本發明屬于微生物學檢測方面的質量控制領域，特別涉及一種乳粉中大腸菌群標準樣品及其制備方法。
背景技術：
乳粉微生物學檢驗領域非常特殊。目前，國內外尚未有機構制備乳粉微生物學標準樣品和大規模生產的先例，仍屬空白領域。目前雖有一些機構制備食品中微生物標準樣品，但其均勻性和穩定性幾乎不能滿足要求，運輸極為困難；或標準樣品為僅含有目標菌的純菌株，與實際樣品差距較大，不能滿足日常實驗室質量控制等需要。
大腸菌群并非細菌學分類命名，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化特征及血清學方面并非完全一致，其定義為：在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧或兼性厭氧菌的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。主要包括大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌和產氣腸桿菌等。如果制備的大腸菌群樣品中，目標菌群易發生變化(繁殖和死亡等)，就會導致樣品的保存期短，樣品的均勻性和穩定性差。因此，綜合考慮細菌的生化特性，選取性質相對穩定的菌作為目標菌群對保證樣品的均勻性和穩定性十分重要。大腸菌群樣品制備的工藝技術要求比較高，并且樣品的均勻性和穩定性與凍干的菌種、凍干的工藝條件、凍干保護劑的使用、再水化的介質等均有密切的關系。
乳粉中大腸菌群指標，直接反映著乳粉的衛生質量與潛在致病風險。如果大腸菌群數超過一定限量，就加大了致病性大腸埃希氏菌的存在風險，并最終導致食源性疾病發生。因此，制備均勻性與穩定性俱佳的大腸菌群樣品，可以避免大腸菌群檢驗的隨意性和不確定性，真實地反映檢測實驗室的能力。這對提高實驗室質量控制水平，保障乳粉安全，甚至于打破國際貿易壁壘、提高我國乳粉國際競爭力都具有特殊重要的意義。
技術實現要素：
本發明的目的是克服大腸菌群測定樣品中總的活的細菌數目在運輸、儲存和測試等過程中菌落數都可發生變化的問題，提供一種乳粉中大腸菌群標準樣品，均勻性、穩定性符合能力驗證要求，本發明的另一個目的是提供該樣品的制備方法，工藝簡單，成功率高。
本發明為實現上述目的所采用的技術方案是：乳粉中大腸菌群標準樣品，其特征是：包括目標菌群和背景菌群，所述目標菌群由大腸埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、陰溝腸桿菌(enterobactercloacae)、產氣腸桿菌(enterobacteraerogenes)組成，所述背景菌群由金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)、馬紅球菌(rhodococcusequi)組成。
所述樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無菌水為基質，其中海藻糖體積分數為10％、脫脂奶粉體積分數為15％。
所述樣品中目標菌群的目標濃度為102～103cfu/ml，背景菌群的目標濃度為103cfu/ml。
一種乳粉中大腸菌群標準樣品的制備方法，其特征是：包括樣品添加菌株的選擇、凍干保護劑的配制、樣品凍干、樣品的均勻性和穩定性試驗四個步驟，其中樣品凍干過程為：菌株復蘇傳代—增菌—菌懸液配制—凍干和包裝—儲存，具體過程為：
(1)菌株復蘇傳代
將標準菌株接種到營養瓊脂斜面培養基中，在36±1℃下使其復蘇和生長，并對復蘇的菌株進行鑒定；
(2)增菌
目標菌群培養至對數生長期末，背景菌群培養至穩定期，從斜面刮取菌落，加到10ml的凍干保護劑中制成相應單一菌種的菌液；
(3)菌懸液配制
將上一過程得到的菌液與凍干保護劑混合，按目標菌群的目標濃度102～103cfu/ml和背景菌群的目標濃度103cfu/ml配制菌懸液，分別配制4個目標菌的菌懸液和3個背景菌的菌懸液，分別按1:1體積比混合形成目標菌群懸液和背景菌群懸液，再將目標菌群懸液與背景菌群懸液按1:1體積比混合，得到混合菌懸液，置于磁力攪拌器上不斷攪拌下分裝到樣品瓶中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要蓋實；
(4)凍干和包裝
將裝有混合菌懸液的樣品瓶開蓋放入凍干機中，冷凍干燥40～50h，當樣品冷凍干燥結束后，直接進行箱內加塞，關閉機器，樣品瓶中樣品為真空狀態；
(5)儲存
將樣品放置在4℃條件下避光保存，從全部樣品中隨機挑選樣品發放給參試實驗室或進行均勻性和穩定性試驗。
所述凍干保護劑為含有海藻糖和脫脂奶粉的無菌水，其中體積分數分別為：海藻糖10％、脫脂奶粉15％。
所述樣品的均勻性和穩定性試驗按照cnas—gl03《標準樣品均勻性和穩定性評價指南》進行。
本發明菌種的選擇采用大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌作為大腸菌群樣品的目標菌群，以金黃色葡萄球菌、馬紅球菌、蠟樣芽孢桿菌作為背景菌群。眾所周知，大腸菌群是一類在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧或兼性厭氧菌的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群中的大腸埃希氏菌比較常見，但非常容易受到環境因素(特別是溫度)的影響。相比而言，以大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌作為目標菌群，可以最大程度保證測試樣品的穩定性，即使在運輸及儲存中大腸埃希氏菌的含量發生變化，在統計學意義上也不會影響大腸菌群的總量。
本發明的大腸菌群標準樣品具有以下優勢特性：活的微生物、數量不發生變化、生化特征不發生變異，從滿足特殊運輸的條件著手，通過特殊工藝的研究、穩定性和均勻性的研究等形成一套完善的標準樣品制備技術，適合于乳粉中大腸菌群標準樣品的制備。
附圖說明
圖1為本發明工藝流程圖。
具體實施方式
下面結合附圖及具體實施例對本發明作進一步詳細描述，但本發明并不局限于具體實施例。
實施例1
乳粉中大腸菌群標準樣品，包括目標菌群和背景菌群，所述目標菌群由大腸埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、陰溝腸桿菌(enterobactercloacae)、產氣腸桿菌(enterobacteraerogenes)組成，所述背景菌群由金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)、馬紅球菌(rhodococcusequi)組成。
所述樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無菌水為基質，其中海藻糖體積分數為10％、脫脂奶粉體積分數為15％。
所述樣品中目標菌群的目標濃度為102～103cfu/ml，背景菌群的目標濃度為103cfu/ml。
實施例2
如圖1所示，一種實施例1中乳粉中大腸菌群標準樣品的制備方法，包括樣品添加菌株的選擇、凍干保護劑的配制、樣品凍干、樣品的均勻性和穩定性試驗四個步驟，具體步驟如下：
1、樣品添加菌株的選擇
按照主導菌群：大腸埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、陰溝腸桿菌(enterobactercloacae)、產氣腸桿菌(enterobacteraerogenes)，背景菌群：金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)、馬紅球菌(rhodococcusequi)選擇標準菌株，所有標準菌株均購于政府指定的機構，并附有菌株證書，保證了菌株的溯源性。
2、凍干保護劑的配制
樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無菌水為基質(體積分數：海藻糖10％，脫脂奶粉15％)配制凍干保護劑。
3、樣品凍干
(1)菌株復蘇傳代
將標準菌株接種到營養瓊脂斜面培養基中，在36±1℃下使其復蘇和生長，并對復蘇的菌株進行鑒定；
(2)增菌
目標菌群培養至對數生長期末，背景菌群培養至穩定期，從斜面刮取菌落，加到10ml的凍干保護劑中制成相應單一菌種的菌液；
(3)菌懸液配制
將上一過程得到的菌液與凍干保護劑混合，按目標菌群的目標濃度102～103cfu/ml和背景菌群的目標濃度103cfu/ml配制菌懸液。為保證得到的最終樣品中含有以上目標濃度的菌株，本實施例中按照目標菌103cfu/ml分別配制4個目標菌的菌懸液，按1:1體積比混合，形成目標菌群懸液；背景菌按104cfu/ml配制3個背景菌的菌懸液，按1:1體積比混合，形成背景菌群懸液；背景菌群懸液與目標菌群懸液按1:1體積比混合，得到混合菌懸液，采用比濁法檢查菌株含量；置于磁力攪拌器上不斷攪拌下取1.0ml分裝到樣品瓶(西林瓶)中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要蓋實；
(4)凍干和包裝
將裝有混合菌懸液的樣品瓶開蓋放入凍干機中，冷凍干燥機參數按如下設置：
冷凍速度(coolingrate)0.5℃/min
早期冷凍點(incipientfreezingpoint)-1℃15min
冷凍溫度(coolingtemperature)-40℃
共熔點(meltingpointeutectictemperature)-29℃
加熱溫度(heatingtemperature)20℃120min
啟動冷凍干燥機，機器直接進入程序化的冷凍干燥過程，整個凍干過程40h。
當樣品冷凍干燥結束后，直接進行箱內加塞；關閉機器。剔除塞子不緊的西林瓶，西林瓶中樣品為真空狀態；
(5)儲存
將樣品放置在-18℃條件下避光保存，并對保存的樣品進行適當管理和檢測，從全部樣品中隨機挑選樣品發放給實驗室或進行均勻性和穩定性試驗。
4、樣品的均勻性和穩定性試驗
對樣品中目標菌的均勻性和穩定性檢查是驗證樣品制備過程有效性的主要方法。檢查樣品均勻性和穩定性按照gb/t15000.3-2008《標準樣品工作導則(3)標準樣品定值的一般原則和統計方法》進行。所得樣品均勻性和穩定性檢測方法及結果如下：
分別隨機選取12個樣品，采用sn/t1896-2007大腸菌群測試方法，在重復條件測試2×12份樣品的大腸菌群。結果數據用方差分析法進行統計處理，統計步驟及結果如下：
表1方差分析公式
上表中，
表2樣品均勻性檢測結果
表3樣品均勻性試驗方差分析結果
結論：在95％置信概率下，與其他因素對測試結果的影響相比，樣品的不均勻性是可接受的。
采用兩種類型的穩定性試驗：一種是在貯存溫度(4℃)下的穩定性試驗，另一種是在高的溫度(模擬樣品的運輸條件)下的穩定性試驗，選用三個溫度點，分別為20℃、36℃和45℃。定期檢測樣品，針對不同溫度點不同的保存時間測試3個樣本，將2×3份樣品結果的均值(對數轉化后)用方差分析法進行統計處理，f值<f臨界值，則說明標準樣品的穩定性符合要求，同時確定在不同溫度條件下符合標準樣品要求的最長保存時間。穩定性試驗結果見表4和表5。
表4樣品短期穩定性檢測結果
表5樣品短期穩定性試驗方差分析結果
實施例3
本實施例中所述的乳粉中大腸菌群標準樣品的制備方法的各步驟均與實施例2中相同，不同的技術參數為：菌懸液配制中，目標菌群懸液中各目標菌的濃度按照5×103cfu/ml配制，背景菌群懸液中各背景菌的濃度按照103cfu/ml配制；凍干過程45h。
實施例4
本實施例中所述的乳粉中大腸菌群標準樣品的制備方法的各步驟均與實施例3中相同，不同的技術參數為：菌懸液配制中，目標菌群懸液中各目標菌的濃度按照4.5×103cfu/ml配制；凍干過程50h。