本發明屬于生物技術應用領域，具體地，涉及一種高存活率的細胞復蘇方法。
背景技術：
細胞培養是生物與健康相關研究領域的一項重要技術。隨著生命科學的迅速發展，目前細胞培養已成為細胞生物學、分子生物學、遺傳學和免疫學等學科研究的重要基礎。為了深入探討細胞的生長活動規律、有關疾病的病理和藥物的藥理（毒理）機制，開發具有不同針對性的細胞培養方法具有重要意義。
細胞復蘇是培養細胞的一種，是生命及再生醫學領域中廣泛應用的關鍵技術，在研究中往往需要對凍存的細胞進行復蘇。尤其隨著細胞治療個性化技術的興起，體外擴增特殊功效的細胞成了臨床前研究以及臨床治療的重點研發項目。具有體外擴增特殊功效的細胞包括由多功能的造血干細胞、t細胞、nk細胞、dc細胞以及cik細胞等，將這類細胞體外擴增之后再回輸到哺乳生物體內，有利于提高機體的造血裝置功能：如提升紅細胞、免疫細胞等的數量及功能維護、抗腫瘤能力以及免疫防御能力。
技術實現要素：
發明目的：本發明提供了一種高存活率的細胞復蘇方法，用于多種人源以及非人源細胞的培養。
技術方案：本發明提供了一種高存活率的細胞復蘇方法，包括以下步驟：將凍存的細胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min內于37℃搖晃至含有細胞凍存液的細胞液完全融化，將細胞液加入到盛有2-3ml新鮮培養基的離心管中，用移液槍上下吹打20-30次，于1000-1500g/min的轉速下離心3-10min；移去上清液，加入1-2ml的新鮮培養基，用移液槍上下吹打40-50次，然后均勻的加入到盛有7-9ml的新鮮培養基的細胞培養皿中，于37℃，5%co2培養箱中培養。本發明所述的高存活率的細胞復蘇的方法，其方法合理，應用便捷，復蘇后的細胞存活率高，活性好，可以穩定用于生物與健康相關研究。
進一步的，上述的高存活率的細胞復蘇方法，所述培養基包括70-90%的基礎培養基以及10-30%的胎牛血清。培養基組分合理，營養豐富，可以為細胞培養提供更多的營養物（包括生長因子等），細胞生長速度快，細胞狀態好。
進一步的，上述的高存活率的細胞復蘇方法，所述細胞凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5-15份、羥乙基淀粉2-5份、殼聚糖5-10份、谷胱甘肽2-5份、維生素c1-4份、右旋糖酐0.3-4份、丙二醇0.5-2份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1-1份和基礎培養基80-90份。凍存液組分合理，營養豐富，其中右旋糖酐為滲透性保護液，而n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺則抑制細胞活動和基因表達，維生素c的抗氧化性好，在保證休眠細胞的營養的同時還可以顯著減少對細胞的損傷，提高凍存細胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的狀態。
進一步的，上述的高存活率的細胞復蘇方法，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82-88份、碳酸氫鈉12-25份、丙酮酸鈉10-16份、絲膠蛋白5-9份、氯化鉀35-45份、無水硫酸鎂6-10份、氯化鈉70-78份、無水磷酸二氫鈉10-14份、葉酸0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、煙酰胺0.3-0.6份、無水氯化鈣25-35份、硝酸鐵0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸鈉12-16份、d-泛酸鈣0.3-0.6份、酒石酸膽堿0.6-0.8份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.2-0.4份、鹽酸吡哆辛0.3-0.5份、n-異丙基丙烯酰胺0.2-0.4份、亞麻酸1-2份、乙醇胺0.6-0.8份、芳香酸酯0.3-0.8份、酚紅鈉1-1.3份和去離子水100份。
進一步的，上述的高存活率的細胞復蘇方法，所述基礎培養基還包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5-10份、l-鹽酸胱氨酸3-8份、l-絲氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、l-鹽酸組氨酸4-6份、l-異亮氨酸8-20份、l-亮氨酸7-18份、l-鹽酸賴氨酸10-20份、l-甲硫氨酸1-6份、l-苯丙氨酸2-8份、l-蘇氨酸5-15份、l-色氨酸1-3份、l-酪氨酸5-9份和l-纈氨酸8-12份。
進一步的，上述的高存活率的細胞復蘇方法，所述基礎培養基還包括2-5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細胞生長因子2-10份、白介素23-8份、白介素43-6份、白介素141-5份、ifn-γ3-6份和神經白細胞素1-4份。
進一步的，上述的高存活率的細胞復蘇方法，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。可以有效防止復蘇的細胞被污染。
進一步的，上述的高存活率的細胞復蘇方法，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。
進一步的，上述的高存活率的細胞復蘇方法，所述細胞培養皿為10cm細胞培養皿。青霉素和鏈霉素活性好，效果佳。
有益效果：本發明所述的高存活率的細胞復蘇方法，其方法合理，應用便捷，可以顯著減少凍存對細胞的損傷，復蘇后的細胞存活率高狀態好，細胞邊界清晰，細胞生長速度快，可以穩定用于生物與健康相關研究。
具體實施方式
下面將通過幾個具體實施例，進一步闡明本發明，這些實施例只是為了說明問題，并不是一種限制。
實施例1
一種高存活率的細胞復蘇方法，包括以下步驟：將凍存的細胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min內于37℃搖晃至含有細胞凍存液的細胞液完全融化，將細胞液加入到盛有2ml新鮮培養基的離心管中，用移液槍上下吹打20次，于1000g/min的轉速下離心10min；移去上清液，加入1ml的新鮮培養基，用移液槍上下吹打40次，然后均勻的加入到盛有7ml的新鮮培養基的10cm細胞培養皿中，于37℃，5%co2培養箱中培養。
其中，所述培養基包括70%的基礎培養基以及30%的胎牛血清。此外，所述細胞凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5份、羥乙基淀粉2份、殼聚糖5份、谷胱甘肽2份、維生素c1份、右旋糖酐0.3份、丙二醇0.5份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1份和基礎培養基80份。
另，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉12份、丙酮酸鈉10份、絲膠蛋白5份、氯化鉀35份、無水硫酸鎂6份、氯化鈉70份、無水磷酸二氫鈉10份、葉酸0.3份、肌醇0.8份、煙酰胺0.3份、無水氯化鈣25份、硝酸鐵0.2份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.3份、酒石酸膽堿0.6份、核黃素0.1份、鹽酸硫胺0.2份、鹽酸吡哆辛0.3份、n-異丙基丙烯酰胺0.2份、亞麻酸1份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚紅鈉1份和去離子水100份。
再，所述基礎培養基還包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸3份、l-絲氨酸3份、甘氨酸1份、l-鹽酸組氨酸4份、l-異亮氨酸8份、l-亮氨酸7份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸1份、l-苯丙氨酸2份、l-蘇氨酸5份、l-色氨酸1份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。
又，所述基礎培養基還包括2份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細胞生長因子2份、白介素23份、白介素43份、白介素141份、ifn-γ3份和神經白細胞素1份。
此外，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。
實施例2
一種高存活率的細胞復蘇方法，包括以下步驟：將凍存的細胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min內于37℃搖晃至含有細胞凍存液的細胞液完全融化，將細胞液加入到盛有3ml新鮮培養基的離心管中，用移液槍上下吹打30次，于1500g/min的轉速下離心3min；移去上清液，加入2ml的新鮮培養基，用移液槍上下吹打50次，然后均勻的加入到盛有9ml的新鮮培養基的10cm細胞培養皿中，于37℃，5%co2培養箱中培養。
其中，所述培養基包括90%的基礎培養基以及10%的胎牛血清。此外，所述細胞凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜15份、羥乙基淀粉5份、殼聚糖10份、谷胱甘肽5份、維生素c4份、右旋糖酐4份、丙二醇2份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺1份和基礎培養基90份。
另，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖88份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉16份、絲膠蛋白9份、氯化鉀45份、無水硫酸鎂10份、氯化鈉78份、無水磷酸二氫鈉14份、葉酸0.5份、肌醇1.2份、煙酰胺0.6份、無水氯化鈣35份、硝酸鐵0.4份、丁二酸8份、丁二酸鈉16份、d-泛酸鈣0.6份、酒石酸膽堿0.8份、核黃素0.3份、鹽酸硫胺0.4份、鹽酸吡哆辛0.5份、n-異丙基丙烯酰胺0.4份、亞麻酸2份、乙醇胺0.8份、芳香酸酯0.8份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份。
再，所述基礎培養基還包括8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸10份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸5份、l-鹽酸組氨酸6份、l-異亮氨酸20份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸20份、l-甲硫氨酸6份、l-苯丙氨酸8份、l-蘇氨酸15份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸9份和l-纈氨酸12份。
又，所述基礎培養基還包括5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細胞生長因子8份、白介素28份、白介素44份、白介素145份、ifn-γ6份和神經白細胞素4份。
此外，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。
實施例3
一種高存活率的細胞復蘇方法，包括以下步驟：將凍存的細胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min內于37℃搖晃至含有細胞凍存液的細胞液完全融化，將細胞液加入到盛有3ml新鮮培養基的離心管中，用移液槍上下吹打25次，于1200g/min的轉速下離心5min；移去上清液，加入2ml的新鮮培養基，用移液槍上下吹打45次，然后均勻的加入到盛有8ml的新鮮培養基的10cm細胞培養皿中，于37℃，5%co2培養箱中培養。
其中，所述培養基包括80%的基礎培養基以及20%的胎牛血清。此外，所述細胞凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜10份、羥乙基淀粉3份、殼聚糖6份、谷胱甘肽3份、維生素c2份、右旋糖酐3份、丙二醇1份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.8份和基礎培養基85份。
另，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖86份、碳酸氫鈉18份、丙酮酸鈉12份、絲膠蛋白6份、氯化鉀40份、無水硫酸鎂8份、氯化鈉75份、無水磷酸二氫鈉12份、葉酸0.4份、肌醇1份、煙酰胺0.5份、無水氯化鈣30份、硝酸鐵0.3份、丁二酸7份、丁二酸鈉14份、d-泛酸鈣0.5份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、n-異丙基丙烯酰胺0.3份、亞麻酸1.6份、乙醇胺0.7份、芳香酸酯0.5份、酚紅鈉1.2份和去離子水100份。
再，所述基礎培養基還包括5份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸8份、l-鹽酸胱氨酸6份、l-絲氨酸5份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸10份、l-鹽酸賴氨酸15份、l-甲硫氨酸3份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸9份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸6份和l-纈氨酸9份。
又，所述基礎培養基還包括3份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細胞生長因子6份、白介素25份、白介素44份、白介素145份、ifn-γ5份和神經白細胞素3份。
此外，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。
實施例4
一種高存活率的細胞復蘇方法，包括以下步驟：將凍存的細胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min內于37℃搖晃至含有細胞凍存液的細胞液完全融化，將細胞液加入到盛有2ml新鮮培養基的離心管中，用移液槍上下吹打30次，于1000g/min的轉速下離心8min；移去上清液，加入2ml的新鮮培養基，用移液槍上下吹打50次，然后均勻的加入到盛有7ml的新鮮培養基的10cm細胞培養皿中，于37℃，5%co2培養箱中培養。
其中，所述培養基包括70%的基礎培養基以及30%的胎牛血清。此外，所述細胞凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜15份、羥乙基淀粉2份、殼聚糖6份、谷胱甘肽3份、維生素c1份、右旋糖酐4份、丙二醇1份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.8份和基礎培養基90份。
另，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉12份、絲膠蛋白6份、氯化鉀45份、無水硫酸鎂6份、氯化鈉72份、無水磷酸二氫鈉14份、葉酸0.3份、肌醇1份、煙酰胺0.3份、無水氯化鈣35份、硝酸鐵0.3份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.6份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、n-異丙基丙烯酰胺0.4份、亞麻酸2份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份。
再，所述基礎培養基還包括4份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸5份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸10份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。
又，所述基礎培養基還包括3份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細胞生長因子2份、白介素28份、白介素43份、白介素144份、ifn-γ5份和神經白細胞素2份。
此外，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。
以上所述僅是發明的幾個實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離發明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發明的保護范圍。