本發明涉及一種病毒培養用的體外模型，具體地，涉及一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法。
背景技術：
在病毒學的發展史中，常利用易感動物如家兔、小白鼠、豚鼠等對目的病毒進行實驗。動物模型可以觀察病毒對機體的侵害，造成病理變化的部位，但動物個體差異大，價格昂貴，還需要特殊的動物房，因此推廣起來成本巨大。隨著科學的發展，也出現了很多體外培養病毒的模型，但常規的細胞培養技術模型往往并不能反應病毒在體內的致病過程。
技術實現要素：
發明目的：為了克服以上不足，本發明提供了一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法，運用三維培養技術，既能避免動物體內實驗帶來的高成本，又能最大程度的模擬動物體內生長模式，使所培養的細胞呈現立體生長方式，形成類似體內的組織結構，進而有助于模擬病毒體內的致病過程，該模型方法簡便，成本低廉，推廣方便。
技術方案：為了克服現有技術中存在的不足，本發明提供了一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法，包括以下操作步驟：
（1）微載體混懸液的準備：稱取1-3份的微載體，置于玻璃容器內，按照微載體1份：50ml磷酸鹽緩沖液的比例加入磷酸鹽緩沖液，混勻1-3h，然后再用新鮮的清洗液洗滌2-3次，再按照微載體1份：50ml磷酸鹽緩沖液的比例加入新鮮的磷酸鹽緩沖液，高壓滅菌，冷卻后4℃保存；
（2）細胞貼壁阻滯劑制備：按照2.5%的濃度制備，稱取細胞貼壁阻滯劑粉末，加入無水乙醇，密封后混勻10-30分鐘，4℃保存；
（3）準備6孔板，將制備好的細胞貼壁阻滯劑均勻鋪在6孔板里，靜置風干，再將制備好的細胞以105/ml的濃度接種于6孔板中，所述細胞的培養基包括70-90%的基礎培養基以及10-30%的胎牛血清，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖80-90份、碳酸氫鈉10-20份、丙酮酸鈉8-18份、轉鐵蛋白2-10份、氯化鉀30-50份、無水硫酸鎂5-12份、氯化鈉60-80份、氯化鋰3-10份、無水磷酸二氫鈉8-16份、葉酸0.2-0.6份、肌醇0.5-1.5份、煙酰胺0.2-0.8份、無水氯化鈣20-40份、硝酸鐵0.1-0.5份、丁二酸5-10份、丁二酸鈉9-18份、d-泛酸鈣0.2-0.8份、酒石酸膽堿0.5-1份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.1-0.5份、鹽酸吡哆辛0.1-0.6份、4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸0.2-0.8份、亞麻油0.5-2份、聚脂肪酸酯0.5-1.8份、酚紅鈉0.8-1.5份和去離子水100份；再加入制備好的微載體混懸液，細胞液與微載體混懸液比例為4:1，混勻后，放置于細胞培養箱內，3-4天等細胞三維結構成型后，即可進行病毒接種實驗。
該模型的建立既能避免動物體內實驗帶來的高成本，又能最大程度的模擬動物體內生長模式，使所培養的細胞呈現立體生長方式，形成類似體內的組織結構，進而有助于模擬病毒體內的致病過程，該模型方法簡便，成本低廉，推廣方便。
進一步的，上述的一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法，其所述微載體為cytodex3。與cytodex1/2相比，該種微載體實用性更廣，適合更多類型的細胞接種，便于多種疾病模型的建立。
進一步的，上述的一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法，其所述細胞貼壁阻滯劑為poly-hema。該阻滯劑可以有效的阻止細胞貼附在培養板底部，進而促進三維培養模型的順利建立。
進一步的，上述的一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法，其所述高壓滅菌時的溫度為120℃-140℃，滅菌時間30-50分鐘。
進一步的，上述的一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法，所述清洗液包括如下組份：按重量組份計，
氯化鈉：50-80份
氯化鉀：2-5份
磷酸氫二鈉：10-15份
磷酸二氫鉀：1-5份
氯化鎂：8-10份
葡萄糖：5-10份
去離子水：40-50份。
進一步的，上述的一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法，其所述磷酸鹽緩沖液的制備方法包括如下步驟，
（1）精確稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸氫二鈉13.96g，磷酸二氫鉀2g，放入同一玻璃容器中；
（2）向上述玻璃容器中加去離子水至800ml，攪拌30分鐘使鹽溶解；
（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸鹽緩沖液，臨用時稀釋10倍，調整ph=7.3。
進一步的，上述的一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法，其所述的玻璃容器，為清潔干凈并滅菌后的帶蓋玻璃瓶。
各種配方組成組分合理，操作步驟簡便易行，并且生產成本低，適合推廣。
有益效果：與現有技術相比，本發明具有以下優點：本發明所述的一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法既能避免動物體內實驗帶來的高成本，又能最大程度的模擬動物體內生長模式，使所培養的細胞呈現立體生長方式，形成類似體內的組織結構，進而有助于模擬病毒體內的致病過程，該模型方法簡便，成本低廉，推廣方便。
附圖說明
圖1為本發明所述的一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法示意圖。
具體實施方式
下面將通過幾個具體實施例，進一步闡明本發明，這些實施例只是為了說明問題，并不是一種限制。
實施例1
本發明提供了一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法，包括以下操作步驟：
（1）微載體混懸液的準備：稱取1份的微載體，置于玻璃容器內，加入50ml磷酸鹽緩沖液，混勻1h，然后再用新鮮的清洗液洗滌2次，所述清洗液包括如下組份：按重量組份計，氯化鈉：50份、氯化鉀：2份、磷酸氫二鈉：10份、磷酸二氫鉀：1份、氯化鎂：8份、葡萄糖：5份和去離子水：40份。再加入50ml新鮮的磷酸鹽緩沖液，120℃高壓滅菌30分鐘，冷卻后4℃保存；
（2）細胞貼壁阻滯劑制備：按照2.5%的濃度制備，稱取細胞貼壁阻滯劑粉末，加入無水乙醇，密封后混勻10分鐘，4℃保存；
（3）準備6孔板，將制備好的細胞貼壁阻滯劑均勻鋪在6孔板里，靜置風干，再將制備好的細胞以105/ml的濃度接種于6孔板中，所述細胞的培養基包括70%的基礎培養基以及30%的胎牛血清，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖80份、碳酸氫鈉10份、丙酮酸鈉8份、轉鐵蛋白2份、氯化鉀30份、無水硫酸鎂5份、氯化鈉60份、氯化鋰3份、無水磷酸二氫鈉8份、葉酸0.2份、肌醇0.5份、煙酰胺0.2份、無水氯化鈣20份、硝酸鐵0.1份、丁二酸5份、丁二酸鈉9份、d-泛酸鈣0.2份、酒石酸膽堿0.5份、核黃素0.1份、鹽酸硫胺0.1份、鹽酸吡哆辛0.1份、4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸0.2份、亞麻油0.5份、聚脂肪酸酯0.5份、酚紅鈉0.8份和去離子水100份；再加入制備好的微載體混懸液，細胞液與微載體混懸液比例為4:1，混勻后，放置于細胞培養箱內，3天等細胞三維結構成型后，即可進行病毒接種實驗。
其中，所述磷酸鹽緩沖液的制備方法包括如下步驟，
（1）精確稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸氫二鈉13.96g，磷酸二氫鉀2g，放入同一玻璃容器中；
（2）向上述玻璃容器中加去離子水至800ml，攪拌30分鐘使鹽溶解；
（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸鹽緩沖液，臨用時稀釋10倍，調整ph=7.3。
實施例2
本發明提供了一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法，包括以下操作步驟：
（1）微載體混懸液的準備：稱取2份的微載體，置于玻璃容器內，加入100ml磷酸鹽緩沖液，混勻2h，然后再用新鮮的清洗液洗滌2次，其所述清洗液包括如下組份：按重量組份計，氯化鈉：60份、氯化鉀：3份、磷酸氫二鈉：12份、磷酸二氫鉀：3份、氯化鎂：9份、葡萄糖：6份和去離子水：40份。再加入100ml新鮮的磷酸鹽緩沖液，120℃高壓滅菌，冷卻后4℃保存；
（2）細胞貼壁阻滯劑制備：按照2.5%的濃度制備，稱取細胞貼壁阻滯劑粉末，加入無水乙醇，密封后混勻15分鐘35分鐘，4℃保存；
（3）準備6孔板，將制備好的細胞貼壁阻滯劑均勻鋪在6孔板里，靜置風干，再將制備好的細胞以105/ml的濃度接種于6孔板中，所述細胞的培養基包括90%的基礎培養基以及10%的胎牛血清，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖90份、碳酸氫鈉20份、丙酮酸鈉18份、轉鐵蛋白10份、氯化鉀50份、無水硫酸鎂12份、氯化鈉80份、氯化鋰10份、無水磷酸二氫鈉16份、葉酸0.6份、肌醇1.5份、煙酰胺0.8份、無水氯化鈣40份、硝酸鐵0.5份、丁二酸10份、丁二酸鈉18份、d-泛酸鈣0.8份、酒石酸膽堿1份、核黃素0.3份、鹽酸硫胺0.5份、鹽酸吡哆辛0.6份、4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸0.8份、亞麻油2份、聚脂肪酸酯1.8份、酚紅鈉1.5份和去離子水100份；再加入制備好的微載體混懸液，細胞液與微載體混懸液比例為4:1，混勻后，放置于細胞培養箱內，3天等細胞三維結構成型后，即可進行病毒接種實驗。
其中，所述磷酸鹽緩沖液的制備方法包括如下步驟，
（1）精確稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸氫二鈉13.96g，磷酸二氫鉀2g，放入同一玻璃容器中；
（2）向上述玻璃容器中加去離子水至800ml，攪拌30分鐘使鹽溶解；
（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸鹽緩沖液，臨用時稀釋10倍，調整ph=7.3。
實施例3
本發明提供了一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法，包括以下操作步驟：
（1）微載體混懸液的準備：稱取2份的微載體，置于玻璃容器內，加入100ml磷酸鹽緩沖液，混勻2h，然后再用新鮮的清洗液洗滌3次，所述清洗液包括如下組份：按重量組份計，氯化鈉：70份、氯化鉀：4份、磷酸氫二鈉：12份、磷酸二氫鉀：4份、氯化鎂：9份、葡萄糖：8份和去離子水：50份。再加入100ml新鮮的磷酸鹽緩沖液，140℃高壓滅菌40分鐘，冷卻后4℃保存；
（2）細胞貼壁阻滯劑制備：按照2.5%的濃度制備，稱取細胞貼壁阻滯劑粉末，加入無水乙醇，密封后混勻20分鐘，4℃保存；
（3）準備6孔板，將制備好的細胞貼壁阻滯劑均勻鋪在6孔板里，靜置風干，再將制備好的細胞以105/ml的濃度接種于6孔板中，所述細胞的培養基包括80%的基礎培養基以及20%的胎牛血清，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖86份、碳酸氫鈉18份、丙酮酸鈉12份、轉鐵蛋白6份、氯化鉀40份、無水硫酸鎂8份、氯化鈉75份、氯化鋰6份、無水磷酸二氫鈉12份、葉酸0.4份、肌醇1份、煙酰胺0.5份、無水氯化鈣30份、硝酸鐵0.3份、丁二酸7份、丁二酸鈉14份、d-泛酸鈣0.5份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸0.5份、亞麻油1.2份、聚脂肪酸酯1.2份、酚紅鈉1.2份和去離子水100份；再加入制備好的微載體混懸液，細胞液與微載體混懸液比例為4:1，混勻后，放置于細胞培養箱內，4天等細胞三維結構成型后，即可進行病毒接種實驗。
其中，所述磷酸鹽緩沖液的制備方法包括如下步驟，
（1）精確稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸氫二鈉13.96g，磷酸二氫鉀2g，放入同一玻璃容器中；
（2）向上述玻璃容器中加去離子水至800ml，攪拌30分鐘使鹽溶解；
（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸鹽緩沖液，臨用時稀釋10倍，調整ph=7.3。
實施例4
本發明提供了一種低成本的病毒體外三維培養模型的建立方法，包括以下操作步驟：
（1）微載體混懸液的準備：稱取3份的微載體，置于玻璃容器內，加入150ml磷酸鹽緩沖液，混勻3h，然后再用新鮮的清洗液洗滌3次，所述清洗液包括如下組份：按重量組份計，氯化鈉：80份、氯化鉀：5份、磷酸氫二鈉：15份、磷酸二氫鉀：5份、氯化鎂：10份、葡萄糖：10份和去離子水：50份。再加入150ml新鮮的磷酸鹽緩沖液，140℃高壓滅菌50分鐘，冷卻后4℃保存；
（2）細胞貼壁阻滯劑制備：按照2.5%的濃度制備，稱取細胞貼壁阻滯劑粉末，加入無水乙醇，密封后混勻30分鐘，4℃保存；
（3）準備6孔板，將制備好的細胞貼壁阻滯劑均勻鋪在6孔板里，靜置風干，再將制備好的細胞以105/ml的濃度接種于6孔板中，所述細胞的培養基包括70%的基礎培養基以及30%的胎牛血清，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉16份、轉鐵蛋白5份、氯化鉀40份、無水硫酸鎂6份、氯化鈉78份、氯化鋰6份、無水磷酸二氫鈉12份、葉酸0.4份、肌醇1.2份、煙酰胺0.3份、無水氯化鈣28份、硝酸鐵0.2份、丁二酸8份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.6份、酒石酸膽堿0.8份、核黃素0.1份、鹽酸硫胺0.4份、鹽酸吡哆辛0.3份、4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸0.6份、亞麻油1.2份、聚脂肪酸酯0.8份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份；再加入制備好的微載體混懸液，細胞液與微載體混懸液比例為4:1，混勻后，放置于細胞培養箱內，4天等細胞三維結構成型后，即可進行病毒接種實驗。
其中，所述磷酸鹽緩沖液的制備方法包括如下步驟，
（1）精確稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸氫二鈉13.96g，磷酸二氫鉀2g，放入同一玻璃容器中；
（2）向上述玻璃容器中加去離子水至800ml，攪拌30分鐘使鹽溶解；
（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸鹽緩沖液，臨用時稀釋10倍，調整ph=7.3。
以上所述僅是發明的幾個實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離發明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發明的保護范圍。