的生長溫度范圍為5～50℃，生長ph值范圍為4.5～9.5，生長鹽度范圍為0％～1.75％；能利用l-阿拉伯糖、d-核糖、d-木糖、d-半乳糖、d-葡萄糖、d-甘露糖、甲基-β-d-吡喃木糖苷、纖維二糖、麥芽糖、七葉靈等為碳源生長；具有酯酶(c4)、白氨酸芳胺酶、萘酚-as-bi-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等酶的活性；能同化精氨酸、尿素、七葉靈、對硝基-β-d-甲基半乳糖等，具有精氨酸雙水解酶、脲酶、β-葡萄糖苷酶等酶的活性；菌體脂肪酸主要為anteiso-c15:0和iso-c16:0，呼吸醌主要類型為mk-7，細胞壁含有內消旋二氨基庚二酸(dap)。上述類芽孢桿菌np1的基因序列特征為：類芽孢桿菌np1基因組大小約為6.1mb，基因組dnag+c含量為54.41mol％，具有5329個編碼基因；該菌基因組中含有200多個與木質纖維素降解相關的酶基因，包括屬于63個糖基水解酶(gh)家族的112個酶基因，屬于22個家族的72個編碼碳水化合物結合結構域的基因，10個內切葡聚糖酶基因，3個外切葡聚糖酶基因，9個葡萄糖苷酶基因，12個木聚糖酶基因和5個β-木糖苷酶基因等。系統發育分析表明該菌屬于類芽孢桿菌屬，與其最相近的已經鑒定菌株為解凝乳類芽孢桿菌jcm12163t，兩株菌16srrna基因的相似性為97％(圖2)。一種來自于類芽孢桿菌np1的木聚糖酶，命名為木聚糖酶ptxyn1，其特征在于，所述木聚糖酶ptxyn1的氨基酸序列如seqidno.2所示。一種編碼上述木聚糖酶ptxyn1的基因，所述編碼基因為任何編碼上述木聚糖酶ptxyn1的dna序列。上述方案中，所述編碼木聚糖酶ptxyn1的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。一種包含上述編碼木聚糖酶ptxyn1基因的重組載體、轉化子、重組病毒、重組菌和轉基因細胞系。上述木聚糖酶ptxyn1在降解木聚糖方面的應用。本發明的有益效果如下：本發明篩選獲得了一株具有多種纖維素降解酶的類芽孢桿菌np1，從類芽孢桿菌np1的基因中篩選獲得了木聚糖酶ptxyn1的編碼基因，通過構建重組質粒獲得重組菌、編碼基因表達后獲得了木聚糖酶ptxyn1；本發明所述木聚糖酶ptxyn1在中溫和高溫條件下具有酶活活性高且穩定的優點，在木聚糖酶的工業應用具有重要的實踐價值，在食品、飼料等行業中具有廣闊的應用前景。附圖說明圖1為類芽孢桿菌np1的形態掃描電鏡圖片，左：類芽孢桿菌np1的掃描電鏡圖；右：類芽孢桿菌np1的芽孢染色。圖2為類芽孢桿菌np1的系統發育分析圖。圖3為重組表達質粒pet30a(+)-ptxyn1構建過程圖。圖4為重組木聚糖酶ptxyn1的sds-page分析，其中m：蛋白marker；1：空載對照；2：未誘導對照；3：誘導20小時蛋白樣品；4：純化的蛋白。圖5為木聚糖酶ptxyn1的最適反應ph值(a)和ph穩定性(b)。圖6為木聚糖酶ptxyn1最適反應溫度(a)和溫度穩定性(b)。具體實施方式為了更好地理解本發明，下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明的內容不僅僅局限于下面的實施例。實施例1類芽孢桿菌np1(cctccm2016072)的研究本實驗室從象白蟻腸道分離培養獲得了一株白蟻溶纖維類芽孢桿菌，命名為類芽孢桿菌np1。(一)對類芽孢桿菌np1的形態學特征和生長特性作如下研究：類芽孢桿菌np1在tsb培養基(美國bd公司，ph值7.2)中30℃恒溫培養。接種到固體培養基培養一天，在平板上形成圓形、濕潤、光滑的菌落。菌細胞大小約0.3-0.4×1.7-3.0μm，菌體呈桿狀，為革蘭氏陰性菌，好氧，芽孢近端生(見圖1)，沒有運動性。以1％的接種量用tsb液體培養基培養np1，測得該菌生長溫度范圍為5℃～50℃，最適生長溫度為30℃；生長ph范圍為4.5～9.5，最適生長ph為7.0；在0％～1.75％的鹽度范圍內可以生長，在鹽度大于2％的情況下表現為不生長。(二)對類芽孢桿菌np1的生理生化特性作如下研究：(1)碳源利用：應用api50ch試劑條研究類芽孢桿菌np1對碳源利用的特性。結果表明，該菌可以利用l-阿拉伯糖、d-核糖、d-木糖、d-半乳糖、d-葡萄糖、d-甘露糖、甲基-β-d-吡喃木糖苷、纖維二糖、麥芽糖、七葉靈等底物代謝產酸。(2)細胞內酶活性與同化作用：應用apizym和api20ne試劑條研究類芽孢桿菌np1的細胞內酶活性和同化作用。結果表明，該菌具有酯酶(c4)、白氨酸芳胺酶、萘酚-as-bi-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等酶的活性。能夠同化精氨酸、尿素、七葉靈、對硝基-β-d-甲基半乳糖等，具有精氨酸雙水解酶、脲酶、β-葡萄糖苷酶等酶的活性。(3)氧化酶、觸酶等其它酶活性：以類芽孢桿菌np1菌細胞作用等體積的1％對-氨基二甲基苯胺鹽酸鹽水溶液和1％α-奈酚乙醇溶液，根據顏色反應說明該菌氧化酶為陰性。以菌細胞作用5％h2o2產生氣泡，說明其觸酶為陽性。類芽孢桿菌np1能將硫代硫酸鈉還原為亞硫酸鹽并釋放出h2s。此外，該菌不能水解酪素，酯酶和淀粉水解酶均為陰性。(4)菌體脂肪酸、呼吸琨等的分析：提取菌株np1的脂肪酸后經氣相色譜儀檢測分析得到菌株np1脂肪酸主要組分為anteiso-c15:0和iso-c16:0。提取菌株np1的呼吸琨，經hplc分析發現，該菌株的呼吸醌主要類型為mk-7。此外，其細胞壁含有內消旋二氨基庚二酸(dap)。(三)對類芽孢桿菌np1基因組的研究以tsb液體培養基培養類芽孢桿菌np1，收集菌細胞，利用細菌基因組dna提取試劑盒提取菌株np1的基因組dna。使用三代測序平臺對樣品進行測序。對測序結果進行分析，結果表明，類芽孢桿菌np1基因組大小約為6.1mb，具有5329個編碼基因。基因組中含有200多個與木質纖維素降解相關的酶基因，包括10個內切葡聚糖酶基因，3個外切葡聚糖酶基因，9個葡萄糖苷酶基因，12個木聚糖酶基因和5個β-木糖苷酶基因等。系統發育分析表明該菌屬于類芽孢桿菌屬，與其最相近的已經鑒定菌株為解凝乳類芽孢桿菌jcm12163t，兩株菌16srrna基因的相似性為97％。類芽孢桿菌np1，已于2016年2月25日保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏單位地址：中國，武漢，武漢大學，保藏號為m2016072。實施例2木聚糖酶ptxyn1及其編碼基因(一)木聚糖酶ptxyn1的制備(1)pcr擴增獲得木聚糖酶ptxyn1的編碼基因：以類芽孢桿菌np1的基因組dna為模板，用引物30a-ptxyn1-f、30a-ptxyn1-r(引物序列見下表1)進行pcr擴增，得到pcr擴增產物。表1用于克隆木聚糖酶ptxyn1的引物引物名稱引物序列(5’-3’)30a-ptxyn1-fcccatatgcaccatcatcatcatcatgcaacgacgatcacgtccaatc30a-ptxyn1-rccctcgaggttaatttccaaataatcgagg(2)酶切、連接：用xhoi和ndei雙酶切pcr擴增產物，與預先使用xhoi和ndei雙酶切的pet-30a(+)(購自novagen，產品目錄號為69909-3)通過t4dna連接酶進行連接，構建得到重組表達載體，再轉化e.colidh5α感受態細胞，轉化步驟如下：a)取3μl連接產物于50μl感受態細胞中，輕彈混勻，冰上放置30min；b)42℃準確熱激90sec，不要晃動，立即置于冰上；c)加入800μllb(或soc)培養基，200rpm，37℃振蕩培養1～1.5小時；d)4000rpm離心3min，棄適量上清后，輕輕懸浮菌體，取100μl菌液均勻涂布至含50μg/mlkana的瓊脂平板上，待菌液充分吸收后，倒置平皿37℃培養12～16h。(3)陽性重組子的篩選與鑒定：挑取單菌落使用ptxyn1基因引物進行pcr擴增，驗證含有正向插入目的基因片段的重組子，挑選驗證成功的菌落進行擴大培養和提取質粒，進行雙酶切及測序驗證，測序用引物為t7promoterprimer(5’-taatacgactcactataggg-3’)和t7terminatorprimer(5’-gctagttattgctcagcgg-3’)，獲得的序列(即ptxyn1編碼基因)如序列表中序列1所示。重組表達質粒pet30a(+)-ptxyn1構建過程如圖3所示，以類芽孢桿菌np1的基因組dna為模板進行pcr擴增，得到目的基因片段。將基因ptxyn1連接表達載體pet30a(+)，轉化大腸桿菌dh5α感受態細胞，并通過菌落pcr擴增、雙酶切驗證載體是否構建成功。(4)重組木聚糖酶ptxyn1的誘導表達：將重組質粒pet30a(+)-ptxyn1轉化到e.colibl21(de3)中，獲得重組菌株。挑取重組菌株單菌落，接種到含有kana(50μg/ml)的5mllb培養基中，200r/min，37℃恒溫振蕩器過夜培養進行活化。將活化后的菌液按1％的轉接量，轉接到含kana(50μg/ml)的lb液體培養基中，200r/min，37℃培養3～4h，使od600＝0.6，加入iptg至終濃度為0.2mmol/l，16℃誘導。同時，以未誘導的重組質粒pet30a(+)-ptxyn1和含有空載質粒的e.colibl21(de3)作為對照。誘導表達結束后，取1ml菌液，10,000rpm離心1min，去上清，菌體沉淀中加入50μl去離子水重懸菌體，再加入50μl2×sds-page上樣緩沖液，混勻后煮沸10分鐘，10,000rpm離心5min，冷卻后上樣，取20μl進行sds-page凝膠電泳，凝膠電泳采用5％的濃縮膠，12％的分離膠。(二)木聚糖酶ptxyn1的純化1.粗酶液的制備：大量誘導表達目的蛋白后，離心收集菌體，溶于適量的bufferb中，均勻重懸菌體后低溫高壓細胞破碎儀破碎細胞。所得破碎液于4℃、10000g，離心30min，所得上清液經0.45μm濾膜進行過濾，獲得粗酶液。2.目的蛋白純化采用鎳柱親和層析進行純化，用hispurnintaresin(thermo)純化上清，上清液用0.45μm濾器過濾。利用ni-agarose-resin蛋白純化柱對帶有his標簽的目的蛋白進行分離純化，步驟如下：a將1mlni-agarose-resin填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10min，流出柱中的乙醇后加入10倍柱體積的無菌去離子水將乙醇沖洗干凈；b.加入10倍柱體積的bufferb(bindingbuffer)平衡柱子；c.將粗酶液加入柱子中，4℃搖晃結合2h；d.用10倍柱體積的bufferb沖洗柱子后依次加入咪唑濃度逐漸升高(5-500mm)的洗脫buffer，收集洗脫峰；e.洗脫后，使用5倍柱體積的bufferb和5倍柱體積的無菌去離子水洗滌柱子；f.最后加入5倍柱體積的20％乙醇，2-8℃保存鎳柱。所述bufferb(bindingbuffer，ph8.0)：50mmnah2po4，300mmnacl。3.重組酶ptxyn1的檢測及濃縮：利用sds-page凝膠電泳法檢測目的蛋白的純化效果。純化后的目的蛋白使用截留10kda分子量的超濾管濃縮，并且使用檢測酶活所用的buffer置換含有咪唑的buffer，以去除蛋白溶液中的咪唑。將重組表達質粒pet30a(+)-ptxyn1經過0.2mmiptg誘導后，產生了一條分子量約為40kda的重組蛋白，與理論預測值相符合，如圖4所示，經ni-nta-sefinose純化后sds-page電泳顯示條帶單一(圖4泳道4)，得到具有電泳純的目的蛋白，可以用來進行后續的酶學特性分析。(三)木聚糖酶tmxyn1的特性研究1.重組酶ptxyn1活性檢測：采用dns法測定木聚糖酶酶活，取50μl適當稀釋的酶液，加入100μl1％木聚糖(sigmabeechwoodxylan)溶液，55℃溫育5min，加入200μldns溶液后，沸水浴10min，冷卻到室溫后，加入1ml去離子水，540nm處測定吸光值。以1mg/ml的木糖為標準樣品繪制標準曲線，根據標準曲線計算所得還原糖的量。酶活定義：每分鐘水解木聚糖產生1μmol木糖的酶量定義為一個酶活單位。1％木聚糖(sigmabeechwoodxylan)溶液的組成：1g木聚糖溶于100ml0.1m乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph6.0)中，置于沸水浴中加熱5min，將所得木聚糖懸濁液10,000×g離心5分鐘，棄沉淀后得木聚糖溶液4℃保存備用。dns溶液的組成：稱取185g酒石酸鉀鈉加到500ml去離子水中，在磁力攪拌器上攪拌至完全溶解后，加20.96gnaoh，然后再加入6.3g3,5-二硝基水楊酸(避光)，易形成結塊，不斷攪拌，顏色會逐漸變得深紅。完全溶解后再加5g無水亞硫酸鈉，5g結晶酚(結晶酚事先放到55℃水浴鍋中溶解，通過密度計算加入4.673ml)，按次序加。棕色瓶室溫貯藏，放置一周以上后才可用。2.最適反應ph和ph耐受性測定不同ph范圍緩沖液：乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph3.0-5.0)，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph5.0-7.0)，tris-hcl緩沖液(ph7.0-9.0)，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(ph9.0-11.0)，以0.5為一梯度。在55℃測定重組酶ptxyn1在不同ph范圍的酶活，確定其最適反應ph值；將酶液與ph3.0～11.0的緩沖液按1:10的比例與混合，4℃冰箱放置2d，在最適反應ph值下分別測定重組酶活力，確定其ph耐受性。在不同ph條件下檢測重組酶ptxyn1的活性,發現該酶最適反應ph為6.0(圖5a)。將重組酶稀釋于不同ph的緩沖液中，4℃放置2d，然后測定重組酶的殘余酶活，測得的重組酶ptxyn1ph耐受性曲線表明，在ph7.5時重組酶耐受性最好，并且在整個ph范圍內處理后的酶活力均保持在60％以上，說明該重組酶具有很寬的ph耐受性。但在ph7.0～11.0范圍內的殘余酶活力高于酸性條件，說明該酶對堿性條件的耐受性更強(圖5b)。3.最適反應溫度和溫度穩定性測定在其最適反應ph值條件下檢測其在不同溫度范圍(25-65℃)的酶活，確定重組酶ptxyn1最適反應溫度；將重組蛋白溶液分別在45、50、55、60℃下保溫不同時間，保溫完成后迅速置于冰上。55℃下反應10min測定殘余酶活力，確定其熱穩定性。以未進行熱處理的木聚糖酶活性作為對照，殘余酶活與對照酶活的百分比，作為相對酶活。測定結果表明，重組酶ptxyn1最適反應溫度為55℃，在25～65℃溫度范圍內酶活力保持在40％以上，說明該酶具有較寬的酶活力溫度范圍(圖6a)。分別在45、50、55、60℃下保溫不同時間，55℃下測定殘余酶活力，以確定其熱穩定性。結果表明該酶在低于45℃時，溫度穩定性良好，45℃溫浴30min后，對酶活性幾乎沒有影響。在50℃保溫30min后保持70％左右的酶活(圖6b)。4.酶促反應動力學參數的測定采用lineweaver-burk雙倒數法計算出米氏常數km值和最大反應速率vmax值。用0.2mol/l檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph6.0)配制成1-10mg/ml濃度的山毛櫸木聚糖底物，將等量的蛋白酶液與不同濃度的底物在最適反應條件下反應10min，分別計算出酶活力，即反應速度v。以1/[s]為橫坐標、1/v為縱坐標作圖，得到一條直線，其橫軸截距為-1/km，縱軸截距為1/vmax(最大反應速度)，斜率為km/vmax，由此求出km和vmax。測定結果顯示，重組酶ptxyn1的米氏常數km值和最大反應速率vmax的測定采用lineweaver-burk作圖法。重組酶ptxyn1對山毛櫸木聚糖的km和vmax分別為6.2mg/ml和3765.1μmolmg-1min-1。5.底物特異性的測定在酶促反應最適反應條件下，測定重組蛋白以山毛櫸木聚糖(beechwoodxylan1％)、玉米芯木聚糖(corncobxylan，1％)、羧甲基纖維素鈉(cmc-na，1％)、微晶纖維素(avicelph-101，1％)、4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg，10mm)，4-硝基苯基-β-d-吡喃纖維二糖苷(pnpc，10mm)、4-硝基苯基-β-d-吡喃木糖苷(pnpx、10mm)為底物時的酶活力，以上底物均由0.2mol/l檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ph6.0)配制。分別以dns法和pnp法檢測重組木聚糖酶ptxyn1對不同底物的酶活反應，結果表明重組木聚糖酶ptxyn1只對山毛櫸木聚糖有活性，測得其比活力為2118.7u/mg。對其他底物均沒有表現出活性。表明重組木聚糖酶ptxyn1具有較強的底物專一性。顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的實例，而并非對實施方式的限制。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動仍處于本發明創造的保護范圍之內。序列表<110>華中師范大學<120>白蟻溶纖維類芽孢桿菌np1、木聚糖酶ptxyn1及其編碼基因和應用<160>2<210>1<211>1095bp<212>dna<213>類芽孢桿菌np1（paenibacillustermiticellulosilyticusnp1）＜400＞1atgaaagtaaccaaatcgaaattattgttggcgttagtgcttagctttacgcttgctatg60cctgtaggagtcgcgaatgcggcaacgacgatcacgtccaatcaaacgggtacgcaagac120ggctacgactacgagctgtggaaagattccggcacgacgagcatgacgctcaacagcggc180ggcgcgttcagcgcaacgtggagcaatattaataacgccttgttccgtaagggcaaaaag240ttcaatgccacccaaacgcaccagcaaatcggcaacatctccatcaattacgctgcaacg300ttcaatccgggcggcaactcttatctgacggtatacggctggacgaagagctcgctcatc360gagtactacatcatggataactggggaacgtaccgcccgtccggcacgaataaaggttcg420ttctcggttgacggcggcacgtacgatatttacgagacgacccgggttaaccagccgtct480atcgaaggtacggcgacgttcaaacaatattggagcatccggacggccaaacgttcgagc540ggtacgatctcggtaagcgagcacttcaagaagtgggaaagcctgggcatgtcgctcggc600aaactgtacgaagtagcgcttacggttgagggctatcaaagcagcggcaatgcgaacgtg660acgacgaacgtgctgacgatcggcggaagcggaagcggcggcggcggcggtacaacgacc720cctccaagctcgggcgctacgaaagtggaagcggagagcatgtcgaagagcggccaatac780acgggcaacatcagctcgccgttctcgggcgttgcactgtacgcgaataacgatctggtc840aaatttacgcaaaacttcacgtccggcacgcacagcttctcgcttcgcggcgcttcgaac900aactccagcacggctagagtcgatctgaaaatcggcggcgtgaccaaaggcagcttctac960ttcaccggtacgactcctgccgtctcgacgatcagcaacgtcagcacgggaaccggtaat1020caagaaatccagctcgtcgtcacgaccgataacgggcaatgggacgctttcctcgattat1080ttggaaattaactag1095<210>2<211>337<212>prt<213>類芽孢桿菌np1（paenibacillustermiticellulosilyticusnp1）＜400＞2alathrthrilethrserasnglnthrglythrglnaspglytyrasptyrgluleutrp5101520lysaspserglythrthrsermetthrleuasnserglyglyalapheseralathrtrp25303540serasnileasnasnalaleuphearglysglylyslyspheasnalathrglnthrhis45505560glnglnileglyasnileserileasntyralaalathrpheasnproglyglyasnser65707590tyrleuthrvaltyrglytrpthrlysserserleuileglutyrtyrilemetaspasn859095100trpglythrtyrargproserglythrasnlysglyserpheservalaspglyg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