一種安全型抗CEA嵌合抗原受體修飾T細胞的制備方法及其應用與流程

本發明涉及及生物與新醫藥技術領域，更具體的說，是一種安全型抗cea嵌合抗原受體修飾t細胞的制備方法及其應用。

背景技術：

癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，cea)是一種高表達多種惡性腫瘤的酸性糖蛋白，如表達95％以上的結腸直腸癌，90％左右的胃癌、胰腺癌，80％以上的非小細胞性肺癌，50％左右的乳腺癌。因此cea已被公認為腫瘤標志物之一，使之成為腫瘤靶向治療和診斷的最佳靶位之一。

傳統的治療cea腫瘤方法包括手術、放療、化療等遠不能滿足廣大癌癥患者的要求，每年因cea腫瘤而死亡的人數是全部腫瘤死亡人數的60％以上，是人類健康的嚴重威脅。而以癌胚抗原嵌合抗原受體(chimericantigenreceptorcar)修飾t細胞(car-t)過繼性地靶向免疫治療已成為cea腫瘤治療的富有希望的療法。目前car-t技術已在急性白血病、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、腎癌、結腸癌等多種惡性腫瘤的治療上有著顯著的療效，但也引起了“脫靶效應”和“細胞因子風暴”等不良反應。因此，在保證car-t細胞治療效果的前提下，如何提高car-t細胞的安全性是目前臨床應用面臨的首要問題。

技術實現要素：

為了彌補以上不足，本發明提供了本發明提供一種安全型抗cea嵌合抗原受體修飾的t細胞。

本發明的方案是：

一種安全型抗cea嵌合抗原受體修飾t細胞的制備方法，將leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk核苷酸合成，將合成的leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk的基因片段插入到plent-c-gfp載體(invitrogen)noti-asisi位點，經測序正確后，構建成質粒，將所述質粒轉染293t細胞，包裝成攜帶有leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk編碼基因的慢病毒，將所述攜帶有leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk編碼基因的慢病毒感染單核細胞誘導的異質t淋巴細胞，得到安全型抗cea嵌合抗原受體修飾的t細胞。

作為優選的技術方案，所述leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk的基因片段為序列表seq.id.no.1所示的核苷酸序列。

本發明還提供了一種將單核細胞誘導的異質t淋巴細胞制備如下：取患者自體外周血，分離外周血單個核細胞，用重組干擾素α2a的培養基誘導培養24小時后，加入重組白細胞介素2、okt-3和5％的患者自體血漿誘導繼續培養24小時；每隔兩天倍比加液，培養至第14天，流式細胞術檢測t細胞中的cd3+、cd56+的陽性表達率；cd3+陽性率>80％，cd3+cd56+雙陽性率>20％，獲得單核細胞誘導的異質t淋巴細胞。

本發明還提供了一種將所述質粒轉染293t細胞，包裝成攜帶有leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk編碼基因的慢病毒的方法：將慢病毒包裝細胞系293t接種于含有dmem+10％fbs10cm培養皿中，37℃，5％的co2條件下培養，貼壁率為70％-80％后進行轉染，所述質粒采用磷酸鈣轉染法轉染293t細胞，轉染后24h后，細胞明顯增大、呈球形，細胞核變大，變圓，貼壁能力下降而易脫落；48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到細胞內有綠色熒光蛋白表達；72h后，收集上清，過濾除菌，獲得慢病毒，在-80℃低溫冰箱中保存備用。

本發明還提供一種治療腫瘤的藥物，含有權利要求1所述的安全型抗cea嵌合抗原受體修飾的t細胞。

由于采用了上述技術方案，一種安全型抗cea嵌合抗原受體修飾t細胞的制備方法，將leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk核苷酸合成，將合成的leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk的基因片段插入到plent-c-gfp載體(invitrogen)noti-asisi位點，經測序正確后，構建成質粒，將所述質粒轉染293t細胞，包裝成攜帶有leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk編碼基因的慢病毒，將所述攜帶有leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk編碼基因的慢病毒感染單核細胞誘導的異質t淋巴細胞，得到安全型抗cea嵌合抗原受體修飾的t細胞。

該發明的優點：

具有活性“開關”的中等親和力重組嵌合抗原受體，包括中等親和力癌胚抗原結合區、cd8的hinge區和跨膜區、cd137和cd3ζ的胞內信號區，在重組嵌合抗原受體的3'端插入活性“開關”元件。

本發明所述的重組嵌合抗原受體，活性“開關”元件是由自殺基因單純皰疹胸腺嘧啶激酶構成。通過自裂解多肽t2a與重組嵌合抗原受體其它功能結構域相連。由t2a連接的基因在轉入t細胞后能正常翻譯和表達，且表達水平相當。更昔洛韋誘導后，含有重組嵌合抗原受體的t細胞裂解死亡以實現更昔洛韋控性的“關”作用，即通過注射更昔洛韋來預防和治療car-t的不良反應。

本發明所述的重組嵌合抗原受體，中等親和力抗原結合區選自中等親和力單鏈抗體。使car-t細胞能夠根據抗原密度的差異選擇的殺傷腫瘤細胞，而豁免正常細胞，在保證療效的同時降低“脫靶效應”，提高安全。

附圖說明

圖1為本發明所述的嵌合抗原受體leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk的融合基因片段的設計圖；

圖2為本發明所述的慢病毒leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk表達質粒的示意圖；

圖3為本發明car-t細胞的表達car的效率為18±1.56；

圖4為本發明car-t體內抑制cea陽性結直腸癌細胞系sw480細胞的生長，且car-t活性受自殺基因系統的控制；

圖5是不同親和力的car-t細胞殺傷4種cea表達量不同的腫瘤細胞的結果圖；

具體實施方式

為了彌補以上不足，本發明提供了一種安全型抗cea嵌合抗原受體修飾的t細胞，以解決上述背景技術中的問題。

實施例1表達本發明核酸編碼的嵌合抗原受體蛋白的慢病毒質粒的構建及病毒包裝

1.將融合基因片段leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk插入慢病毒表達載體plent-c-gfp。

leader-scfv(cea)-cd8-cd137-cd3ζ-t2a-hsv-tk的car模塊示意見圖1(完整核酸序列見附錄seqidno.1)。

anti-cea的car各模塊序列

(1)導引子leader核酸人工序列(seqidno.2)

(2)anti-carcinoembryonicantigenantibodysinglechainfvantibody(scfv)核酸人工序列(seqidno.3)

(3)cd8hinge區核酸人工序列(seqidno.4)

(4)cd8跨膜區核酸人工序列(seqidno.5)

(5)cd137胞內區核酸人工序列(seqidno.6)

(6)cd3ζ胞內區核酸人工序列(seqidno.7)

(7)自裂解多肽t2a核酸人工序列(seqidno.8)

(8)hsv-tk核酸人工序列(seqidno.9)

分別按導引子leader的核酸人工序列、anti-cea的核酸人工序列、cd8hinge區核酸人工序列、cd8跨膜區的核酸人工序列、cd137的核酸人工序列、cd3ζ的核酸人工序列，自裂解多肽t2a核酸人工序列，hsv-tk核酸人工序列(seqidno.10)委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整個表達框，插入plent-c-gfp載體(invitrogen)noti-asisi位點(見圖2)，轉化到e.coli(dh5α)，經測序正確后，使用qiagen公司的質粒純化試劑盒提取并純化質粒，獲得重組表達載體的高品質質粒。

2.慢病毒包裝，滴度檢測

將慢病毒包裝細胞系293t接種于含有dmem+10％fbs10cm培養皿中，37℃，5％的co2條件下培養，貼壁率為70％-80％后進行轉染。重組質粒和空載質粒分別與慢病毒包裝質粒采用磷酸鈣轉染法共轉染293t細胞，具體方法參考分子克隆。轉染后24h后，細胞明顯增大、呈球形，細胞核變大，變圓，貼壁能力下降而易脫落。48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到細胞內有綠色熒光蛋白表達。72h后，收集上清，過濾除菌，在-80℃低溫冰箱中保存備用。根據lenti-x^tmgostix^tm試劑盒(北京華夏遠洋科技有限公司產品)測定病毒滴度，結果表明，重組慢病毒的滴度2.66×10⁶pfu/ml，空載慢病毒的滴度2.78×10⁶pfu/ml。

實施例2慢病毒感染t細胞

1.異質性t細胞的制備

取75ml患者自體外周血，用tbd樣本密度分離液(購自天津灝洋華科生物)，分離外周血單個核細胞。用含有1000iu/ml的重組干擾素α2a(購自沈陽三生制藥)的培養基(購自corning公司，88-551-cm)誘導培養24小時后，加入1000iu/ml的重組白細胞介素2(購自沈陽三生制藥)、50ng/ml的okt-3和5％的患者自體血漿誘導繼續培養24小時。每隔兩天倍比加液，培養至第14天，流式細胞術檢測t細胞中的cd3+、cd56+的陽性表達率(cd3-fitc，cd16/cd56-pe抗體購自beckman公司，a07735)。cd3+陽性率>80％，cd3+cd56+雙陽性率>20％，視為t細胞誘導成功，并留取該t細胞待病毒感染

2.慢病毒感染t細胞及感染后t細胞的擴增培養

以moi＝5用上述重組和空載慢病毒分別感染t細胞。感染后的細胞37℃，5％co2培養箱中培養8小時后，收集細胞，重新加入病毒液，1000g，32℃，再次離心90分鐘后，37℃，5％co2培養箱中繼續培養，如此反復進行多重感染，提高t細胞的感染效率。吸棄2ml培養上清，加入2ml的新鮮corning培養基，繼續擴大培養，培養17天至細胞擴增至足夠的用量。通過熒光顯微鏡檢測嵌合抗原受體表達，由于gfp與car共表達，檢測gfp的陽性細胞即為表達嵌合抗原受體的陽性細胞(圖3)。以未感染的t淋巴細胞作為陰性對照，重組慢病毒感染t細胞其陽性率18±1.56％，空載慢病毒感染t細胞其陽性率19.33±1.38％。

實施例3：具有自殺基因系統的car-t細胞殺傷活性研究

取穩定表達熒光素酶(fire-luciferase)的cea陽性的結直腸癌細胞系sw480作為靶細胞，效應細胞為car-t細胞和空載慢病毒感染t。

1.自殺基因系統對car-t細胞活性的控制

將car-t細胞按照密度1×10⁵個/ml接種96孔板中，每孔100ul，置于5％co2、37℃培養箱培養24h；加入10ng更昔洛韋(自殺基因系統的誘導劑，武漢海特生物制藥股份有限公司)，每12小時一次，共3次。以未加更昔洛韋的car-t細胞作為陰性對照。用熒光素酶檢測系統試劑盒e4550(南京生興生物技術有限公司)檢測孔板中剩余細胞內luciferase含量，自殺基因系統對修飾后t細胞活性的控制率＝(1-加更昔洛韋培養孔熒光強度/未加更昔洛韋培養孔熒光強度)×100％。自殺基因系統對car-t細胞活性的控制率為98.34％±2.03％；結果說明本發明設計的car-t細胞活性受自殺基因系統的控制。

2.car-t細胞對cea陽性腫瘤細胞系殺傷活性分析

接種100μl1×10⁴/孔的靶細胞sw480到96孔細胞培養板中，按照1:1效靶比加入效應細胞即car-t細胞，置于5％co2、37℃培養箱培養24h。以加入空載慢病毒感染t作為對照組。利用熒光素酶檢測系統試劑盒e4550(南京生興生物技術有限公司)檢測孔板中剩余細胞內luciferase含量，car-t細胞株對靶細胞的體外殺傷效率＝(1-car-t細胞靶細胞共培養孔熒光強度/空載慢病毒感染t細胞靶細胞共培養孔熒光強度)×100％。效應t細胞對cea陽性腫瘤細胞系sw480細胞的殺傷效率為82.34％±1.97％；結果說明本發明設計的car-t細胞對cea陽性腫瘤細胞系具有很高殺傷作用。

實施例4：car-t細胞對結直腸癌balb/c小鼠腫瘤生長抑制作用

18-22g雌性km小鼠(購自廣州中醫藥大學)于動物房飼養(室溫23±2℃，濕度50％±10％)，收集對數期的結直腸癌細胞系sw480細胞，磷酸鹽緩沖液(pbs)稀釋至2×10⁵個/ml。無菌條件下，小鼠左腋下接種0.2ml結直腸癌sw480細胞懸浮液，觀察3-5d，待腋下出現米粒大小較硬的結節作為建模成功的標準。

c57bl/6結直腸癌移植瘤模型小鼠(游標卡尺量取皮下腫瘤組織塊的大小為90-100mm³)隨機分成4組，每組20只，開始注射治療實驗。實驗組分別為：

a.對照組，尾部靜脈注射同等體積的生理鹽水；

b.治療一組，尾部靜脈注射2×10⁶個細胞/只car-t細胞，首次注射后7天再進行第二次同劑量注射；

c.治療二組，尾部靜脈注射2×10⁶個細胞/只car-t細胞，首次注射后7天再進行第二次同劑量注射，且首次治療注射12h后，每天尾部靜脈注射更昔洛韋(8mg/kg)進行清除car-t細胞，共持續14d。

d.治療三組，尾部靜脈注射2×10⁶個細胞/只car-t細胞，首次注射后7天再進行第二次同劑量注射，且二次治療注射12h后，每天尾部靜脈注射更昔洛韋(8mg/kg)進行清除car-t細胞，共持續7d。

每天通過游標卡尺量取各個實驗組小鼠皮下腫瘤組織塊大，并記錄，用腫塊均值繪制腫瘤生長曲線圖，結果如圖4所示。注射car-t細胞后第3天，40％小鼠的腫瘤開始變小，在14天時，65％小鼠幾乎觸摸不到腫瘤。注射更昔洛韋后幾乎完全抑制了car-t對腫瘤的作用，說明更昔洛韋可以消除car-t細胞，防止對正常的組織和器官的旁系損傷。結果表明本發明設計的car-t細胞對balb/c小鼠腫瘤生長有明顯的抑制作用，且活性受自殺基因系統的控制。

實施例5：car-t細胞臨床應用方法：

用于cea腫瘤病人的治療，治療方法是局部腫瘤注射和靜脈回輸2×10⁶個car-t細胞,每周一次,連續免疫兩周。若有不良反應的發生，則局部腫瘤注射和靜脈回輸更昔洛韋(5-10mg/kg)，連續7-14d。

實施例6：運用流式細胞術檢測兩種不同親和力的car-t細胞對cea表達量不同的4組腫瘤細胞的殺傷活性研究

1.不同類型腫瘤細胞表面cea的表達量的分析

首先收獲并調整細胞濃度為1×10⁶/ml于eppendorf管中，加人2mg/l與抗cea人鼠嵌合型抗體t84.66(igg1)(德泰生物產品)，混勻于冰上1h，pbs洗后，冰上lh熒光標記抗體，pbs再次洗后，懸浮于1.0mlfacsflow溶液中，采用流式細胞儀facscalibur(為美國bd公司產品)檢測分析腫瘤細胞表面cea的表達量，以人igg為對照抗體。與重組抗體t84.66(igg1)特異性結合較明顯的細胞株為結直腸癌細胞系sw480；結合稍弱的為肺癌細胞系kns-62；少量結合的為結腸癌細胞系ht-29：；不與cea特異性抗體結合的細胞株為胃癌細胞系mkn-74。

2.兩種不同親和力的car-t細胞對cea表達量不同的4組腫瘤細胞的殺傷功能的分析

將不同的靶細胞sw480，kns-62，ht-29，mkn-74以100μl1×10⁴/孔的分別接種到96孔細胞培養板中，按照1:1效靶比分別中等親和力car-t細胞和高親和力car-t細胞(抗體序列見seqidno.10，構建過程同上)，置于5％co2、37℃培養箱培養24h。以自動化xcelligenceptcadp儀器(羅氏產品)實時監測car-t的殺傷功能，結果如圖5所示。中等親和力car-t細胞根據抗原的差異，特異殺傷cea高表達結直腸癌細胞系sw480和肺癌細胞系kns-62，且殺傷能力隨著抗原表達量的降低而顯著減弱，對cea少量表達的結腸癌細胞系ht-29和不表達的胃癌細胞系mkn-74沒有殺傷力。高親和力car-t細胞，除對cea不表達的胃癌細胞系mkn-74沒有殺傷力外，對其余各組均有有效的殺傷功能。結果表明中等親和力car-t細胞能夠根據抗原密度的差異選擇的殺傷腫瘤細胞，而豁免正常細胞，在保證療效的同時降低“脫靶效應”，提高安全。

盡管本發明的具體實施方式已經得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根據已經公開的所有教導，可以對那些細節進行各種修改和替換，這些改變均在本發明的保護范圍之內。本發明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。

序列表

<110>山東興瑞生物科技有限公司

<120>一種安全型抗cea嵌合抗原受體修飾t細胞的制備方法及其應用

<130>2017

<160>10

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2678

<212>dna

<213>anti-cea的car人工序列

<400>1

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<213>導引子leader人工序列

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<210>4

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