用于檢測CYP2C19基因多態性的引物、探針及檢測試劑盒的制作方法

本發明涉及體外核酸檢測，尤其是涉及采用熒光定量pcr(fq-pcr)技術用于檢測cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態性的引物、探針及檢測試劑盒。
背景技術：
：cyp2c19是一種十分重要的藥物代謝酶，人cyp2c19基因位于10號染色體上，長約90.21kb，含9個外顯子和8個內含子。cyp2c19遺傳多態性可導致酶活性的個體差異，從而產生血藥濃度的個體差異。臨床上大約2％的藥物都由cyp2c19催化代謝，包括氯吡格雷、s-美芬妥英、奧美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等藥物的代謝。cyp2c19遺傳變異導致的個體差異，使人群出現超快代謝者(ultrarapidmetabolizer，um)、快代謝者(extensivemetabolizer，em)、中間代謝者(intermediatemetabolizer，im)和慢代謝者(poormetabolizer，pm)4種表型。cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)是中國人群中存在的2種導致cyp2c19酶缺陷的主要等位基因。cyp2c19*2導致剪接缺失，cyp2c19*3為終止密碼子突變。em個體只攜帶cyp2c19*1等位基因，im個體攜帶cyp2c19*2或cyp2c19*3雜合子基因型；pm個體包括cyp2c19*2/*2、cyp2c19*2/*3和cyp2c19*3/*3基因型。東方人群中75％～85％的pm由cyp2c19*2所致，約20％～25％的pm由cyp2c19*3所致。目前常用的基因分型方法大致可分為三類：一是基于凝膠電泳的技術，如pcr反應結合限制性酶切片段長度多態性分析(rflp)，多重pcr，等位基因特異性擴增等；二是基于熒光標記雜交反應的基因分型技術，包括寡核苷酸連接分析，焦磷酸法dna測序，直接雜合子測序以及等位基因特異性引物延伸等。以上二種方法都是在pcr擴增反應之后，再采取不同的方法檢測多態性位點。三是基因芯片技術，基因芯片是通過微加工技術，將數以萬計、乃至百萬計的特定序列的dna片段(基因探針)，有規律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構成的一個二維dna探針陣列，利用這類芯片與標記的生物樣品進行雜交，可對樣品的基因表達譜生物信息進行快速定性和定量分析。基因芯片技術由于高通量等優點在snp檢測中得到大量應用，但也存在檢測時條件難以控制、重復性差，準確性低，易出現假陽性、假陰性結果、靈敏度較低等缺點。此外，還有磁珠/pcr熒光探針法、怛溫擴增法、pcr溶解曲線法、pcr+導流雜交法等方法。上述各種方法都具有各自的優缺點及適用性。技術實現要素：本發明的第一目的在于提供一種用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態性檢測的引物。本發明的第二目的在于提供一種用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態性檢測的探針。本發明的第三目的在于提供一種用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態性檢測的檢測試劑盒。所述用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態性檢測的引物如下：cyp2c19*2(rs4244285)-f:5’-ccagagcttggcatattgtatct-3’cyp2c19*2(rs4244285)-r:5’-tgtccatcgattcttggtgttct-3’cyp2c19*3(rs4986893)-f:5’-tctgctccattattttccagaaacg-3’cyp2c19*3(rs4986893)-f:5’-cttcagggcttggtcaatatagaat-3’。所述用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態性檢測的特異識別探針序列及標記熒光染料如下：fam-5’-tgattatttcccgggaacccataac-3’bhq1hex-5’-tgattatttcccaggaacccataactt-3’-bhq1rox-5’-caccccctggatccaggta-3’bhq2cy5-5’-caccccctgaatccaggtaag’-bhq2。根據cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遺傳多態基因序列設計標記的不同熒光染料的特異識別探針對，探針可以針對cyp2c19基因多態性位點特異識別，可通過對熒光信號的檢測判斷樣本的基因型。所述用于基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態檢測試劑盒，采用四種不同熒光基團標記的探針在同一反應管內同時指示四個目標片段(snp位點上rs4244285的g型基因和a型基因、rs4986893的g型基因和a型基因)的存在情況，且在反應條件下無交叉反應，特異性好。所述用于基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多態檢測試劑盒包括反應體系(pcrmix)：10mmol/ltris-hclph8.0，50mmol/lkcl，(1.5～3.0)mmol/lmgcl2，2.0mmol/ldntp溶液，0.001mmol/ledta，0.01mmol/lddt，0.005％tween20，1utaqhs，0.5uung酶，1μmol/l引物及標記探針；陰性對照：滅菌超純水。本發明采用熒光定量pcr(fq-pcr)技術檢測cyp2c19基因rs4244285和rs4986893多態性。fq-pcr的工作原理是利用taq酶的5’→3’外切酶活性，在pcr反應系統中加入一個熒光標記的探針。該探針可與引物包含序列內的dna模板發生特異性雜交，探針的5’端標以熒光報告基團，靠近3’端標以熒光淬滅基團，兩者之間構成能量傳遞結構。當探針保持完整時，5’端熒光報告基團所激發出的熒光信號被3’端淬滅基因吸收或抑制，不出現熒光信號變化。當pcr反應體系中有目的基因存在，就會擴增出特異核酸片段，熒光探針即會根據堿基配對的原理與之雜交。當pcr進入延伸(復制)期，tap酶從引物3’端開始,隨新鏈延伸沿dna模板移動，當移動到探針結合的位置時，其5’→3’端外切酶活性作用，將探針切斷(切口平移效應)。熒光報告基團和淬滅基團間的能量傳遞結構被破壞，淬滅基團的淬滅作用被解除，熒光報告基團的熒光信號釋放出來。pcr反應每復制一個特異核酸片段，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。不同的等位基因探針由于標記的熒光染料不同，因此所發熒光信號不同，可通過對熒光信號的檢測判斷樣本的基因型。本發明采用fq-pcr技術進行檢測，利用不同熒光基團標記的探針實現單管封閉同時檢測樣品中cyp2c19基因rs4244285和rs4986893同時存在的四種基因型，克服
背景技術：
中的各種缺陷，具有檢測結果直觀、快速、準確、高通量、低成本、無污染等優點。附圖說明圖1為采用純水為陰性對照時，fam(465-510nm)檢測頻道無擴增曲線。圖2為采用純水為陰性對照時，hex(533-580nm)檢測頻道無擴增曲線。圖3為采用純水為陰性對照時，rox(533-610nm)檢測頻道無擴增曲線。圖4為采用純水為陰性對照時，cy5(618-660nm)檢測頻道無擴增曲線。圖5為采用rs4244285的g型基因的陽性質粒作對照，fam檢測頻道有一條擴增曲線。圖6為采用rs4244285的g型基因的陽性質粒作對照，hex檢測通道無擴增曲線。圖7為采用rs4244285的a型基因的陽性質粒作對照，hex檢測頻道有一條擴增曲線。圖8為采用rs4244285的a型基因的陽性質粒作對照，fam檢測通道無擴增曲線。圖9為采用rs4986893的g型基因的陽性質粒作對照，rox檢測頻道有一條擴增曲線。圖10為采用rs4986893的g型基因的陽性質粒作對照，cy5檢測通道無擴增曲線。圖11為采用rs4986893的a型基因的陽性質粒作對照，cy5檢測頻道有一條擴增曲線。圖12為采用rs4986893的a型基因的陽性質粒作對照，rox檢測通道無擴增曲線。圖13為同一反應管內加入cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遺傳多態性的四種基因片段的陽性質粒為模板，fam檢測頻道有擴增曲線。圖14為同一反應管內加入cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遺傳多態性的四種基因片段的陽性質粒為模板，hex檢測頻道有擴增曲線。圖15為同一反應管內加入cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遺傳多態性的四種基因片段的陽性質粒為模板，rox檢測頻道有擴增曲線。圖16為同一反應管內加入cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遺傳多態性的四種基因片段的陽性質粒為模板，cy5檢測頻道有擴增曲線。具體實施方式以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。一、材料1、儀器：實時熒光pcr儀、移液器、離心機。2、引物、探針設計：本發明同時設計了兩對高效特異引物用于目標基因的檢測，同時設計了兩對探針檢測相應的cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遺傳多態位點。引物、探針系列如下：引物：cyp2c19*2(rs4244285)-f:5’-ccagagcttggcatattgtatct-3’cyp2c19*2(rs4244285)-r:5’-tgtccatcgattcttggtgttct-3’cyp2c19*3(rs4986893)-f:5’-tctgctccattattttccagaaacg-3’cyp2c19*3(rs4986893)-f:5’-cttcagggcttggtcaatatagaat-3’。探針：fam-5’-gatgaaatcggctcccgc-3’bhq1hex-5’-gatgaaatcgactcccgcag-3’-bhq1rox-5’-agacactttcttcactggtcag-3’bhq2cy5-5’-agacacttgcttcactggtc-3’-bhq2。3、試劑10mmol/ltris-hclph8.0，50mmol/lkcl，2.5mmol/lmgcl2,2.0mmol/ldntp溶液，0.001mmol/ledta，0.01mmol/lddt，0.005％tween20，1utaqhs，0.5uung酶。二、方法1、樣本選擇醫院體檢人群樣本78例。2、基因組dna提取用常規分子生物學方法或市售試劑合從抗凝全血中提取人基因組。3、實時熒光pcr擴增與檢測實時熒光pcr反應體系：10mmol/ltris-hclph8.0，50mmol/lkcl，2.5mmol/lmgcl2,2.0mmol/ldntp溶液，0.001mmol/ledta，0.01mmol/lddt，0.005％tween20，1utaqhs，0.5uung酶，1μmol/l引物及熒光探針，30ng人基因組dna。實時熒光pcr反應在rochelightcycler480ⅱ儀器上按以下條件進行擴增檢測：第一階段：95℃2min。第二階段：95℃20sec，62℃20sec(熒光采集)，72℃20sec(40cycles)四個熒光檢測頻道分別為fam、hex、rox、cy5。三、結果分析陰性對照：以純水作模板的反應管內應無任何擴增曲線產生。陽性對照：陽性對照品為分別克隆到載體puc57上的四個dna片段(每個載體中dna片段分別含snp位點上rs4244285的g型基因、rs4244285的a型基因、rs4986893的g型基因、rs4986893的a型基因)，同一反應管內加入四種陽性質粒為模板，fam、hex、rox、cy5檢測頻道均應有擴增曲線產生。結果判定：樣本反應管中若fam檢測頻道有擴增曲線產生則判定存在snp位點上rs4244285g型基因，hex檢測頻道有擴增曲線產生則存在rs4244285a型基因，若fam、hex檢測頻道同時有擴增曲線產生則rs4244285為雜合型。若rox檢測頻道有擴增曲線產生則判定存在rs4986893g型基因，若cy5檢測頻道有擴增曲線產生則判定存在rs4244285a型基因，若rox、cy5檢測頻道同時有擴增曲線產生則rs4986893為雜合型。為驗證本發明的準確性，進行了78份基因組樣本的驗證實驗，與測序結果對比，符合率達100％。結果如下表：結果(基因型)本發明檢測結果(例)測序結果(例)符合率(％)rs4244285(g/g)4343100rs4244285(g/a)3030100rs4244285(a/a)55100rs4986893(g/g)7070100rs4986893(g/a)88100采用純水為陰性對照時，fam(465-510nm)檢測頻道無擴增曲線如圖1所示產生，采用純水為陰性對照時，hex(533-580nm)檢測頻道無擴增曲線如圖2所示產生，采用純水為陰性對照時，rox(533-610nm)檢測頻道無擴增曲線如圖3所示產生，采用純水為陰性對照時，cy5(618-660nm)檢測頻道無擴增曲線如圖4所示產生，采用rs4244285的g型基因的陽性質粒作對照，fam檢測頻道有一條擴增曲線如圖5所示產生。圖5和圖6的結果表明，在實驗條件下含熒光基團fam的探針只對rs4244285的g型基因的目標片段有特異結合，熒光基團hex的探針不結合基因snp位點為g的目標片段，兩種探針不存在交叉反應。圖7和圖8的結果表明，在實驗條件下含熒光基團hex的探針只對rs4244285的a型基因的目標片段有特異結合，熒光基團fam的探針不結合snp位點為a的目標片段，兩種探針不存在交叉反應。圖9和圖10的結果表明，在實驗條件下含熒光基團rox的探針只對rs4986893的g型基因的目標片段有特異結合，熒光基團cy5的探針不結合snp位點為g的目標片段，兩種探針不存在交叉反應。圖11和圖12的結果表明，在實驗條件下含熒光基團hex的探針只對rs4986893的a型基因的目標片段有特異結合，熒光基團rox的探針不結合snp位點為a的目標片段，兩種探針不存在交叉反應。圖13～16的結果表明，同一反應管同時存在四種基因型，反應體系不影響試劑合的靈敏性、特異性。序列表<110>莊江興，廈門市同普生物科技有限公司<120>用于檢測cyp2c19基因多態性的引物、探針及檢測試劑盒<130>2017<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1ccagagcttggcatattgtatct23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2tgtccatcgattcttggtgttct23<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<400>3tctgctccattattttccagaaacg25<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列<400>4cttcagggcttggtcaatatagaat25<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5gatgaaatcggctcccgc18<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6gatgaaatcgactcccgcag20<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7agacactttcttcactggtcag22<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8agacacttgcttcactggtc20當前第1頁12