本發明涉及一種花生粕中黃曲霉毒素降解及同步制備高營養花生蛋白肽的方法，屬于花生食品安全與營養領域。
背景技術：
我國是花生生產大國，每年花生榨油后可得到約300萬噸的花生粕。花生粕中含有豐富的營養成分，如花生蛋白、黃酮類、糖類等。其中花生蛋白與應用較廣的大豆蛋白相比，具有含腸胃脹氣因子和抗營養因子較少的優點；與菜籽、棉籽蛋白相比，具有所含毒性物質較少的優點。但花生粕利用率低，主要作為飼料，價格低廉，現在約2600元/噸，遠低于大豆粕的價格（3200元/噸）。限制價格和廣泛應用的主要因素是其易感染黃曲菌產生黃曲霉毒素。
黃曲霉毒素具有強毒性和致癌性，嚴重危害人畜健康，僅0.294mg/kg劑量就能引起敏感動物的急性中毒死亡（rawal,etal.，2010；kensleretal.，2011）。黃曲霉毒素性質穩定，一般加工方法不能去除其毒性。多年來，科學家們致力于利用物理、化學、生物等多種方法來去除黃曲霉毒素。傳統的物理和化學的黃曲霉毒素去毒方法包括臭氧、氨化法、堿法、射線輻照法、吸附法和超濾-滲濾法等，這些方法都存在一些問題，如導致食品和飼料中的營養損失，影響感官品質，有些方法所需要的設備價格昂貴等等；其次有些方法的反應機制是可逆的，黃曲霉毒素的毒性會重新出現，這些都限制了傳統理化方法在實際生產中的應用。
生物法，是利用微生物及其分泌的酶等代謝產物降解黃曲霉毒素的方法，具有效率高、特異性強以及對食品、飼料和環境沒有污染的特點。國內外生物降解脫除黃曲霉毒素的研究主要集中在微生物菌株直接作用于黃曲霉毒素，以及把菌株產生的酶做成制劑作用于黃曲霉毒素。而對于復雜基質如花生粕中黃曲霉毒素的降解研究較少。
生物降解所涉及的菌種目前主要涉及國內的假蜜環菌、粘細菌、嗜麥芽窄食單胞菌以及國外研究的橙色黃桿菌和紅串紅球菌等，但存在著菌株在花生粕中不易生長繁殖、降解率低、有些菌株不能在食品生產中應用，有一定的安全隱患等問題。且都是研究單株菌對黃曲霉毒素的降解作用，未報道多菌聯合對黃曲霉毒素的降解作用。
同時花生粕中含有大量的蛋白和纖維，對花生粕中蛋白肽的制備報到較多，但對于蛋白中的黃曲霉毒素未見有去除的報到，導致制備的蛋白肽中存在黃曲霉毒素，影響消費者的健康。目前未見有在制備蛋白肽的同時去除黃曲霉毒素的報到。
對于酶法制備花生蛋白肽的報到較多，專利201310167006.3公開了一種雙中性蛋白酶分布酶解花生分離蛋白制備花生肽的方法，該專利制備花生肽的方法為分離蛋白溶解、酶解、離心、噴霧干燥制得花生蛋白肽。該專利在制備蛋白肽時，加入了大量的水進行酶解，酶解后進行噴霧干燥，這一方法在生產過程中無疑增加了能耗成本，增加了產品的生產成本。
技術實現要素：
為了高效、低能利用花生粕中的蛋白質、安全降解花生粕中的黃曲霉毒素，提高花生粕的營養和利用價值，消除黃曲霉毒素對花生粕利用的危害，本發明提供了一種花生粕中黃曲霉毒素降解及同步制備高營養花生蛋白肽的方法，利用云芝、枯草芽孢桿菌、黑曲霉三種菌種的聯合固體發酵花生粕產生黃曲霉毒素降解酶、蛋白水解酶以及纖維素酶等，在發酵產酶的過程中通過定時向培養基中添加蒸餾水，保證微生物發酵產生的生物酶能在固體發酵的狀態下降解花生粕中黃曲霉毒素，同時對花生粕中的蛋白和纖維進行酶解，在降解黃曲霉毒素的同時，制備高營養的花生蛋白肽。
為達到上述目的，本發明所采用的技術方案有如下步驟：
1、一種花生粕中黃曲霉毒素降解及同步制備高營養花生蛋白肽的方法，其特征包括以下步驟：
（1）原料處理：將花生粕粉碎，過40目篩；向花生粕粉中加入一定量的蒸餾水，滅菌；
（2）微生物分段接種發酵：向滅菌的花生粕中接種一定量活化后的云芝菌種，25-40℃固體發酵5-8d，再向發酵的花生粕中接種活化過的枯草芽孢桿菌，30-35℃固體發酵3-5d，再向花生粕中接種活化過的黑曲霉，28-35℃固體發酵3-5d；在發酵過程中，每隔一天向發酵培養基中添加一定體積的蒸餾水；
（3）干燥、粉碎：發酵后的花生粕40-50干燥℃、超微粉碎，既得無毒、高營養的花生蛋白肽。
2、優選地，一種花生粕中黃曲霉毒素降解及同步制備高營養花生蛋白肽的方法，其特征在于，步驟（1）所述的花生粕粉和蒸餾水的添加比例(g:ml)為1:2-1:3。
3、優選地，一種花生粕中黃曲霉毒素降解及同步制備高營養花生蛋白肽的方法，其特征在于，步驟（2）所述的云芝的活化方法為：將6-8菌種塞（7mm直徑）的云芝菌株接種于10g直徑大約為5mm的花生根粉中，25-30℃活化培養5-7d，制得云芝活化菌種。
4、優選地，一種花生粕中黃曲霉毒素降解及同步制備高營養花生蛋白肽的方法，其特征在于，步驟（2）所述的云芝的接種量為：花生粕和活化菌種的質量比（g:g）為20:1-20:2。
5、優選地，一種花生粕中黃曲霉毒素降解及同步制備高營養花生蛋白肽的方法，其特征在于，步驟（2）所述的枯草芽孢桿菌的活化方法為：將枯草芽孢桿菌接種于花生粕水溶液中，25-30℃活化培養2-3d，制得枯草芽孢桿菌菌種液。
6、優選地，一種花生粕中黃曲霉毒素降解及同步制備高營養花生蛋白肽的方法，其特征在于，步驟（2）所述的枯草芽孢桿菌的接種量為：花生粕和活化菌種的質量體積比（g:ml）為20:1-20:2。
7、優選地，一種花生粕中黃曲霉毒素降解及同步制備高營養花生蛋白肽的方法，其特征在于，步驟（2）所述的黑曲霉的活化方法為：將2-3菌種環的黑曲霉菌株接種于10g直徑大約為5mm的花生根粉中，25-30℃活化培養3-5d，制得黒曲霉活化菌種。
8、優選地，一種花生粕中黃曲霉毒素降解及同步制備高營養花生蛋白肽的方法，其特征在于，步驟（2）所述的黑曲霉的接種量為：花生粕和活化菌種的質量比（g:g）為20:1-20:2。
9、優選地，一種花生粕中黃曲霉毒素降解及同步制備高營養花生蛋白肽的方法，其特征在于，步驟（2）所述的發酵過程中蒸餾水的添加量為：花生粕和蒸餾水的質量比為：1:1-2:3。
本發明的有益效果如下：
（1）節約成本
本發明創造性的采用在固體發酵的過程中添加蒸餾水，使發酵產生的生物酶能在固體發酵過程中進行酶解反應，省去了發酵后在添加大量的水進行酶解反應的過程，不用進行噴霧干燥，節約了大量能耗成本，減少了生產周期。
（2）全面降解黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2
本發明通過云芝、枯草芽孢桿菌和黑曲霉協同分段發酵花生粕可以高效降解黃曲霉毒素。云芝可以產生降解黃曲霉毒素的酶制劑，同時枯草芽孢桿菌和黑曲霉在含有黃曲霉毒素的花生粕中也可以誘導產生降解黃曲霉毒素的酶類，三種菌種協同發酵不僅可以高效降解黃曲霉毒素b1，還可以降解黃曲霉毒素b2以及黃曲霉毒素g1和g2，起到了既能提高黃曲霉毒素b1的降解率，又能起到全面降解其他黃曲霉毒素等意想不到的作用。
（3）降解環匹阿尼酸
環匹阿尼酸(cyclopiazonicacid，cpa)是一種吲哚衍物(indole-derivedergotalkaloids)，是曲霉屬和青霉屬的幾種真菌次級代謝產生的一種真菌毒素，毒理學研究表明，它是一種神經毒素，會誘導神經系統紊亂。環匹阿尼酸和黃曲霉毒素往往共同存在。本發明通過云芝、枯草芽孢桿菌和黑曲霉協同分段發酵花生粕還可以產生不僅可以降解黃曲霉毒素，還可以降解環匹阿尼酸，確保了花生粕的安全。
（4）三種菌協同分段發酵有助于三種菌的生長繁殖。
花生粕作為唯一的營養來源對發酵菌株云芝、枯草芽孢桿菌和黑曲霉所提供的營養較少，云芝、枯草芽孢桿菌和黑曲霉在同一培養基上發酵，能夠分泌出彼此生長所需的營養物質，促進各種菌的生長，縮短了發酵時間。
（5）三種菌協同發酵后分段酶解有助于提高黃曲霉毒素的降解率和花生蛋白肽的得率。
三種菌可以產生不同品種的蛋白酶，有利于花生粕中蛋白質的全面酶解，不僅可以提高花生蛋白肽的得率，可以將黃曲霉毒素和花生蛋白分開，有利于黃曲霉毒素的溶出和降解，起到提高黃曲霉毒素的降解率的作用；同時三種菌產生的纖維素酶可以酶解花生粕中的纖維素，有利于花生蛋白和黃曲霉毒素的溶出，提高黃曲霉毒素的降解率和花生蛋白肽的得率。
（6）云芝在花生根培養基上活化后，活力提高。縮短了花生粕的發酵時間；同時花生根中含有多種活性物質，不僅起到了增加花生粕營養的作用，還起到了發酵過程中抑制雜菌生長的作用。
（7）枯草芽孢桿菌在花生粕水溶液中活化，可以誘導枯草芽孢桿菌產生能夠酶解花生粕蛋白（高變性）的酶類，起到提高花生蛋白肽得率的作用。
（8）制備的花生蛋白肽不含有有害物質，并且保留了花生的營養價值；同時三種菌的協同發酵還增加了花生蛋白肽更多的保健功能，如增強機體免疫力、抗衰老、增強學習記憶能力、促進核酸、蛋白質的合成、保肝、解毒以及治療高血壓和高血脂癥、保護心血管等功效。
（9）花生蛋白肽產品具有較好的抗氧化活性，如清除dpph自由基、清除羥自由基、清除超氧陰離子自由基、鐵還原力、鉬還原力、鐵離子螯合力、銅離子螯合力、抑制亞油酸過氧化能力、抗脂質體過氧化能力等。因此，它可以作為一種功能食品用于延緩機體衰老，預防“三高”疾病的發生，同時，也可以作為一種天然抗氧化劑用在食品工業中，防止食品因脂肪氧化而變質，提高食品貨架期內的品質穩定性。此外，花生抗氧化肽產品還具有較好的功能性質，如乳化性、乳化穩定性、起泡性、泡沫穩定性、溶解性、吸水性、吸油性等。在食品加工過程中，它能賦予食品特有的加工特性，使終產品具有特殊的功能性質。
（10）一種花生粕中黃曲霉毒素降解及同步制備高營養花生蛋白肽的方法采用三種菌協同發酵，分段酶解，在降解黃曲霉毒素的同時，制備花生蛋白肽，減少操作流程、縮短了工藝時間，節約成本，操作方法簡單，易于工業化生產。
具體實施方式
實施例1
花生粕原料中黃曲霉毒素總量為92μg/kg，環匹阿尼酸含量為52μg/kg。10g花生粕加入20ml的水，滅菌，接種經花生根發酵活化云芝菌種1g，25℃固體發酵8d，再向發酵的花生粕中接種花生粕水溶液活化過的枯草芽孢桿菌菌種1ml，30℃固體發酵3d，再向花生粕中接種花生根活化過的黑曲霉1g，35℃固體發酵3d；發酵后的培養基加入30ml的蒸餾水，33℃震蕩酶解2h后，25℃震蕩酶解8h；酶解液100℃滅酶處理15min，冷卻至室溫后用高速離心機10000rpm離心10min；將離心得到的上清液進行噴霧干燥，入料溫度為50℃，進風溫度為180℃，進風量為22h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率為85.21%，花生蛋白肽中黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2和環匹阿尼酸未檢出。該抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除dpph自由基的ic50值為9.33mg/ml，清除羥自由基的ic50值為4.09mg/ml，清除超氧陰離子自由基的ic50值為5.98mg/ml，鐵還原力的吸光值為0.5時所需花生抗氧化肽的濃度為6.37mg/ml，鉬還原力的吸光值為0.5時所需花生抗氧化肽的濃度為5.11mg/ml，鐵離子螯合力的ic50值為5.47mg/ml，銅離子螯合力的ic50值為3.58mg/ml，抑制亞油酸過氧化能力的ic50值為4.34mg/ml抑制脂質過氧化能力的ic50值為4.95mg/ml。
對照實驗：花生粕原料中黃曲霉毒素總量為92μg/kg，環匹阿尼酸含量為52μg/kg。10g花生粕加入20ml的水，滅菌，接種經花生根發酵活化云芝菌種1g，25℃固體發酵8d，30℃固體發酵3d，35℃固體發酵3d；發酵后的培養基加入30ml的蒸餾水，33℃震蕩酶解2h后，25℃震蕩酶解8h；酶解液100℃滅酶處理15min，冷卻至室溫后用高速離心機10000rpm離心10min；將離心得到的上清液進行噴霧干燥，入料溫度為50℃，進風溫度為180℃，進風量為22h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率為5.21%，花生蛋白肽中黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2為51μg/kg和環匹阿尼酸含量為42μg/kg。該抗氧化肽無抗氧化活性。
實施例2
花生粕原料中黃曲霉毒素總量為92μg/kg，環匹阿尼酸含量為52μg/kg。10g花生粕加入20ml的水，滅菌，接種經花生根發酵活化云芝菌種0.7g，28℃固體發酵6d，再向發酵的花生粕中接種花生粕水溶液活化過的枯草芽孢桿菌菌種0.7ml，32℃固體發酵4d，再向花生粕中接種花生根活化過的黑曲霉0.7g，32℃固體發酵4d；發酵后的培養基加入40ml的蒸餾水，34℃震蕩酶解1.5h后，23℃震蕩酶解10h；酶解液100℃滅酶處理15min，冷卻至室溫后用高速離心機10000rpm離心10min；將離心得到的上清液進行噴霧干燥，入料溫度為50℃，進風溫度為180℃，進風量為22h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率為89.43%，花生蛋白肽中黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2和環匹阿尼酸未檢出。該抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除dpph自由基的ic50值為8.63mg/ml，清除羥自由基的ic50值為3.59mg/ml，清除超氧陰離子自由基的ic50值為5.08mg/ml，鐵還原力的吸光值為0.5時所需花生抗氧化肽的濃度為6.07mg/ml，鉬還原力的吸光值為0.5時所需花生抗氧化肽的濃度為4.81mg/ml，鐵離子螯合力的ic50值為4.97mg/ml，銅離子螯合力的ic50值為3.08mg/ml，抑制亞油酸過氧化能力的ic50值為4.04mg/ml抑制脂質過氧化能力的ic50值為4.05mg/ml。
對照實驗：花生粕原料中黃曲霉毒素總量為92μg/kg，環匹阿尼酸含量為52μg/kg。10g花生粕加入20ml的水，滅菌，向花生粕中接種花生粕水溶液活化過的枯草芽孢桿菌菌種0.7ml，32℃固體發酵4d，再向花生粕中接種花生根活化過的黑曲霉0.7g，32℃固體發酵4d；發酵后的培養基加入40ml的蒸餾水，34℃震蕩酶解1.5h后，23℃震蕩酶解10h；酶解液100℃滅酶處理15min，冷卻至室溫后用高速離心機10000rpm離心10min；將離心得到的上清液進行噴霧干燥，入料溫度為50℃，進風溫度為180℃，進風量為22h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率為60.21%，花生蛋白肽中黃曲霉毒素總量為98μg/kg和環匹阿尼酸62μg/kg。該抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除dpph自由基的ic50值為11.23mg/ml，清除羥自由基的ic50值為6.59mg/ml，清除超氧陰離子自由基的ic50值為5.98mg/ml，鐵還原力的吸光值為0.5時所需花生抗氧化肽的濃度為6.97mg/ml，鉬還原力的吸光值為0.5時所需花生抗氧化肽的濃度為5.91mg/ml，鐵離子螯合力的ic50值為5.97mg/ml，銅離子螯合力的ic50值為4.18mg/ml，抑制亞油酸過氧化能力的ic50值為4.94mg/ml抑制脂質過氧化能力的ic50值為5.75mg/ml。
實施例3
花生粕原料中黃曲霉毒素總量為92μg/kg，環匹阿尼酸含量為52μg/kg。10g花生粕加入25ml的水，滅菌，接種經花生根發酵活化云芝菌種0.7g，28℃固體發酵6d，再向發酵的花生粕中接種花生粕水溶液活化過的枯草芽孢桿菌菌種0.7ml，32℃固體發酵4d，再向花生粕中接種花生根活化過的黑曲霉0.7g，32℃固體發酵4d；發酵后的培養基加入40ml的蒸餾水，35℃震蕩酶解1h后，22℃震蕩酶解12h；酶解液100℃滅酶處理15min，冷卻至室溫后用高速離心機10000rpm離心10min；將離心得到的上清液進行噴霧干燥，入料溫度為50℃，進風溫度為180℃，進風量為22h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率為88.93%，花生蛋白肽中黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2和環匹阿尼酸未檢出。該抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除dpph自由基的ic50值為8.43mg/ml，清除羥自由基的ic50值為3.39mg/ml，清除超氧陰離子自由基的ic50值為4.95mg/ml，鐵還原力的吸光值為0.5時所需花生抗氧化肽的濃度為5.85mg/ml，鉬還原力的吸光值為0.5時所需花生抗氧化肽的濃度為4.61mg/ml，鐵離子螯合力的ic50值為4.57mg/ml，銅離子螯合力的ic50值為2.98mg/ml，抑制亞油酸過氧化能力的ic50值為3.94mg/ml抑制脂質過氧化能力的ic50值為3.85mg/ml。
對照實驗：花生粕原料中黃曲霉毒素總量為92μg/kg，環匹阿尼酸含量為52μg/kg。10g花生粕加入25ml的水，滅菌，向花生粕中接種花生粕水溶液活化過的枯草芽孢桿菌菌種0.7ml，32℃固體發酵4d，再向花生粕中接種花生根活化過的黑曲霉0.7g，32℃固體發酵4d；發酵后的培養基加入40ml的蒸餾水，22℃震蕩酶解13h；酶解液100℃滅酶處理15min，冷卻至室溫后用高速離心機10000rpm離心10min；將離心得到的上清液進行噴霧干燥，入料溫度為50℃，進風溫度為180℃，進風量為22h，干燥完成后得到花生蛋白肽。花生蛋白肽得率為72.53%，花生蛋白肽中黃曲霉毒素總量為23μg/kg和環匹阿尼酸19μg/kg。該抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除dpph自由基的ic50值為10.43mg/ml，清除羥自由基的ic50值為5.59mg/ml，清除超氧陰離子自由基的ic50值為5.85mg/ml，鐵還原力的吸光值為0.5時所需花生抗氧化肽的濃度為7.65mg/ml，鉬還原力的吸光值為0.5時所需花生抗氧化肽的濃度為5.81mg/ml，鐵離子螯合力的ic50值為5.87mg/ml，銅離子螯合力的ic50值為3.91mg/ml，抑制亞油酸過氧化能力的ic50值為4.84mg/ml抑制脂質過氧化能力的ic50值為4.95mg/ml。
以上所述，僅為本發明的具體實施方式，并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。