一種用于對不同銀杏進行基因分型的SNP引物及檢測方法與流程
技術領域:
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于對不同銀杏進行基因分型的snp引物及檢測方法。
背景技術：
銀杏(ginkgobilobal.)作為裸子植物銀杏綱(ginkgopsida)現存唯一種，典型的中生代孑遺物種，素有“活化石”之美譽。銀杏為落葉大喬木，樹干高大，雌雄異株。樹皮幼時淺綠色，老樹呈灰褐色，深縱裂，粗糙；分枝繁茂，分長短枝。種子核果狀，有臭味；中種皮骨質，白色，具2～3棱；內種皮膜質淡褐色，子葉2片；花期4～5月，9～10月種子成熟。銀杏集材用、果用、葉用、園林綠化、觀賞于一體，是一種全能的樹種。銀杏葉中含有大量的銀杏黃酮類和銀杏內酯類物質，對治療神經病，骨髓病和腦病有獨特的效用。銀杏葉的非凡藥用價值，已經使銀杏葉制劑形成了一個巨大的產業。
單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphisms，snp)是指單個核苷酸的變異引起的基因組水平上dna序列的多態性，其形式包括單堿基的插入、缺失、轉換和顛換。在群體中，其等位基因頻率大于1％，但有時也把cdna中頻率小于1％的單堿基變異稱之為snp。snp標記是繼rflp和ssr之后發展起來的第三代分子標記，并廣泛應用于植物遺傳育種中，具有遺傳穩定性高；密度高、分布廣；二態性和等位基因性；富有代表性；易于實現高通量、自動化檢測的特點。因此，snp被認為是應用前景最好的遺傳標記之一。
隨著測序技術的發展，測序質量的提高和成本的降低，挖掘snp位點并借此進行相關研究的例子越來越多。但該技術在植物中的應用多集中于農作物，在林木類方面的研究相對較少，且在銀杏這一物種上的研究更是未見報道。隨著時代的發展，野生資源的保護至關重要，對于孑遺樹種古銀杏保護不容忽視。因此，現急需一種快速、方便、可靠的銀杏古樹名木資源分子鑒定技術。利用dna分子標記方法繪制dna指紋圖譜，能從本質上反映生物個體間的差異。常規的dna指紋圖譜是采用第二代分子標記簡單序列重復(ssr)進行的，但是第三代分子標記snp，無須基于凝膠電泳進行指紋圖譜的檢測，減少誤差，省時，且高通量，準確性高。
技術實現要素：
發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種用于對不同銀杏進行基因分型的snp引物，為84株古樹名木建立指紋圖譜。本發明的另一目的是提供上述snp引物的應用。
技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：
一種用于對不同古銀杏進行基因分型的snp引物，由22對引物組成，各引物的核苷酸序列如下表所示：
應用所述的snp引物構建銀杏古樹名木的指紋圖譜，獲得84個銀杏古樹名木對應的指紋圖譜，如下表所示：
所述的應用snp引物構建銀杏古樹名木的指紋圖譜，所使用的引物為11，名稱分別：snp1，snp4，snp6，snp8，snp10，snp14，snp16，snp17，snp19，snp20，snp22。
所述snp引物在不同古銀杏基因組dna的snp位點基因分型檢測中的應用。
所述的應用，包括以下步驟：
1)待測銀杏樣品dna的提取；
2)使用相同反應體系及程序對銀杏樣本基因組dna進行pcr擴增，得到待測銀杏的pcr產物；
3)對pcr擴增產物進行高分辨率溶解曲線分析確定snp位點的基因型；
4)sanger測序再次驗證snp基因型。
步驟2)中，pcr反應體系10μl：25ng模板dna；1xforget-me-nottmqpcrmastermix；0.1μmol/lsnp引物；剩余ddh2o補齊。
步驟2)中，pcr反應程序：預變性95℃2min；95℃變性5s，45個循環；60℃復性30s。
步驟3)中，hrm的反應程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。
本發明通過實驗證明：本發明的引物共22對，其中11對snp引物組合可以用于構建銀杏古樹名木的指紋圖譜。本發明利用銀杏轉錄組數據開發的snp引物能夠對銀杏進行基因分型，并且本發明操作方法簡單，通量高，成本低。此外，本發明開發的11對snp引物構建了不同銀杏古樹名木的指紋圖譜，驗證的22個snp位點還可以用來分子標記輔助育種，遺傳多樣性研究，基于snp的關聯分析，以及用于種質資源鑒定與分類等。
有益效果：與現有技術相比，本發明具有以下的技術優勢：
1)結果高度準確、可靠：利用本發明進行檢測與鑒定，檢測結果100％準確，檢測結果提供了高度的可靠性，為銀杏古樹名木提供指紋圖譜，對野生資源的保護意義重大。
2)操作快速簡便：進行不同個體間的樣本檢測，一般整個試驗過程只需幾小時即可完成，與傳統的測序技術相比，省時省力，可以實現高通量。
3)無需基于凝膠電泳進行，減少試劑和耗材的使用，更佳環保，同時節省人力和減少人工誤差。
4)檢測結果靈敏度高：對待檢測樣品僅需提供模板dna25ng即可準確進行鑒定。
附圖說明
圖1是從銀杏轉錄組測序數據中鑒定出的snp及其變異類型和數目結果圖；
圖2是以引物snp18為例，在不同古銀杏個體表現出的擴增曲線圖；
圖3是以引物snp18為例，利用高分辨率溶解曲線分析后，不同古銀杏個體表現出不同的溶解曲線峰圖；
圖4是以引物snp18為例，根據不同古銀杏個體表現出的差異溶解曲線峰，對其進行基因分型結果的溶解曲線，紅色為cc，藍色為ct，綠色為tt。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。
實施例1
1、初步篩選對銀杏進行基因分型的snp引物
1)轉錄組數據的獲得
根據制造商的說明書使用rneasyplantminikit(qiagen，hilde，germany)進行銀杏總rna提取。提取后，在1.0％的瓊脂糖凝膠上檢測rna的降解和污染。使用
每個樣品的總量為3μgrna用作rna樣品制備的輸入材料。按照制造商的說明書，使用
fastq格式的原始數據(rawreads)首先通過內部perl腳本進行處理。在此步驟中，通過刪除包含適配器的讀取，包含poly-n的讀取以及從原始數據讀取的低質量來獲取干凈的數據(cleanreads)。同時，計算了cleandata的q20，q30，gc含量和序列重復水平。所有的下游分析都是以高質量的cleandata為基礎。然后，將所有庫/樣本中的左文件(read1files)合并到一個大的left.fq文件中，將正確的文件(read2files)合并到一個大的right.fq文件中。基于left.fq和right.fq使用trinity(grabherretal.，2011)完成轉錄組組裝，默認情況下min_kmer_cov設置為2，其他所有參數設置為默認值。選擇具有最長長度的每個基因的轉錄本作為unigenes。
2)snp的識別
本實施例通過使用picard-toolsv1.41和samtoolsv0.1.18來排序，刪除重復讀取，對齊合并獲得每個樣本的bam結果。采用gatk2v3.2軟件用于執行snpcalling(mckennaetal，2010)。原始的vcf文件使用gatk標準方法過濾(參數為clusterwindowsize:10；mq0>＝4and(mq0/(1.0*dp))>0.1；qual<10；qual<30.0orqd<5.0orhrun>5)，最后僅保留距離大于5的snp。通過該方法鑒定出65535個snp，snp變異的形式有多種，但類型主要有轉換和顛換，轉換是顛換的2倍左右，如圖1所示。
3)snp引物的設計
根據轉錄組unigenes序列，挑選60個snp位點，利用oligo6.0軟件設計60對snp引物。設計的方法如下：首先確定snp位點所在序列的位置，然后在snp位點的上下游分別設計正向引物和反向引物，引物設計的參數為引物長度18-23bp；tm60℃左右，盡可能保證上下游引物的tm值一致，一般不超過2℃；gc含量在40-60％(45-55％最佳)；pcr產物大小為100-300bp；其它還應注意引物3'端不應出現超過3個的連續g或c；引物不能形成發夾結構，即不能有4bp以上的回文序列；引物自身、引物之間盡量不能有連續4個以上的堿基互補，尤其避免3'端的互補。
4)snp引物的有效性驗證
提取銀杏基因組dna，以銀杏基因組dna為模板，采用待檢測snp引物進行pcr擴增，獲得pcr擴增產物；反應結束后，取3μl的pcr產物加入4μlloadingbuffer，再加3μlddh2o，利用8％聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后采用銀染方法對pcr擴增產物進行檢測。能檢測到目的條帶且無其它雜帶和引物二聚體的，該待檢測引物即為有效引物。
10μl的pcr反應體系中包括：10×buffer；0.2mmol/ldntps；2.5mmol/lmg2+；0.2μmol/lsnp引物；1utaqdna聚合酶和40ngdna模版；剩余ddh2o補齊。
pcr的反應程序為：預變性94℃5min；30循環的94℃30s，最佳tm55℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最終4℃保存。
結果表明：挑選的60對snp引物中，有45對引物能夠擴增出條帶，說明引物設計的方法較好，但其中的18對引物擴增出的條帶不單一，可能存在多個snp位點，暫不考慮進行hrm分析，另外27對引物擴增條帶單一且產物大小與預期一致，暫為有效snp引物，用于hrm分析。1對引物對應1個目標snp位點，1對引物的擴增產物為含有對應snp位點的dna片段。
2、再次篩選對銀杏進行基因分型的snp引物
1)pcr擴增及高分辨率溶解曲線(hrm)分析進行基因分型
以90個銀杏個體(其中6個銀杏個體為轉錄組測序的銀杏；84棵銀杏古樹名木，分別來自3個群體，貴州盤縣28株，浙江天目山28株和湖北安陸28株)的基因組dna為模板，分別采用上述27對snp有效性引物進行pcr擴增，得到每個個體的27個引物對應的pcr擴增產物，每個引物對的pcr擴增產物為含有某個snp位點的dna片段。
pcr反應體系10μl：25ng模板dna；1×forget-me-nottmqpcrmastermix；0.1μmol/lsnp引物；剩余ddh2o補齊。采用viia7中的highresolutionmelt進行pcr及基因分型。第一步，10μl的pcr反應程序：預變性95℃2min；45個循環的95℃變性5s，60℃復性30s；第二步，hrm的反應程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。
結果表明：有22對引物能夠進行基因分型，其余5對引物(snp23，snp24，snp25，snp26，snp27)因有雜峰或基因分型時可信度不高，所以被淘汰。采用applied
圖2為以snp18為例，在不同銀杏個體表現出的擴增曲線；圖3為以snp18為例，利用高分辨率溶解曲線分析后，不同銀杏個體表現出不同的溶解曲線峰；圖4為以snp18為例，根據不同銀杏個體表現出的差異溶解曲線峰，對其進行基因分型結果的溶解曲線，紅色為cc，藍色為ct，綠色為tt。22對snp引物對90個銀杏個體的基因分型結果如下表所示：
其中，11對snp引物組合(snp1，snp4，snp6，snp8，snp10，snp14，snp16，snp17，snp19，snp20，snp22)構建銀杏古樹名木指紋代碼，獲得84個銀杏古樹名木對應的指紋圖譜，序號1-28為貴州盤縣這個群體的28株古銀杏，序號29-56為浙江天目山這個群體的28株古銀杏，序號57-84為湖北安陸這個群體的28株古銀杏，如下表所示:
2)高分辨率溶解曲線分析結果的驗證
通過對pcr產物測序對高分辨率溶解曲線分析得到的基因分型的結果進行驗證。具體步驟如下：挑選snp的不同分型的pcr產物10μl，進行sanger測序，根據測序峰圖和等位基因出現的頻率確定基因型，并與hrm技術的snp基因分型結果進行比較，以驗證引物基因分型的準確性。
經過sanger測序驗證本發明的引物通過hmr分析對銀杏進行基因分型的結果100％正確，結果可靠。
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