一種靶向CD19的嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞的制作方法

本發明屬于細胞工程
技術領域：
，具體涉及一種靶向cd19的嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞。
背景技術：
：b淋巴細胞瘤是起源于造血系統的最常見的惡性腫瘤。目前，多種b淋巴細胞惡性腫瘤應用傳統療法難以治愈。此外，傳統的治療方法具有多種副作用。例如，異體骨髓移植后，會引起移植物抗宿主病(gvdh)，從而導致骨髓移植的失敗。近年來，嵌合抗原受體修飾的t細胞(car-t)技術的發展給一些b細胞表面分化抗原相關疾病的治療帶來希望；其中靶向cd19的car-t細胞療法已進入臨床試驗階段，一些患者達到了完全緩解的效果。該療法在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治療上有著顯著的療效，目前被認為是最有前景的腫瘤治療方式之一。目前，car-t技術已發展到第三代，但第二代在臨床治療上最為常見。car-t技術的car分子由胞外抗原結合區、跨膜區和胞內區組成。胞外抗原結合區由信號肽和靶抗原的單鏈抗體(scfv)片段組成，第二代胞內區由一個共刺激分子(主要為cd28或cd137分子)和信號傳導區(cd3ζ)組成。第三代胞內區則由兩個共刺激分子和信號傳導區組成。隨著該項技術的發展，修飾性t細胞(car-t)的療效和機體內的持久性將得到更好的提高。由于car-t抗原的靶向性非常強，無法區分表達相應抗原的腫瘤細胞和正常細胞，因此針對表達相應抗原的腫瘤細胞和正常細胞，都具有攻擊性，可能會導致靶向細胞毒性的產生。因此很有必要開發出靶向腫瘤特異性抗原的有效且安全性高的抗體片段，用于構建新的car分子，進而盡可能降低靶向毒性對機體帶來的危險。技術實現要素：本發明的目的是提供一種靶向cd19的嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞，從而降低car-t的靶向毒性，以彌補現有技術之不足。本發明首先提供一種嵌合抗原，其氨基酸序列為seqidno:1；編碼上述嵌合抗原的核苷酸片段，其序列為seqidno:2；上述的嵌合抗原用于修飾t淋巴細胞；本發明在一個方面提供一種使用上述嵌合抗原修飾的t淋巴細胞，其構建步驟如下：1)人外周血pbmc的分離采集人外周血50ml,使用淋巴細胞分離液分離獲得單個核細胞(pbmc)；該群細胞在cd3/cd28抗體和il-2作用下，激活得到大量增殖的t細胞。同時提取pbmc中總rna，逆轉錄為pcr反應的模板cdna。2)構建重組質粒將編碼上述嵌合抗原的核苷酸片段插入plvx-ires-neo載體中，獲得重組嵌合抗原受體表達質粒；本發明的嵌合抗原受體，優選的是慢病毒表達載體plvx-ires-neo。3)慢病毒制備：將步驟2)構建的重組質粒和病毒包裝質粒轉染進入293t細胞中，獲得攜帶上述嵌合抗原的慢病毒；其一種具體操作方法如下：復蘇293t細胞，消化傳代至第三代。t100b包被培養板后，接種293t細胞；將重組質粒和病毒包裝質粒共轉染293t細胞，轉染后48h、72h收集病毒液。4)修飾性t細胞的獲得使用步驟3)制備的慢病毒感染t細胞，獲得修飾性t細胞所述修飾性t細胞制備的過程中，其一種具體步驟如下：分離外周血，獲得pbmc；通過cd3/cd28抗體磁珠作用，得到特異性增殖的t細胞，加入濃縮好的慢病毒來感染t細胞；慢病毒與t細胞混合后，再加入polyberen進行感染，最終獲得修飾性t細胞。本發明通過篩選，最終得到一個全新的、靶向cd19的嵌合抗原受體序列。該嵌合抗原受體經過密碼子優化，插入慢病毒表達載體plvx-ires-neo(空載)中，構成抗人cd19分子的重組表達質粒。該質粒利用慢病毒包裝體系(lenti-xpackagingsingleshots，vsvg)，獲得高滴度的慢病毒；t100b包被后進行t細胞鋪板，再利用慢病毒感染，獲得修飾性的t細胞。多次實驗表明，t100b可顯著提高慢病毒對t細胞的感染率。利用流式細胞術，檢測嵌合抗原受體的表達效率；并將構建成功的修飾性t細胞與b細胞系來源的raji腫瘤細胞共培養，前者對raji細胞具有顯著的殺傷性。由此可見，構建的嵌合抗原受體修飾的t細胞，可用于治療cd19陽性的b細胞惡性腫瘤。附圖說明圖1為plv-car19重組表達載體示意圖。圖2為car19重組質粒的限制性內切酶ecori/bamhi雙酶切電泳鑒定圖。圖3為plv-car19重組表達質粒的部分測序結果峰值圖。圖4為靶向cd19的嵌合抗原受體的基因結構示意圖。圖5為car19修飾性t淋巴細胞與raji共培養后的殺瘤檢測圖。具體實施方式為了對本發明所作進一步說明，下面將結合附圖說明和具體實施方式做分別介紹。本發明的實現方式并不僅限于實施方式所公開的內容與技術，因此凡對本方案技術所進行的等同替換，均在本發明的保護范圍之內。實施例1：人外周血單個核細胞(pbmc)分離與t細胞擴增1.1人外周血pbmc的分離1)采集供者外周血50ml，800g，離心10min。離心后可觀察到分層現象。上層為血漿層，中間層為白膜層，最下端為紅細胞層。2)用吸液管緩慢收集血漿層，56度滅活30min。3)淋巴細胞分離液分離白膜層：使用吸管小心抽吸白膜層細胞，加入pbs中，兩者完全混勻；將淋巴分離液的加入15ml離心管中，再等體積加入pbs混合液。700g，離心15min。4)洗滌pbmc：離心后小心抽吸離心管中間的白膜層細胞，加入25mlpbs混勻清洗一次。離心后，棄pbs；再加入培養基25ml重懸，重復清洗一次細胞。5)棄去培養基，加入新的培養基重懸pbmc細胞。1.2t細胞激活與擴增1)pbmc分離：將步驟1.1最終分離的pbmc全部加入t175cm2培養瓶，移入co2培養箱中。2)2h后取出培養瓶，輕輕晃動，使沉降于底部的懸浮細胞浮起，培養瓶傾斜，移液器吸取細胞懸浮液轉入新的培養瓶中，少許培養基清洗培養瓶將懸浮細胞全部收集。3)向新的培養瓶中加cd3/cd28磁珠，并加入il-2(100u/ml),混勻后移入培養箱中。4)第5日去磁珠，定期補液。取激活的t細胞，使用抗體cd4+和cd8+單克隆抗體染色，流式細胞儀上機鑒定激活的t細胞的分型。1.3rt-pcr獲得pbmc中cdna1)trizol提取pbmc中總rna:取2x106個pbmc細胞，加入1mltrizol。使用上海生工生物工程股份有限公司的q-10柱式trizol總rna抽提試劑盒抽提pbmc中的總rna。2)反轉錄rna獲得cdna:使用上海生工生物工程股份有限公司的amv第一鏈cdna合成試劑盒中oligodtprimer反轉錄rna。反轉錄體系如下：逆轉錄反應體系20μlrna樣品3μloligo-dtprimers1μlrnasefreeddh208μl5×rtbuffer4μlrnaseinhibitor(40u/μl)1μldntps(10mm)2μlamvreversetranscriptase2μl反轉錄程序如下：cdna合成42℃60min終止反應85℃5min(酶失活)處理后，冰上放置或-20度保存實施例2:嵌合抗原car19重組載體的構建2.1抗cd19單鏈抗體(scfv)基因序列的獲得人cd19蛋白免疫小鼠后純化得到其抗體片段，對其進行氨基酸測序，之后進行密碼子優化，得到其核苷酸序列。修飾并構建為抗cd19的單鏈抗體，命名為car19scfv。該單鏈抗體由重鏈和輕鏈組成，重鏈與輕鏈之間的連接片段是ggggsggggsggggs(3g4s)。將修飾后的單鏈抗體送往上海生工生物工程股份有限公司合成。2.2pcr擴增cd8a信號肽、cd8a鉸鏈區、cd8a跨膜區、41bbl和cd3ζ1)設計引物：使用primer5.0軟件，設計pcr擴增所需的上下游引物。引物送往上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列見下表：2)pcr反應體系(50μl)3)pcr擴增程序首先設置pcr儀蓋溫為95℃。pcr擴增程序為：94℃預變性3min；94℃變性30s；56℃退火30s；72℃2min；第2步到第4步重復32個cycles；72℃再延伸8min；4℃保溫30min。反應體系完全混勻后，開始進行目的片段的擴增。4)pcr產物鑒定、純化和測序pcr擴增程序完成后，將pcr產物加入加樣孔中，進行1％瓊脂糖電泳鑒定。膠回收試劑盒回收與目的片段一致的pcr產物,并送往上海生工生物工程股份有限公司進行測序；與目的片段序列一致的pcr產物，將用于嵌合抗原受體基因序列的連接反應。2.3cd8a-hcd19scfv-cd8ahm–cd8atm-41bbl-cd3ζ基因序列的連接1)序列比對從genbank(ncbi)數據庫中搜索到人cd8a信號肽基因、人cd8a鉸鏈區和跨膜區基因、人cd137(4-1bbl)胞內區基因、以及人cd3ζ胞內區基因序列。將pcr擴增的片段測序結果與數據庫序列進行blast比對，兩者核苷酸序列完全一致。2)重疊延伸pcr技術擴增cd8a信號肽-hcd19scfv擴增體系中加入cd8a信號肽上游引物和hcd19scfv的下游引物，以以cd8a信號肽和hcd19scfvpcr純化片段為模板，擴增體系和擴增程序參照步驟2.2。將pcr擴增產物純化并送往公司測序獲得cd8a信號肽-hcd19scfv。3)重疊延伸pcr技術擴增cd8ahm–cd8atm-41bbl-cd3ζ：擴增方法參照步驟2.2。4)重疊延伸pcr技術擴增cd8a信號肽-hcd19scfv-cd8ahm–cd8atm-41bbl-cd3ζ向擴增體系中加入cd8a信號肽上游引物和cd3ζ下游引物，以cd8a信號肽-hcd19scfv和cd8ahm–cd8atm-41bbl-cd3ζpcr純化片段為模板，擴增方法參照步驟2.2，最終得到car19嵌合抗原受體。2.4嵌合抗原car19重組載體的構建在cd8a信號肽上游引物頭端依次加入ecori酶切位點(gaattc)、kozak序列(gccacc)；在cd3ζ末端加入bamhi限制性酶切位點(ggatcc)。分別用限制性內切酶ecori和bamhi雙酶切空載plvx-ires-neo和cd8a信號肽-hcd19scfv-cd8ahm–cd8atm-41bbl-cd3ζpcr擴增片段，使用膠回收試劑盒純化酶切片段。再通過t4-dna連接酶作用，完成car19重組載體的構建。靶向cd19的嵌合抗原受體的連接順序及基因結構示意圖見附圖3。實施例3:重組質粒的提取與測序1)轉化：分別高壓lb液體培養基、lb固體培養基、三蒸水和50％甘油，超凈臺中制備無抗性lb平板和amp抗性的lb平板。轉化空載質粒和重組質粒。2)第2日觀察平板上單克隆菌落生長情況，若生長良好表明轉化成功。挑取轉化的單克隆菌落，接種于5ml含有amp的lb液體培養基中。37℃下200rpm振蕩培養過夜。3)菌液培養14-16h后，停止搖菌。使用北京天根生物無內毒素質粒中提試劑盒抽提質粒；此后對抽提的質粒進行1％瓊脂糖電泳，觀察質粒抽提效果。完好的質粒電泳應呈現出三條帶。4)質粒酶切：限制性內切酶ecori和bamhi雙酶切重組質粒2h，將酶切混合液進行1％瓊脂糖電泳，觀察質粒酶切結果；電泳鑒定結果見附圖2。由電泳圖可判定質粒雙酶切后形成兩條帶，兩條帶的片段大小與目的片段大小一致。5)質粒測序：將酶切成功的質粒送往上海生工生物工程股份有限公司進行測序，測序結果與目的片段的核苷酸序列完全一致，部分測序結果見附圖3。測序成功的質粒將用于包裝慢病毒。實施例4:慢病毒包裝、滴度測定及濃縮4.1293t細胞復蘇與傳代1)從液氮中取出細胞，立即置于37度水浴中，邊晃動邊觀察細胞溶解狀況。全部溶解后，對凍存管表面噴灑酒精，擦拭酒精后迅速移入超凈工作臺。2)將1ml凍存液移入15ml離心管中，其內已提前加入預熱的1ml培養基,兩者輕輕混勻；再向管中加入8ml的預熱培養基，混勻后100g,離心5min。3)棄上清，加入7ml完全培養基，混勻吹打成單細胞狀態，之后將其移入tc處理的25cm2培養瓶中。4)第2日，鏡下觀察復蘇后的細胞狀態，并棄去原液，更換為新的完全培養基。4.2.293t細胞傳代與凍存1)傳代：細胞融合度至80％-90％時，0.25％的胰酶37度下消化細胞1min。棄胰酶，加入4ml培養基終止消化，再加入6ml預熱的pbs充分吹打細胞；此后將細胞液移入15ml離心管中，100g，離心5min。2)棄上清，加入完全培養基混勻后，計數并分瓶。3)再次傳代后，離心棄上清，可加入細胞凍存液進行細胞凍存。剩余的細胞將用于包裝慢病毒。4.3慢病毒包裝、滴度測定及濃縮1)t100b包被培養板，常溫孵育2-4h。胰酶消化293t細胞，用無抗生素的完全培養基吹打細胞，并計數，六孔板中每孔加入2ml培養基，接種0.8x106個細胞。2)包裝病毒：第2日，待細胞密度達到80％-90％，細胞長出正常形態并狀態良好，可進行病毒包裝。將質粒和轉染試劑混合液加入六孔板中，37度培養6h后，更換為無抗生素的完全培養基。3)分別于換液后24h、48h和72h收集病毒液。4)病毒滴度測定：收集病毒液離心，棄沉淀，取上清進行滴度測定。質粒plvx-ires-neo(空載)和plvx-car19病毒濃縮液的滴度分別為8x106tu/ml和5x106tu/ml。5)病毒濃縮：取病毒液離心后所得上清進行濃縮，病毒濃縮倍數約為15倍。濃縮液等量分裝于-80度保存。濃縮液若3天之內使用，可暫放于4度保存。實施例5:慢病毒感染t細胞(1)pbmc分離：采集外周血50ml，加入淋巴分離液分離獲得單個核細胞(pbmc)，最終分離的pbmc全部加入t175cm2培養瓶，移入co2培養箱中。(2)2h后取出培養瓶，輕輕晃動，使沉降于底部的懸浮細胞浮起，培養瓶傾斜，移液器吸取細胞懸浮液轉入新的培養瓶中，少許培養基清洗培養瓶將懸浮細胞全部收集。(3)向新的培養瓶中加cd3/cd28磁珠，并加入il-2(100u/ml),混勻后移入培養箱中。(4)次日，調整細胞密度至0.5x106個/ml，加入病毒液(mol＝3)，polybrene終濃度8ug/ml，混勻后，2000rpm離心1h。離心后重懸混合液，移入培養袋中。每隔兩天進行補液，il-2維持濃度為100u/ml。(5)第5日去磁珠，定期補液并觀察細胞狀態。(6)第7日取病毒感染的細胞進行流式細胞儀檢測car分子表達情況、并對細胞進行內毒素、細菌和支原體的檢測。(7)第9日，取t淋巴細胞與raji細胞共培養，檢測car-t細胞對raji細胞的殺瘤效果。實施例6:修飾性t細胞表面car分子的表達效率檢測(1)取0.5-1x106個病毒感染72h的細胞，1000rpm，離心4min,去上清；再加入1mlpbs溶液，再次離心去上清。(2)加入100ulpbs溶液，輕柔懸浮細胞沉淀，加入2ul抗體goatf(ab')2anti-mouseigg(fab’)2(fitc),4度避光孵育30min。(3)1000rpm，離心5min,去上清；再加入1mlpbs溶液，再次離心去上清。(4)加入100ulpbs溶液，輕柔懸浮細胞。流式細胞儀上機檢測t細胞表面car分子的表達效率。實施例7:car-t細胞對raji細胞體外殺瘤檢測慢病毒感染一周后，取感染的t細胞與b淋巴細胞瘤細胞系raji體外共培養。24孔板中，每孔取0.5x106個t細胞，t細胞與b細胞瘤細胞系raji三種效靶比(e:t＝6：1；3:1；1:1)。每組均設實驗組和對照組，實驗組為cd19car-t細胞，對照組為空載體病毒感染的t細胞(control-t)。分別于共培養24h,36h和48h后收集細胞進行流式鑒定raji細胞比例的變化(cd19抗體鑒定)，從而判定t淋巴細胞的殺傷作用。car19的殺傷結果見附圖5。統計學分析所有數據均為表示。使用spss18.0(statisticalproductandservicesolutions)軟件，分析實驗結果。當p<0.05時，認為具有統計學意義。實驗結果統計分析表明，本發明中構建的嵌合抗原受體修飾的t細胞與raji細胞效靶比為6:1時，t細胞對后者的殺傷性最高。附圖5可見，當兩者效靶比為6:1，共培養24h、36h和48h后，raji細胞比率由14.3％分別下降至1.81％、0.60％和0.01％，該數據表明本發明構建的car19對raji的殺傷性依次為91.9％、94.0％和99.9％。由此可見，本發明構建的嵌合抗原受體對raji腫瘤細胞表現出顯著的殺傷效果。本發明構建了一個新的殺傷力顯著的car19的嵌合抗原受體，其氨基酸序列為seqidno:1；編碼上述嵌合抗原的核苷酸片段，其序列為seqidno:2。附圖說明中為其圖示及數據統計分析相關結果。本發明構建的嵌合抗原受體修飾的t細胞，可用于治療cd19陽性的b細胞惡性腫瘤。sequencelisting<110>青島麥迪賽斯醫療技術有限公司<120>一種靶向cd19的嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞<130><160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>490<212>prt<213>1<400>1metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu151015hisalaalaargprolysleuilegluglnvalglyaspserleuthr202530ileserleuglnsertrpglyphetyrmetphealavalalatyrleu354045thrgluleuglyproileglyalatyrthrtyrserthrargleuarg505560prolysalaserasngluileglnaspilesersertyrleuasngln65707580leulysproglyglnalaprohisthrserglyileglyargpheleu859095proglythraspthrtyrserglyserleualaargglnproserthr100105110procysarggluseraspphelysglncysserlysleuhistyrthr115120125glnglyglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglygly130135140serglnvalserlysglnlysserasnglualathrvalserleuthr145150155160tyrservalthrsertyrleuhisproserthrserargleuileval165170175ileargasplysleuileglytrpvalileglythrglyglutyrgln180185190serserleuglnlysvalglythrproserglyasplysasntrpgly195200205alaglyglnserthrleulysglnglytrpproglnthrleuvalval210215220tyrcysleuleuservalalavalserproserthrleuservalglu225230235240serthraspglyalavaltyrcysalatrpserlysprotyrsertyr245250255glyglygluserglytyrmettyrargvalaspthrthrthrproala260265270proargproprothrproalaprothrilealaserglnproleuser275280285leuargproglualacysargproalaalaglyglyalavalhisthr290295300argglyleuaspphealacysaspiletyriletrpalaproleuala305310315320glythrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyrcys325330335lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet340345350argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe355360365proglugluglugluglyglycysgluleuargvallyspheserarg370375380seralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyrasn385390395400gluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplysarg405410415argglyargaspproglumetglyglylysproargarglysasnpro420425430glngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmetalagluala435440445tyrsergluileglymetlysglygluargargargglylysglyhis450455460aspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyrasp465470475480alaleuhismetglnalaleuproproarg485490<210>2<211>1470<212>dna<213>2<400>2atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60ccgaagcttatcgagcaggtgggcgacagtctgactatcagcctgcagagctggggcttc120tacatgttcgccgtggcctatctgactgagctggggcccattggagcctacacttatagt180actcgactgcgacctaaagccagtaacgagattcaggacatcagtagctacctgaaccag240ctgaagcccggccaggcccctcatactagtggaactggccggttcctgcccgggactgac300acttatagtggcagtctggcccggcagcccagtactccctgccgggaaagtgacttcaaa360cagtgcagtaagctgcattatactcagggcggcgggggggggtccggcgggggggggagc420gggggggggggcagccaggtgagtaagcagaaaagcaacgaagccactgtgagtctgact480tacagtgtgactagctacctgcatcccagtactagccgactgatcgttattcgagacaag540ctgatcggctgggttattggaactggggagtaccagagtagcctgcagaaggtgggaact600cccagtggcgacaaaaactggggcgccgggcagagtactctgaagcagggatggccccag660actctggtggtttattgcctgctgagtgtggccgtgagtcccagtactctgagtgttgag720agtactgacggggccgtgtactgcgcctggagtaagccctacagttacgggggagagagt780ggctacatgtaccgagtcgacaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgccc840accatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggc900gcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggcc960gggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcaga1020aagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagag1080gaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtg1140aagttc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